一種定位定量檢測dna和rna中6-甲基氨基嘌呤的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種定位定量檢測DNA和RNA中6-甲基氨基嘌呤的方法。通過對DNA和RNA中6-甲基氨基嘌呤的檢測來反映核酸的甲基化水平：6-甲基氨基嘌呤的存在會降低DNA復制和RNA逆轉(zhuǎn)錄時的底物活性，在DNA復制和RNA轉(zhuǎn)錄過程中，有甲基化位點出現(xiàn)時，將不會發(fā)生鏈延伸；因此，可以通過摻入脫氧核苷三磷酸進行鏈延伸來達到區(qū)分甲基化和非甲基化序列的目的，同時可以對DNA和RNA的特定位點的甲基化水平做出定量評估。本發(fā)明可很好地用在DNA和RNA的核苷酸分離中的6-甲基氨基嘌呤分析上，是一種簡便的檢測DNA和RNA中腺嘌呤甲基化程度的方法。
【專利說明】—種定位定量檢測DNA和RNA中6-甲基氨基嘌呤的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學和核酸化學領域，涉及一種定位定量檢測DNA和RNA中6-甲基氨基嘌呤的方法。
【背景技術】
[0002]表觀遺傳學是在研究與經(jīng)典孟德爾遺傳法則不相符的生命現(xiàn)象過程中逐步發(fā)展起來的一門學科，又稱為“擬遺傳學”、“表遺傳學”、“外遺傳學”或“后遺傳學”，主要研究在細胞核中脫氧核糖核酸(DNA)沒有改變的情況下對于功能可逆的、可遺傳的改變。甲基化是指從活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上將甲基催化轉(zhuǎn)移到其他化合物的過程，可形成各種甲基化合物，或是對某些蛋白質(zhì)或核酸等進行化學修飾形成甲基化產(chǎn)物。DNA的甲基化是表觀遺傳學的一種機制，它通過特定的甲基化酶將甲基加在DNA分子上，如胞嘧啶的5’碳上，甲基化之后的DNA序列在復制、轉(zhuǎn)錄及翻譯的過程中都不會發(fā)生改變，但是卻會改變最終的遺傳表現(xiàn)。甲基化是蛋白質(zhì)和核酸的一種重要的修飾，調(diào)芐基因的表達和關閉，與癌癥、衰老 、老年癡呆等許多疾病密切相關，是表觀遺傳學的重要研究內(nèi)容之一。最常見的甲基化修飾有DNA甲基化和組蛋白甲基化。
[0003]DNA甲基化是指生物體在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase, DMT)的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到特定的堿基上的過程。DNA甲基化能關閉某些基因的活性，去甲基化則誘導了基因的重新活化和表達。DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構、DNA構象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達。研究證實，CpG 二核苷酸中胞嘧啶的甲基化導致了人體1/3以上由于堿基轉(zhuǎn)換而引起的遺傳病。DNA甲基化主要形成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5-mC)和少量的6-甲基氨基嘌呤(N6-甲基腺嘌呤，Iii6A)及7-甲基鳥嘌呤(7-mG)。甲基化修飾同樣也會發(fā)生在RNA水平上。
[0004]RNA同時具有調(diào)控和信息分子的雙重功能，在眾多細胞機制中發(fā)揮著核心的作用，例如作為遺傳信息的信使，催化生化反應，作為細胞結(jié)構骨架等。RNA轉(zhuǎn)錄后的修飾為RNA功能的多樣化奠定了化學基礎，2011年更新的RNA修飾數(shù)據(jù)庫RNAMDB共收錄了 109種RNA的修飾形式，其中甲基化修飾占80%，最常見的是發(fā)生在信使RNA (mRNA)中腺苷的N6位置上(m6A)，但被研究得不是很多。
[0005]6-甲基氨基嘌呤是發(fā)生在堿基A第六位N原子上的甲基化，最早是在細菌DNA中發(fā)現(xiàn)的。1955年Dunn等人在觀察胸腺嘧卩定的結(jié)構類似物對Bacterium coli 15T的影響時，發(fā)現(xiàn)DNA復制過程中出現(xiàn)了一種新堿基。將DNA水解后利用二維紙層析方法進行堿基分離時，除了得到四種常見的堿基(A、T、C、G)外，還發(fā)現(xiàn)了第五個紫外吸收點。經(jīng)過多重實驗鑒定，對應于該吸收光點的新堿基為N6-甲基腺嘌呤。同時，在其他一些菌株和噬菌體中也檢測到了 6-甲基氨基嘌呤的微量存在。1958年，Dunn等人在研究Bacterium coli RNA中的非自然堿基時也同樣分離到了 6-甲基氨基嘌呤。另外，在多種高等真核真核生物以及病毒的mRNA中都檢測到m6A的存在。6-甲基氨基嘌呤如此廣泛的存在讓我們很難忽視它的生物學意義和重要性，從而進行更深入的研究。
[0006]傳統(tǒng)認識認為，由于被甲基化的堿基A沒有改變它的堿基配對能力，目前還不能通過直接測序來檢測，也沒有發(fā)現(xiàn)它有獨特的的化學反應。如DNA中的5-甲基胞嘧啶經(jīng)過亞硫酸氫鹽法處理后會發(fā)生堿基變化從而可以通過測序檢測。所以之前的檢測方法一直是基于放射性標記技術，即將甲基供體S-腺苷甲硫氨酸進行放射性標記，并于待處理的細胞進行孵育，隨后通過薄層色譜(TLC)或高效液相色譜(HPLC)來檢測。但是這種方法既昂貴又繁瑣，效率又低，而且無法實現(xiàn)大規(guī)模的基因檢測及確切的甲基化位點的定位，局限性很大。因此，發(fā)展新型的甲基化堿基A的檢測方法，方便、快捷、低成本地對其進行檢測，十分重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術中存在的缺陷和不足，提供一種方便、低成本的定位定量檢測DNA和RNA中6-甲基氨基嘌呤的方法。
[0008]本發(fā)明基于引物延伸法和凝膠電泳法的原理對DNA和RNA中6_甲基氨基嘌呤進行檢測，其檢測原理是:含有6-甲基氨基嘌呤的模板鏈在延伸時會降低底物的活性，使延伸減慢；同時在含有甲基化的位點與模板鏈互補配對的互補鏈不能發(fā)生延伸；通過反應時間的不同，可以區(qū)分甲基化和非甲基化的序列，同時也可以對特定位點的甲基化水平進行定量評估。
[0009]一種定位定量檢測DNA和RNA中6_甲基氨基嘌呤的方法，包括如下步驟:
1)進行DNA復制反應:向含有2~10mM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、10~50 mM的硫酸銨、1~10 mM的氯化鉀 、2(T100 mM的硫酸鎂和2(T100 mM的聚乙二醇辛基苯基醚的緩沖溶液中加入DNA聚合酶、引物、三磷酸脫氧核糖核苷酸和DNA模板鏈，形成DNA復制反應體系，其中，DNA復制反應體系中各物質(zhì)的濃度:DNA聚合酶為0.2~0.5 U，引物為200~500 nM，三磷酸脫氧核糖核苷酸為100~400 μ M，DNA模板鏈為0.3~3 mM ；DNA復制反應體系在5(T70°C中延伸反應20~60 min ；
2)進行RNA逆轉(zhuǎn)錄反應:向含有2~10mM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、1(T50 mM的硫酸銨、f 10 mM的氯化鉀、2(T100 mM的硫酸鎂和2(T100 mM的聚乙二醇辛基苯基醚的緩沖溶液中加入RNA聚合酶、引物、三磷酸核糖核苷酸、RNA酶抑制劑和RNA模板鏈，形成RNA逆轉(zhuǎn)錄反應體系，其中，RNA逆轉(zhuǎn)錄反應體系中各物質(zhì)的濃度:RNA聚合酶為0.2^0.5 U，引物為200^500 nM、三磷酸核糖核苷酸為100~400 μ M，RNA酶抑制劑為0.2~0.5 U，RNA模板鏈為
0.2^3 mM ;其中，RNA聚合酶和RNA酶抑制劑濃度比為1:1 ；RNA逆轉(zhuǎn)錄反應體系在5(T70°C中延伸反應20~60 min ；
3)定位定量檢測6-甲基氨基嘌呤:分別向步驟I)的DNA復制反應體系和步驟2)的RNA逆轉(zhuǎn)錄反應體系中加入猝滅劑使延伸反應終止，然后在8(T100 0C孵育1(T30 min，冷卻至室溫，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，可以檢測出DNA和RNA中6-甲基氨基嘌呤的數(shù)量；根據(jù)引物鏈和其延伸鏈的相對位置，可以確定DNA和RNA中6-甲基氨基嘌呤的特定位點。
[0010]所述的DNA模板鏈為不含6-甲基氨基嘌呤的DNA和含6_甲基氨基嘌呤的DNA。[0011 ] 所述的RNA模板鏈為不含6-甲基氨基嘌呤的RNA和含6_甲基氨基嘌呤的RNA。
[0012]所述的三磷酸脫氧核糖核苷酸為脫氧胸苷三磷酸、三磷酸脫氧尿苷、5-羥甲基脫氧尿三磷酸或5-氟尿嘧啶脫氧核苷酸。
[0013]所述的DNA聚合酶為牛生長激素聚合酶時，DNA復制反應體系中加入耐熱聚合酶反應緩沖液(ThermoPol?)和聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X_100)，DNA復制反應體系中耐熱聚合酶反應緩沖液的體積分數(shù)為50%、聚乙二醇辛基苯基醚的濃度為lwt%。
[0014]所述的DNA聚合酶為克列諾片段聚合酶時，DNA復制反應體系中加入雙酶切緩沖液(NEBuffer2)和2.5倍緩沖溶液體積的二硫蘇糖醇，DNA復制反應體系中雙酶切緩沖液的體積分數(shù)為50%。
[0015]所述的猝滅劑中甲酰胺的體積分數(shù)為80%、乙二胺四乙酸二鈉的濃度為200 mM，猝滅劑的PH值為8.0。
[0016]所述的聚丙烯酰胺凝膠為體積分數(shù)為12%~20%的變性聚丙烯酰胺凝膠。
[0017]本發(fā)明具有如下優(yōu)點和有益效果:
(I)本發(fā)明對6-甲基氨基嘌呤的檢測方法，前期預處理時間短，方便快捷，無需進行放射性標記。
[0018](2)本發(fā)明所有的結(jié)果可使用聚丙烯酰胺凝膠電泳得到，可以進行大規(guī)模的基因檢測，而且可以準確檢測出甲基化特定位點，并對其做出定量評估。
[0019](3)本發(fā)明通過對6-甲基氨基嘌呤定位定量的研究，可以深度研究6-甲基氨基嘌呤的生理學功能，為癌癥、衰老、老年癡呆等疾病的研究提供依據(jù)以及幫助。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為腺嘌呤和6-甲基氨基嘌呤的結(jié)構示意圖。
[0021]圖2為DNA-A和DNA-Hi6A的不同延伸行為的聚丙烯酰胺凝膠分析圖；其中，primer代表未延伸條帶，primer + I代表延伸的條帶，I為非甲基化模板鏈的泳道，2為甲基化模板鏈的泳道。
[0022]圖3為RNA-A和RNA-Hi6A的不同延伸行為的聚丙烯酰胺凝膠分析圖；其中，primer代表未延伸條帶，primer + I代表延伸的條帶，I為非甲基化模板鏈的泳道，2為甲基化模板鏈的泳道。
[0023]圖4為不同濃度比例RNA-A和RNA-Hi6A中的不同延伸行為的聚丙烯酰胺凝膠分析圖；其中，primer代表未延伸條帶，primer + I代表延伸的條帶，1---泳道代表含不同濃度比例的RNA-Hi6A的凝膠電泳圖。
[0024]圖5為不同濃度比例RNA-A和RNA-Hi6A中的引物延伸線性關系圖。
【具體實施方式】
[0025]以下實施例用以進一步說明本發(fā)明的技術方案，但不應理解為對本發(fā)明的限制。
[0026]實施例1:待測體系設計
(I)設計兩種類型的DNA模板鏈，其中一條為普通帶腺嘌呤的DNA (DNA-A)，其序列為5’ -CCCACCCTATAGAGTCGTA-3’ ；另一條為帶6-甲基氨基嘌呤修飾的DNA (DNA_m6A)，其序列為 5’ -CCCm6ACCCTATAGAGTCGTA-3’，引物鏈為 5’ -GTGCATGTGGCAG-3 ’。
[0027](2)設計兩種類型的RNA模板鏈，其中一條為普通帶腺嘌呤的RNA (RNA-A)，其序列為5’ -CCCACCCUAUAGAGUCGUA-3’ ；另一條為帶N6-甲基腺嘌呤修飾的RNA (RNA_m6A)，其序列為 5’ -CCCm6ACCCUAUAGAGUCGUA-3’，引物鏈為 5’ -GTGCATGTGGCAG-3 ’。
[0028](3)配制1組含不同濃度RNA-A和RNA-Hi6A混合模板鏈的樣品，其中RNA-A和RNA-Hi6A 的濃度比例依次為 10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8 和 0:10。
[0029]實施例2:進行DNA復制反應
(1)配制含有10mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、50 mM硫酸銨、10 mM氯化鉀、100 mM硫酸鎂和100 mM聚乙二醇辛基苯基醚的緩沖溶液；向20 μ L的緩沖溶液中加入以下物質(zhì)使其最終濃度:Bst聚合酶為0.5 U，5-羥甲基脫氧尿苷三磷酸(5-hmdUTP)為400 μ Μ，引物鏈為200 nM ；
(2)分別加入所設計的兩種類型的DNA模板鏈，總濃度為300nM，在50 0C的水浴中孵育 60 min ；
(3)向反應體系中加入500μ L猝滅劑(甲酰胺的體積分數(shù)為80%，乙二胺四乙酸二鈉濃度為200 mM, pH=8.0),80 0C孵育20 min，然后自然冷卻至室溫；
(4)將反應液進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(體積分數(shù)為12%的變性聚丙烯酰胺凝膠)，獲得所需數(shù)據(jù)。結(jié)果如圖2(泳道I為非甲基化模板鏈，泳道2為甲基化模板鏈)所示，primer代表未延伸條帶，primer + I代表延伸的條帶，因此可以達到很好的甲基化區(qū)分效果。
[0030]實施例3 :進行RNA逆轉(zhuǎn)錄反應
(1)配制含有2mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、10 mM硫酸銨、I mM氯化鉀、20 mM硫酸鎂和20 mM聚乙二醇辛基苯基醚的緩沖溶液；向20 μ L的緩沖溶液中加入以下物質(zhì)使其最終濃度:Sst聚合酶為0.2 U，RNA酶抑制劑為0.2 U，5-氟尿嘧啶脫氧核苷酸(5-F_dUTP)為100 μ M，引物鏈為200 nM ；
(2)分別加入所設計的兩種類型的RNA模板鏈，總濃度為500nM，在70 0C的水浴中孵育 20 min ；
(3)向反應體系中加入500μ L猝滅劑(甲酰胺的體積分數(shù)為80%，乙二胺四乙酸二鈉濃度為200 mM, pH=8.0)，100 0C孵育10 min，然后自然冷卻至室溫；
(4)將反應液進行聚丙烯酰胺凝膠(體積分數(shù)為20%的變性聚丙烯酰胺凝膠)電泳，獲得所需數(shù)據(jù)。結(jié)果如圖3(泳道I為非甲基化模板鏈，泳道2為甲基化模板鏈)所示，primer代表未延伸條帶，primer + I代表延伸的條帶，可以達到很好的甲基化區(qū)分效果。
[0031]實施例4
Cl)配制含有5 mM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、30 mM硫酸銨、3 mM氯化鉀、50 mM硫酸鎂和50 mM聚乙二醇辛基苯基醚的緩沖溶液；向20 μ L的緩沖溶液中加入以下物質(zhì)使其最終濃度:Bsi聚合酶為0.44 U，RNA酶抑制劑為0.44 U，5-氟代脫氧尿三磷酸(5-F_dUTP)為200 μ M ;并加入20 μ L 100 nM的引物鏈；
(2)加入不同濃度比例的RNA-A和RNA-Hi6A混合模板鏈的樣品，總濃度為200nM,在60°C水浴中孵育30 min ；
(3)向反應體系中加入500μ L的猝滅劑(甲酰胺的體積分數(shù)為80%，乙二胺四乙酸二鈉濃度為200 mM, pH=8.0),90 0C孵育30 min，然后自然冷卻至室溫；
(4)將反應液進行聚丙烯酰胺凝膠(體積分數(shù)為16%的變性聚丙烯酰胺凝膠)電泳，獲得所需數(shù)據(jù)。
[0032]對含有不同濃度比例的RNA-Hi6A的凝膠電泳圖和含量的線性關系分析，結(jié)果如圖4所示，隨著RNA-Hi6A濃度比例的增加，其延伸鏈的比例逐漸減少，并呈現(xiàn)線性關系，線性相關系數(shù)R2=0.9938。根據(jù)引物鏈和其延伸鏈的相對位置，可以驗證RNA中m6A的特定位點。以此結(jié)果可預測未知序列中m6A的含量以及其特定位點。
[0033]不同種類的聚合酶均可用于本發(fā)明的鏈延伸，包括熱穩(wěn)定聚合酶(Taq DNA聚合酶)、牛生長激素聚合酶(fei聚合酶)和克列諾片段聚合酶等。若反應體系中為fei聚合酶，則需在含有I X ThermoPol?(I X即稀釋I倍)和lwt% Triton X-1OO的反應體系中進行孵育；若反應體系中為克列諾片段聚合酶，則需在含有I XNEBuffer 2和50 μ L的二硫蘇糖醇的反應體系中進行孵育。
[0034]不同種類的核苷酸均可用于本發(fā)明的鏈延伸，包括脫氧胸苷三磷酸(dTTP)、5_羥甲基脫氧尿三磷酸、 三磷酸脫氧尿苷(dUTP)和5-氟尿嘧啶脫氧核苷酸等。
【權利要求】
1.一種定位定量檢測DNA和RNA中6-甲基氨基嘌呤的方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)進行DNA復制反應:向含有2~10mM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、10~50 mM的硫酸銨、f 10 mM的氯化鉀、2(T100 mM的硫酸鎂和2(T100 mM的聚乙二醇辛基苯基醚的緩沖溶液中加入DNA聚合酶、 引物、三磷酸脫氧核糖核苷酸和DNA模板鏈，形成DNA復制反應體系，其中，DNA復制反應體系中各物質(zhì)的濃度:DNA聚合酶為0.2~0.5 U，引物為200~500 nM，三磷酸脫氧核糖核苷酸為100~400 μ M，DNA模板鏈為0.3~3 mM ；DNA復制反應體系在5(T70°C中延伸反應20~60 min ； 2)進行RNA逆轉(zhuǎn)錄反應:向含有2~10mM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、10~50 mM的硫酸銨、f 10 mM的氯化鉀、2(T100 mM的硫酸鎂和2(T100 mM的聚乙二醇辛基苯基醚的緩沖溶液中加入RNA聚合酶、引物、三磷酸核糖核苷酸、RNA酶抑制劑和RNA模板鏈，形成RNA逆轉(zhuǎn)錄反應體系，其中，RNA逆轉(zhuǎn)錄反應體系中各物質(zhì)的濃度:RNA聚合酶為0.2^0.5 U，引物為200^500 nM、三磷酸核糖核苷酸為100~400 μ M，RNA酶抑制劑為0.2~0.5 U，RNA模板鏈為0.2~3 mM ;其中，RNA聚合酶和RNA酶抑制劑濃度比為1:1 ;RNA逆轉(zhuǎn)錄反應體系在5(T70°C中延伸反應20~60 min ； 3)定位定量檢測6-甲基氨基嘌呤:向步驟I)的DNA復制反應體系和步驟2)的RNA逆轉(zhuǎn)錄反應體系中加入粹滅劑使延伸反應終止，然后在8(T100 °C孵育1(T30 min,冷卻至室溫，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，可以檢測出DNA和RNA中6-甲基氨基嘌呤的數(shù)量；根據(jù)引物鏈和其延伸鏈的相對位置，可以確定DNA和RNA中6-甲基氨基嘌呤的特定位點。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于:所述的DNA模板鏈為不含6-甲基氨基嘌呤的DNA和含6-甲基氨基嘌呤的DNA。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于:所述的RNA模板鏈為不含6-甲基氨基嘌呤的RNA和含6-甲基氨基嘌呤的RNA。
4.根據(jù)權利要求1-3任意一項所述的方法，其特征在于:所述的三磷酸脫氧核糖核苷酸為脫氧胸苷三磷酸、三磷酸脫氧尿苷、5-羥甲基脫氧尿三磷酸或5-氟尿嘧啶脫氧核苷酸。
5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于:所述的DNA聚合酶為牛生長激素聚合酶時，DNA復制反應體系中加入耐熱聚合酶反應緩沖液和聚乙二醇辛基苯基醚，DNA復制反應體系中耐熱聚合酶反應緩沖液的體積分數(shù)為50%、聚乙二醇辛基苯基醚的濃度為lwt%。
6.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于:所述的DNA聚合酶為克列諾片段聚合酶時，DNA復制反應體系中加入雙酶切緩沖液和2.5倍緩沖溶液體積的二硫蘇糖醇，DNA復制反應體系中雙酶切緩沖液的體積分數(shù)為50%。
7.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于:所述的猝滅劑中甲酰胺的體積分數(shù)為80%、乙二胺四乙酸二鈉的濃度為200 mM，猝滅劑的pH值為8.0。
8.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于:所述的聚丙烯酰胺凝膠為體積分數(shù)為12%~20%的變性聚丙烯酰胺凝膠。
【文檔編號】C12Q1/68GK104032030SQ201410316151
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年7月4日 優(yōu)先權日:2014年7月4日
【發(fā)明者】周翔, 王少儒, 田沺, 王佳琪, 翁小成 申請人:武漢大學