Dc靶向肽及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種DC靶向肽及其應用，所述種DC靶向肽氨基酸序列如SQEIDNo:1或者SQEIDNo:2或者SQEIDNo:3所示。本發(fā)明所述DC靶向肽的靶向性和DC細胞富集能力：融合有DC靶向肽的腫瘤特異性抗原可以精確指導并富集到DC細胞表面。
【專利說明】DC靶向肽及其應用
[0001]

【技術領域】
[0002]本發(fā)明屬于多肽領域，尤其是涉及DC靶向肽及其制備方法和應用。

【背景技術】
[0003]癌癥是全球導致死亡的主要原因之一，2007年全球死于癌癥的人數(shù)達到790萬，約占所有死亡人數(shù)的13%，發(fā)病率呈逐年上升趨勢。其治療主要以手術、化療和放療為主，但放化療副作用大，療效都不是很理想。目前，免疫細胞治療正在成為一種新的癌癥治療手段。
[0004]隨著分子生物學和免疫學等基礎學科的飛速發(fā)展，對腫瘤的研究日益深入，特別是近十幾年來，多種與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關的腫瘤抗原被發(fā)現(xiàn)，這些抗原可以作為癌癥免疫治療的靶標。腫瘤特異性的抗原可以通過DC(dendritic cells，樹突狀細胞)細胞遞呈給T細胞,啟動T細胞的特異性殺傷腫瘤的能力。(Banchereau, J.，and Steinman, R.Μ.(1998) Dendritic cells and the control of immunity.Nature 392, 245 - 2522.Palucka, K., Banchereau, J., and Mellman, 1.(2010) Designing vaccines basedon b1logy of human dendritic cellsubsets.1tmuniij^33, 464 - 478)。如何讓抗原準確高效的到達DC細胞，是腫瘤免疫治療的關鍵。噬菌體展示技術為我們提供了一種篩選DC靶向分子的方法。
[0005]噬菌體展示技術，在1985年首次被Smith闡述，原理是通過將外源蛋白或肽段的基因克隆到絲狀噬菌體的基因組DNA中，與噬菌體的外殼蛋白形成融合蛋白，從而使該外源分子呈現(xiàn)于噬菌體表面。該技術的主要特點是將特定分子的基因型和表型統(tǒng)一在同一噬菌體顆粒內，即在噬菌體表面表達特定蛋白，而在噬菌體核心DNA中含有該蛋白的結構基因，通過表型篩選就可以獲得其編碼基因，因此噬菌體展示技術是一種強有力的基因表達篩選技術。卩遼菌體展不妝庫技術具有聞庫容、聞效方便及靈活的篩選技術等特點，近幾年已經(jīng)廣泛用于抗腫瘤疫苗，藥物，及腫瘤診斷標志物的篩選研發(fā)(JohnsonDH.Targeted therapy in non-small cell lung cancer, myth and reality[J].lungCancer, 2003, 41 (suppll):S3-S8)
MUCl又稱附膜蛋白，是由mucl基因表達的一種高分子量，高糖基化蛋白，它一種是跨膜分子。它在上皮更新與分化，維持上皮完整性和癌的發(fā)生與轉移等方面都起到重要的作用(Moniaux N, Escande F, Porchet N, et al Structural organizat1n andclassificat1n of the human mucin genes (J) Front B1sci,2001;6(I):D1192206)。正常情況下，MUCl可在多種組織、器官中的上皮細胞如消化道、呼吸道、乳腺、胰腺、生殖道中表達，主要分布于腺細胞頂膜或以分泌形式存在于腺腔內，不被免疫系統(tǒng)識別。而在惡性腫瘤細胞中，乳腺癌、胃癌、結腸癌等多種癌組織中，MUCl表達量可達正常時的10倍以上，且結構發(fā)生改變，使MUCl的核心蛋白暴露出新的蛋白表位或新的糖抗原，分布于整個癌細胞表面，作為腫瘤特異的抗原，成為免疫細胞攻擊靶點(Miles DW，TaylorPapadimitr1u J Therapeutic aspects of polymorphic epithelial mucin inadenocarcinoma (J) Pharmacol Ther,1999 ；82 (I):97 106)，
本發(fā)明通過從噬菌體展示技術從肽庫中篩選得到了一種可以高效靶向DC細胞的多肽，并與MUCl腫瘤特異性多肽抗原融合，利用多肽固相合成方法合成了“DC靶向融合肽”。并對其DC靶向能力、DC細胞致敏能力和激活CTL細胞腫瘤殺傷能力進行了評價。
[0006]


【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明的一個目的是提供一種靶向DC細胞的多肽。
[0008]本發(fā)明所提供的DC靶向多肽，其氨基酸序列如SQE ID No:l或者SQE ID No:2或者SQE ID No:3所示。本發(fā)明提供一種DC靶向肽介導的DC-CTL免疫細胞治療技術。
[0009]比起其他技術靶向肽技術具有以下優(yōu)點:
(I)靶向性和DC細胞富集能力:融合有DC靶向肽的腫瘤特異性抗原可以精確指導并富集到DC細胞表面。
[0010](2)高效抗原遞呈能力:特殊的柔性Linker設計使腫瘤抗原表達相對獨立，使DC細胞能有效遞呈腫瘤抗原。
[0011](3)安全性:靶向肽不具有免疫原性，可避免引起人體不良免疫反應，相對于病毒載體祀向技術安全性極高。
[0012]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1所示為DC祀向的曬菌體篩選示意圖；Cl-富集在DC細胞上的曬菌體占總數(shù)的百分數(shù)；A-篩選次數(shù)；
圖2所示為噬菌體克隆結合DC細胞的能力示意圖；
圖3所示為祀向融合肽結合DC細胞的能力示意圖；
圖4所示為3H-TdR摻入實驗示意圖；
圖5所示為CTL體外殺傷MUCl陽性腫瘤實驗示意圖。

【具體實施方式】
[0014]下面結合具體的實施例對本發(fā)明做進一步詳細的闡述:
實例一，以DC細胞為靶細胞來篩選獲得本發(fā)明的DC靶向肽本發(fā)明用噬菌體隨機肽庫，來篩選獲得靶向DC細胞的DC靶向肽:
1.以DC細胞為靶細胞進行篩選:
(I)獲取DC細胞:
從健康人的外周血中分離單個核細胞(peripheral blood mononuclearcell, PBMC),經(jīng)體外誘導培養(yǎng)獲取成熟樹突狀細胞(dendritic cell, DC)方法:
①取健康人新鮮外周血，加入淋巴細胞分離液，經(jīng)密度梯度離心法分離，獲得單個核細胞。
[0015]②在含10%胎牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng).置37°C、5%C02培養(yǎng)箱內靜置培養(yǎng)2 h后除去懸浮細胞。
[0016]③培養(yǎng)液中加入rhGM-CSF和rhIL_4繼續(xù)培養(yǎng)貼壁細胞5 d,然后加入TNF- α促進其分化成熟。
[0017]④倒置顯微鏡下觀察DC形態(tài)，流式細胞儀(flowcytometer，F(xiàn)CM)對其進行表型鑒定。
[0018]⑤在顯微鏡到觀察DC細胞形態(tài)不規(guī)則，表面有大量的毛刺狀突起；越成熟的DC細胞表面⑶83、⑶80分子表達明顯增高。
[0019](2)以DC細胞為固相篩選目標來篩選:
噬菌體隨機肽庫的體外消減篩選，DC細胞為靶細胞，進行3輪消減篩選，并逐漸增加篩選強度。所得噬菌體經(jīng)擴增、滴定。具體步驟如下:選擇生長狀態(tài)良好的DC細胞一瓶(細胞總數(shù)約5 X 16個)；傾去原有的培養(yǎng)基，然后用洗脫液PBST充分洗脫3— 5遍，去除雜蛋白的的干擾；加入用PBST稀釋到10n/ml的噬菌體隨機肽庫約Iml后繼續(xù)孵育lh。用PBST充分洗脫3?7遍，去除未結合的噬菌體；再次用PBST強力洗脫2?4遍，去除特異性結合但結合不緊密的噬菌體；后采用細胞刮刀收集貼壁的細胞以及結合在上面的候選噬菌體；收集物加入預先準備好的感受態(tài)細菌(大腸桿菌)中進行擴增，然后采用常規(guī)的純化方法擴增后進行第三輪的篩選；將擴增好的洗脫物重復淘洗3次，獲得與DC細胞緊密特異性結合的噬菌體克隆。
[0020]2.陽性噬菌體克隆的ELISA鑒定:
噬菌體肽庫經(jīng)過3輪減性篩選后，隨機挑選10個噬菌體的單克隆，用常規(guī)ELISA法來鑒定噬菌體克隆對DC細胞的親和力。具體步驟如下:將DC細胞按I X 15 /孔的密度接種于96孔板上，放到37°C、5% C02培養(yǎng)箱中；對細胞進行營養(yǎng)饑餓處理Ih ;用4%的多聚甲醛固定20min, 0.1%的TritonX-1OO處理1min ;用3%的BSA封閉lh，加入一定濃度的噬菌體(大于112) 37°C孵育2h ;用PBST洗3次，加入抗體HRP_antiM13抗體，37°C孵育Ih ；PBST洗5遍，之后每孔加入10ul的TMB顯色作用2min ;用150ul, 2M的H2SO4終止反應，用酶標儀測定反應液的A450值。隨機挑取噬菌體原庫斑作為對照，以排除非特異性吸附的隱性噬菌體克隆對實驗結果的影響。
[0021]由圖2可知，其中8號噬菌體單克隆對DC細胞的親合力最強，命名為phage NP8.0D值為(0.450±0.02)，8號高于對照同時高于其他，對照為原庫隨機噬菌體克隆OD值為(1.832±0.008) P < 0.05，n=8。
[0022]3.刪選陽性噬菌體克隆的測序及靶向DC細胞的靶向肽的合成:將篩選OD值最高的三個噬菌體克隆進行測序，其序列分別如SQE ID No:1, SQE ID No:2, SQE ID No:3所
/Jn ο
[0023]實例二，獲得的DC靶向肽和腫瘤相關抗原MUCl融合制成的融合肽 1.融合肽合成:
將篩選到的DC祀向肽(phage NP8)與MUCl腫瘤抗原肽中間通過柔性linker相連接，合成DC祀向融合肽。同時制備FITC標記的該融合肽備用。
[0024]2.融合妝DC結合日纟力鑒定:
將制備出來的NP-MUCl融合肽用靶細胞DC來鑒定，以Hela細胞作對照，具體步驟如下:將DC細胞按I X 15 /孔的密度接種于96孔板上，放到37°C、5% C02培養(yǎng)箱中；細胞進行營養(yǎng)營養(yǎng)脅迫處理2h ;無水甲醇固定20min，0.1%的TritonX-1OO處理1min ；5%的脫脂牛奶封閉lh，加入一定濃度的剛制備的NP-MUCl融合肽，37°C孵育2h ；PBST洗5_6次，力口AMUCl的抗體，37°C孵育Ih ;PBST洗7-8遍，之后每孔加入10ul的TMB顯色作用2min;150ul, 2M的H2SO4終止反應，用酶標儀測定反應液的A450值。
[0025]結果如圖3所示，與HeLa細胞相比，融合肽能特異靶向與DC細胞相結合。
[0026]實例三，DC融合肽效果評價
1.抗原遞呈細胞DC對NP-MUCl融合肽的吸收
我們利用激光共聚焦顯微鏡觀察了融合肽進入DC細胞的效率。具體步驟如下^fDC細胞接種于含有小玻片的六孔板中，37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；然后加入熒光素(FITC)標記的MUCl多肽或者FITC標記的DC融合肽。孵育6小時后，洗去培養(yǎng)基；4%多聚甲醛固定后10分鐘，0.1% Triton-xlOO打孔5分鐘；然后加入DAPI染色后，利用激光共聚焦顯微鏡觀察抗原遞呈細胞DC對MUCl和DC靶向融合肽的吸收效率。
[0027]2.混合淋巴細胞反應(allo-MLR)測定抗原遞呈細胞的抗原遞呈能力
分離和體外培養(yǎng)單核吞噬細胞和樹突狀細胞DC。然后用上述多肽(MUC1多肽、NP-MUCl融合肽，對照多肽)體外致敏抗原遞呈細胞。
[0028]取正常人外周血，常規(guī)分離單個核細胞(PBMC)，加入rhIL2培養(yǎng)5天，作為同種異體效應細胞。分為四組:①只有DC細胞②DC細胞+靶向融合肽③DC細胞+MUCl④DC細胞+陰性對照肽。將上述多肽致敏的DC細胞，加入絲裂霉素25 μ g/ ml，去增殖后，按DC與效應細胞按1: 10的比例于37 0C ,5 % C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)6天，收獲前12小時加入3H-TdR，IyCi/孔。用細胞收集器收集細胞，液體閃爍計數(shù)器檢測3H摻入的cpm值，以下為四組中3H摻入的cpm值(圖4)。結果表明與其他對照肽相比，NP-MUCl融合肽顯著更強地刺激了效應細胞的增殖。
[0029]3.CTL體外殺傷MUCl陽性腫瘤的實驗
分離和體外培養(yǎng)DC細胞。然后用上述多肽(對照多肽、MUCl多肽、NP-MUCl融合肽)體外致敏抗原遞呈細胞。
[0030]取正常人外周抗凝血，常規(guī)分離PBMC，作為同種異體效應細胞。將各組誘導培養(yǎng)的DC細胞，加入25 μ g/ ml絲裂霉素，去增殖后作為刺激細胞。將刺激細胞和效應細胞以1: 10比例，于37 °C，5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，收集細胞作為CTL細胞。選用生長良好的MDA-MB-231乳腺癌細胞(HLA class A2.1和MUCl陽性)加入Na2 51 Cr 04 ImCi/ ml ,37 °C，5 % C02培養(yǎng)4小時后收集細胞作為靶細胞。將上述制備的CTL細胞與靶細胞以5: I效靶比加入96孔圓底板中培養(yǎng)6小時，培養(yǎng)結束后，收集全部上清，用￥2能譜儀測量上清中51&放射性含量(cpm)。
[0031]如圖5所示，與其他多肽相比較，NP-MUCl融合肽刺激的CTL殺傷腫瘤細胞的能力顯著最強。
[0032]序列表(SEQUENCELISTING)
<110>文康醫(yī)療科技(深圳)有限公司 <120>DC靶向肽及其應用
〈160〉 3



L
0AiaxaQnHε 〈00歹>XHd <ζιζ>6 <ττοε <οτο
I1AAVSIIZ 〈00歹>XHd <ZIZ>6 <TTC>Z <0TC>1dAAOlAA
I<00^>XHd <ZIZ>6 <TTC>
【權利要求】
1.一種DC靶向肽，其氨基酸序列如SQE ID No:1或者SQE ID No: 2或者SQE ID No: 3所示。
2.權利要求1中所述DC靶向肽的編碼基因。
3.含有權利要求2中所述DC靶向肽編碼基因的重組表達載體。
4.如權利要求3所述的重組表達載體，其特征在于:所述重組表達載體為重組噬菌體。
5.含有權利要求2中所述基因的的轉基因細胞系。
6.根據(jù)權利要求5中所述的轉基因細胞系，其特征在于:所述基因細胞系為導入權利要求3或4所述的重組表達載體的轉基因細胞系。
7.含有權利要求3所述重組表達載體的重組菌。
8.權利要求7所述的重組菌，其特征在于:所述重組表達載體為重組噬菌體。
9.權利要求1中所述DC靶向肽的融合肽及載體，其特征是:所述融合肽典型特征為MUCl腫瘤抗原多肽。
10.權利要求1中的DC靶向肽在預防和治療癌癥藥物中的應用。
【文檔編號】C12N15/63GK104277094SQ201410316072
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年7月4日 優(yōu)先權日:2014年7月4日
【發(fā)明者】瞿明 申請人:文康醫(yī)療技術（深圳）有限公司