與綿羊雙肌臀性狀相關(guān)的snp標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種與綿羊雙肌臀性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用，其位于綿羊CLPG基因如SEQ?ID?NO.1所示序列的232bp處，此處堿基為T的綿羊具有雙肌臀性狀，此處堿基為C的綿羊無雙肌臀性狀。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和測序技術(shù)篩選到與綿羊雙肌臀性狀狀相關(guān)的SNP標(biāo)記，并通過限制片段多態(tài)性(RFLP)方法來檢測待測綿羊的基因型，根據(jù)基因型進(jìn)行雙肌臀性狀綿羊優(yōu)勢品種的選育，從而加快綿羊的育種進(jìn)程。
【專利說明】與綿羊雙肌臀性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種與綿羊雙肌臀性狀 相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 自20世紀(jì)80年代末以來，中國已成為世界上綿羊、山羊飼養(yǎng)量、出欄量、羊肉產(chǎn)量 最多的國家。隨著國民消費(fèi)理念的變化和對羊肉營養(yǎng)價值的認(rèn)識，羊肉的市場需求量日益 增加。然而，我國肉羊生產(chǎn)落后于世界先進(jìn)水平，肉羊育種技術(shù)集成創(chuàng)新力度不足，育種的 技術(shù)水平和效率低下，致使擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的優(yōu)質(zhì)肉羊品種匱乏，現(xiàn)有良種貢獻(xiàn)率低，市 場競爭力差。
[0003] Callipyge基因是近年來備受關(guān)注的動物"雙肌臀"性狀的候選基因，簡寫為 CLPG(Cockett N E,Jackson S P,Shay T L,etal. Chromosomal localizationof the callipyge gene in sheep (Ovisaries)using bovine DNA markers[A]. Proc Natl Acad. Sci USA[C], 1994,91:3019?3023·)。具有CLPG表型的綿羊最初于1983年發(fā)現(xiàn)于美國，此 種綿羊肌肉特別發(fā)達(dá)，背最長肌大且通常突出于棘突之上，以致在背中線形成一凹槽結(jié)構(gòu)， 后腿肌肉厚實(shí)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種與綿羊雙肌臀性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種與綿羊雙肌臀性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記，其位 于綿羊CLPG基因如SEQ ID NO. 1所示序列的232bp處，此處堿基為T的綿羊具有雙肌臀性 狀，此處堿基為C的綿羊無雙肌臀性狀。
[0006] 本發(fā)明還提供用于檢測所述與綿羊雙肌臀性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記的引物，包括正向
[0007] 本發(fā)明還提供所述與綿羊雙肌臀性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記在鑒定具有雙肌臀性狀的 優(yōu)勢綿羊品種中的應(yīng)用，其包括步驟：
[0008] 1)提取待測綿羊的基因組DNA ;
[0009] 2)以待測綿羊的基因組DNA為模板，利用所述引物F和R，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增出綿 羊CLPG基因493bp片段；
[0010] 3)檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如果擴(kuò)增產(chǎn)物序列中232bp處的堿基為T，則待測綿羊?qū)儆?具有雙肌臀性狀的優(yōu)勢綿羊品種。
[0011] 步驟2)中PCR反應(yīng)使用的擴(kuò)增體系以25μ1計(jì)為：40ng/yl模板DNA2yl， ΙΟμπιοΙ 引物 F 和 R各 lyl，2.5mmol dNTPs2yl，5U/yl TaqDNA聚合酶 0.5yl，10XPCR 反應(yīng)緩沖液2. 5 μ 1，余量為ddH20。
[0012] 步驟2)中PCR反應(yīng)使用的擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C 5分鐘；94°C 40秒，55°C 30秒，72°C 50 秒，33個循環(huán)；72 °C 10分鐘。
[0013] 步驟3)中檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用RFLP法，具體為：用內(nèi)切酶Hha I對PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物進(jìn)行酶切，并對酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果檢測結(jié)果為兩條帶（232bp和 261bp)，則待測綿羊?qū)儆谄胀ㄆ贩N，且基因型為純和CC型；檢測結(jié)果僅為一條帶（493bp)， 則待測綿羊?qū)儆诰哂袛y帶雙肌臀性狀基因的優(yōu)勢品種，且基因型為純和TT型；檢測結(jié)果為 三條帶（493bp、232bp和261bp)，則待測綿羊?qū)儆诰哂须p肌臀性狀的優(yōu)勢品種，且基因型為 雜合CT型。
[0014] 本發(fā)明還提供含有上述引物F和R的用于檢測綿羊雙肌臀性狀的試劑盒。
[0015] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液等中的一 種或多種。
[0016] 更優(yōu)選地，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。
[0017] 本發(fā)明進(jìn)一步提供所述與綿羊雙肌臀性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記在綿羊分子標(biāo)記輔助 育種中的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明提供了一種與綿羊雙肌臀性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用，既采用聚合酶鏈 式反應(yīng)（PCR)和測序技術(shù)篩選到與綿羊雙肌臀性狀狀相關(guān)的SNP標(biāo)記，并通過限制片段多 態(tài)性（RFLP)方法來檢測待測綿羊的基因型，根據(jù)基因型進(jìn)行雙肌臀性狀綿羊優(yōu)勢品種的 選育，從而加快綿羊的育種進(jìn)程。
[0019] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0020] (一）本發(fā)明提供的分子遺傳標(biāo)記不受綿羊的年齡、性別等限制，可用于綿羊的早 期選育，甚至在綿羊剛出生時就可準(zhǔn)確地進(jìn)行篩選，可大大加快綿羊的育種進(jìn)程；
[0021] (二）可快速準(zhǔn)確地對綿羊CLPG基因進(jìn)行SNP位點(diǎn)檢測，可以快速檢測每個綿羊 個體在SNP位點(diǎn)的遺傳變異情況，可快捷獲得該引物對綿羊多態(tài)性圖譜，所得結(jié)果可直觀 地檢測出綿羊每個個體的基因型，以期找到與該SNP位點(diǎn)連鎖的性狀，為后續(xù)與傳統(tǒng)方法 結(jié)合進(jìn)行育種工作奠定基礎(chǔ)；
[0022] (三）進(jìn)行SNP基因檢測實(shí)現(xiàn)了低成本、高精度、高通量的閉管操作，大大降低了實(shí) 驗(yàn)過程中由污染可能導(dǎo)致的誤差。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例2中對F1代綿羊樣本進(jìn)行PCR檢測結(jié)果。
[0024] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中PCR-RLFP酶切檢測結(jié)果。
[0025] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中對20個綿羊樣本CLPG基因擴(kuò)增產(chǎn)物測序的結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0026] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明， 實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0027] 實(shí)施例1與綿羊雙肌臀性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記的獲得
[0028] 1. 1澳洲白綿羊血液DNA提取
[0029] 本實(shí)施例中使用的澳洲白綿羊血樣為加入抗凝劑于_20°C保存的綿羊全血，解凍 后用購自天根生化科技（北京）有限公司的血液DNA提取試劑盒從血液中提取基因組DNA， 具體步驟如下：
[0030] (1)血樣置冰上融化，取300 μ 1至一高壓滅菌后的離心管中，按照血液基因組DNA 提取試劑盒說明書操作。
[0031] ⑵加裂解液CL900 μ 1，顛倒或振蕩混勻，室溫靜置5min，期間再多次顛倒混勻。 lOOOOrpm離心lmin，吸去上清液體，保留白色沉淀。若裂解不徹底，即重復(fù)操作一次。
[0032] (3)加緩沖液GS200 μ 1，徹底振蕩至混勻。
[0033] (4)加 Proteinase Κ20 μ 1 溶液并混勻。
[0034] (5)加緩沖液GB200 μ 1，顛倒數(shù)次充分混勻，在56°C水浴鍋中放置10min，期間應(yīng) 多次顛倒混勻，直至溶液顏色徹底清亮。
[0035] (6)加無水乙醇200 μ 1，充分顛倒混勻，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀。
[0036] (7)將上一步所得溶液與絮狀沉淀全部加入到一個吸附柱中，離心機(jī)12000rpm離 心30sec，吸去廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
[0037] (8)向吸附柱中加入緩沖液⑶500 μ 1 (已用無水乙醇配比），12000rpm離心 30sec，吸去棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
[0038] (9)向吸附柱中加緩沖液PW600y 1 (已用無水乙醇配比），12000rpm離心30sec， 吸去廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
[0039] (10)重復(fù)步驟9。
[0040] (11)將吸附柱12000rpm空離2min，倒掉廢液。打開吸附柱上蓋，室溫靜置5分鐘， 徹底晾干，以防漂洗液殘留物影響后續(xù)PCR或酶切反應(yīng)。
[0041] (12)將吸附柱轉(zhuǎn)入另一高壓潔凈的離心管中，向吸附膜中間部分懸空滴加80μ 1 洗脫液ΤΒ，室溫放置5min，12000rpm離心2min。重復(fù)此操作一次，DNA即收集于離心管中。 經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測、核酸蛋白濃度測定儀檢測DNA純度后，置于-20°C冰箱保存。
[0042] 1. 2目的片段和SNP位點(diǎn)的獲得以及PCR-RFLP分型
[0043] (1)擴(kuò)增含SNP位點(diǎn)的核苷酸片段
[0044] 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的綿羊CLPG基因序列（登錄號：AF533009. 1)設(shè)計(jì)引物， 正向引物 F5 ' -TGAAAACGTGAACCCAGAAGC-3 ' 和反向引物 R5' -GGCAGGAGAGACGGTTAAT-3 '，擴(kuò) 增出待測SNP所在的核苷酸片段，該SNP位點(diǎn)位于該P(yáng)CR擴(kuò)增片段的232bp處，該處堿基可 以為C或T，當(dāng)該處堿基為C時，可被Hha I內(nèi)切酶（識別序列為CATG)識別。
[0045] 其中，PCR反應(yīng)使用的擴(kuò)增體系以25 μ 1計(jì)為：40ng/y 1模板DNA2 μ 1，10 μ mol引 物 F 和 R各 lyl，2.5mmol dNTPs2yl，5U/yl Taq DNA聚合酶 0.5yl，10XPCR 反應(yīng)緩沖 液2. 5 μ 1，余量為ddH20。
[0046] PCR反應(yīng)使用的擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C 5分鐘；94°C 40秒，55°C 30秒，72°C 50秒，33個 循環(huán)；72 °C 10分鐘。
[0047] (2)針對第232位堿基的不同選擇適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶進(jìn)行PCR-RFLP
[0048] 該P(yáng)CR產(chǎn)物用Hha I內(nèi)切酶酶切，反應(yīng)體系以25 μ 1計(jì)為：20000U/ml酶 Hha I 0. 8μ1，酶切緩沖液3yl，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物4μ1，(ΜΗ2017. 2μ1。37°C水浴鍋中過夜酶 切。用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果，用凝膠成像系統(tǒng)拍照，根據(jù)帶型判斷基因型。
[0049] 3、基因型判定及關(guān)聯(lián)分析
[0050] 根據(jù)PCR-RFLP的結(jié)果判定該位點(diǎn)在檢測群體中的基因型。若為檢測結(jié)果為兩 條帶（232bp和261bp)，則待測F1代綿羊?qū)儆谄胀ㄆ贩N，且基因型為純和CC型；檢測結(jié)果 僅為一條帶（493bp)，則待測F1代綿羊?qū)儆诰哂袛y帶雙肌臀性狀基因的優(yōu)勢品種，且基因 型為純和TT型；檢測結(jié)果為三條帶（493bp、232bp和261bp)，則待測F1代綿羊?qū)儆诰哂?雙肌臀性狀的優(yōu)勢品種，且基因型為雜合CT型。即，該位點(diǎn)可分為3種基因型：TT:493， CT:493/232/261，CC:232/261。
[0051] 實(shí)施例1綿羊不同基因型與雙肌臀性狀的關(guān)聯(lián)分析及檢測應(yīng)用
[0052] 包括：1、準(zhǔn)備階段；2、DNA檢測；3、檢測結(jié)果分析。具體步驟如下：
[0053] 1、準(zhǔn)備階段
[0054] 1. 1采集78只澳洲白綿羊和173只杜泊羊的F1代雜種綿羊血液樣本，用購自天根 生化科技（北京）有限公司的DNA提取試劑盒提取綿羊血液中的DNA。
[0055] 1. 2根據(jù)SNP標(biāo)記位于綿羊CLPG基因上的位置，設(shè)計(jì)并合成引物，引物序列如下： 正向引物 F5 ' -TGAAAACGTGAACCCAGAAGC-3 ' 和反向引物 R5' -GGCAGGAGAGACGGTTAAT-3'，擴(kuò) 增產(chǎn)物片段大小為498bp。
[0056] 2、DNA 檢測
[0057] 2. 1PCR 擴(kuò)增
[0058] 采用普通PCR擴(kuò)增方法，反應(yīng)體系以25μ 1計(jì)為：40ng/y 1模板DNA2y 1，10μπιο1 引物 F 和 R各 lyl，2.5mmol dNTPs2yl，5U/yl Taq DNA聚合酶 0.5yl，10XPCR 反應(yīng)緩 沖液2. 5μ 1，余量為ddH20。
[0059] 反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性5min ;94°C變性40s，55°C復(fù)性30s，72°C延伸50s，33個循 環(huán)；72°C延伸lOmin。產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠成像系統(tǒng)拍照，與DNA Marker 比較。
[0060] 2. 2PCR-RLFP 檢測
[0061] 用購自BioLabs公司的限制性內(nèi)切酶Hha I對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng) 體系為25μ1，包括：20000U/ml酶Hha I 0·8μ1，酶切緩沖液3yl，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物4μ1， ddH2017. 2μ 1。37°C水浴鍋中過夜酶切。用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果，用凝膠成像 系統(tǒng)拍照，根據(jù)帶型判斷基因型。
[0062] 3、PCR產(chǎn)物及PCR-RFLP酶切檢測結(jié)果
[0063] 3. 1PCR產(chǎn)物檢測
[0064] 對173個F1代綿羊樣本進(jìn)行PCR檢測，成功獲得493bp (SEQ ID NO. 1)的擴(kuò)增產(chǎn) 物，如圖1所示。
[0065] 3. 2PCR-RLFP 酶切檢測
[0066] 用限制性內(nèi)切酶Hha I對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切。若為檢測結(jié)果為兩條帶（232bp 和261bp)，則待測F1代綿羊?qū)儆谄胀ㄆ贩N，且基因型為純和CC型；檢測結(jié)果僅為一條帶 (493bp)，則待測F1代綿羊?qū)儆诰哂袛y帶雙肌臀性狀基因的優(yōu)勢品種，且基因型為純和TT 型；檢測結(jié)果為三條帶（493bp、232bp和261bp)，則待測F1代綿羊?qū)儆诰哂须p肌臀性狀的 優(yōu)勢品種，且基因型為雜合CT型。酶切結(jié)果如圖2所示。
[0067] 選取20個綿羊樣本CLPG基因擴(kuò)增產(chǎn)物測序，結(jié)果如圖3所示。
[0068] 對本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)為GCTGAGAG[C - T]GCAGGAA的SNP位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。從 純種杜泊羊和澳洲白羊群中挑選10只含有[C - T]突變Callipyge基因⑴的父本，和 不含突變的200只野生型等位基因（C)母本杜泊羊和澳洲白，雜交后獲得F1代，雜合綿羊 (CT)在6月齡時體重明顯高于TT型和CC型。且6月齡背膘厚低于TT型和CC型（表1)。 [0069] 表1雜交試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證
[0070]

【權(quán)利要求】
1. 一種與綿羊雙肌臀性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記，其特征在于，其位于綿羊CLPG基因如SEQ ID NO. 1所示序列的232bp處，此處堿基為T的綿羊具有雙肌臀性狀，此處堿基為C的綿羊 無雙肌臀性狀。
2. 用于檢測權(quán)利要求1所述與綿羊雙肌臀性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記的引物，其特征在于，包
3. 權(quán)利要求1所述與綿羊雙肌臀性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記在鑒定具有雙肌臀性狀的優(yōu)勢綿 羊品種中的應(yīng)用，其包括步驟： 1) 提取待測綿羊的基因組DNA ; 2) 以待測綿羊的基因組DNA為模板，利用權(quán)利要求2所述引物F和R，通過PCR反應(yīng)擴(kuò) 增出大小為493bp的綿羊CLPG基因片段； 3) 檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如果擴(kuò)增產(chǎn)物序列中232bp處的堿基為T，則待測綿羊?qū)儆诰哂?雙肌臀性狀的優(yōu)勢綿羊品種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟2)中PCR反應(yīng)使用的擴(kuò)增體系以 25μ 1 計(jì)為：40ng/y 1 模板 DNA2y 1，ΙΟμ--οΙ 引物 F 和 R各 1 μ 1，2· 5mmol dNTPs2y 1，5U/ μ 1 Taq DNA聚合酶0· 5 μ 1，10 X PCR反應(yīng)緩沖液2· 5 μ 1，余量為ddH20。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟2)中PCR反應(yīng)使用的擴(kuò)增程序?yàn)椋?94°C 5 分鐘；94°C 40 秒，55°C 30 秒，72°C 50 秒，33 個循環(huán)；72°C 10 分鐘。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟3)中檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用RFLP 法，具體為：用內(nèi)切酶Hha I對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，并對酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳 檢測，如果檢測結(jié)果為兩條帶，則待測綿羊?qū)儆谄胀ㄆ贩N，且基因型為純和CC型；檢測結(jié)果 僅為一條帶，則待測綿羊?qū)儆跀y帶雙肌臀性狀基因的優(yōu)勢品種，且基因型為純和TT型；檢 測結(jié)果為三條帶，則待測綿羊?qū)儆诰哂须p肌臀性狀的優(yōu)勢品種，且基因型為雜合CT型。
7. 含有權(quán)利要求2所述引物的用于檢測綿羊雙肌臀性狀的試劑盒。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚 合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液中的一種或多種。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。
10. 權(quán)利要求1所述與綿羊雙肌臀性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記在綿羊分子標(biāo)記輔助育種中的 應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104120123SQ201410314791
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年7月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月3日
【發(fā)明者】杜立新, 魏彩虹, 張莉, 趙福平, 陳華 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所