擬香味類(lèi)香味菌及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種擬香味類(lèi)香味菌T45菌株及其制備方和用途，本發(fā)明提供的擬香味類(lèi)香味菌T45菌株產(chǎn)揮發(fā)性抑菌物質(zhì)，對(duì)煙草赤星病菌有抑制生長(zhǎng)的作用，主要通過(guò)抑制分生孢子形成、孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)以及破壞菌絲形態(tài)的方式。CGMCC No.91162014.04.30
【專(zhuān)利說(shuō)明】擬香味類(lèi)香味菌及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物菌種【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是一種擬香味類(lèi)香味菌，及其制備方法和應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 鏈格抱菌（Alternaria alternate (Fries) Keissler)是一類(lèi)重要的植物病原菌， 寄主范圍廣，危害重，其引起的煙草赤星病是煙葉成熟后期重要的葉部病害，在我國(guó)各煙區(qū) 均有發(fā)生，直接影響了煙葉的產(chǎn)量和質(zhì)量。關(guān)于煙草赤星病的防治，目前國(guó)內(nèi)主要以化學(xué)防 治為主，但使用化學(xué)農(nóng)藥防治赤星病既導(dǎo)致農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染，又可引起病菌產(chǎn)生抗藥性 以及嚴(yán)重的煙株藥害。生物防治由于其對(duì)環(huán)境友好而被認(rèn)為是替代化學(xué)殺菌劑防治植物病 害的良好途徑，因此生防資源的篩選、利用和創(chuàng)新對(duì)于植物病害的生物防治具有重要意義。
[0003] 微生物代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性產(chǎn)物常具有抑菌、防病或兼具促生及誘導(dǎo)抗性等作 用，是一類(lèi)重要的生防資源。McCain于1966年最早報(bào)道了灰色鏈霉菌（Streptomyces griseus)對(duì)Gleospriumaridum孢子形成具有抑制作用；Chen等研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)產(chǎn)生的揮發(fā)物能強(qiáng)烈抑制灰霉病菌（Botrytis cinerea)孢子萌發(fā) 和萌發(fā)管伸長(zhǎng)；Koitabashi分離到的Irpexlacteus產(chǎn)生的揮發(fā)物對(duì)Oiduim sp.引起的溫 室歐療白粉病防治效果良好；Zhang等發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)GB03的揮 發(fā)物能通過(guò)增強(qiáng)擬南芥（Arabidopsis)的光合作用對(duì)其產(chǎn)生促生作用。與非揮發(fā)性抗菌物 質(zhì)相比，揮發(fā)性抗菌物質(zhì)具有滲透力強(qiáng)、分布均勻等優(yōu)點(diǎn)，防治作物病害效果更為突出、應(yīng) 用領(lǐng)域更為廣闊；已有研究表明，包括真菌、細(xì)菌在內(nèi)的很多微生物都能產(chǎn)生揮發(fā)性抗菌物 質(zhì)。
[0004] 生物防治由于其對(duì)環(huán)境友好，且具有良好的防治效果，近年來(lái)成為防治植物病害 的研究熱點(diǎn)。拮抗微生物是一類(lèi)重要的生防資源，其產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)主要包括非揮發(fā)性代 謝產(chǎn)物和揮發(fā)性代謝產(chǎn)物兩種。目前，對(duì)于煙草赤星病菌的生物防治大多集中在產(chǎn)非揮發(fā) 性抗菌物質(zhì)微生物的篩選和利用，而對(duì)于產(chǎn)揮發(fā)性抗煙草赤星病菌代謝產(chǎn)物微生物的研究 則較少。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種擬香味類(lèi)香味菌，對(duì)煙草赤星病有較好的 抑制和治療效果。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：一種擬香味類(lèi)香味菌 (Myroidesodoratimimus)的T45菌株，2014年4月30日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理 委員會(huì)普通微生物中心，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏號(hào)為CGMCC9116。
[0007] -種如上所述擬香味類(lèi)香味菌T45菌株的制備方法，包括以下步驟：
[0008] (1)取煙草根際土壤，加入蒸餾水，搖動(dòng)片刻，吸取上層液加入到無(wú)菌水中，制成懸 液；
[0009] (2)取步驟（1) 土壤懸濁液滴加到含2?5%利福平的LB固體培養(yǎng)基平板上，用 涂布棒均勻涂布，并將培養(yǎng)基倒置于28°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1?2天。
[0010] 優(yōu)選的，所述LB固體培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉 10g/L和瓊脂粉15g/L。
[0011] 優(yōu)選的，（3)步驟（2)培養(yǎng)液涂布于LB固體培養(yǎng)基上28°C培養(yǎng)24h活化，劃線于 LB肉湯培養(yǎng)液中28°C，150rpm震蕩培養(yǎng)24h。
[0012] -種如上所述擬香味類(lèi)香味菌T45菌株在對(duì)煙草赤星病菌的抑制方面的應(yīng)用。
[0013] 優(yōu)選的，包括以下步驟：
[0014] ①.T45菌株的培養(yǎng)：取煙草根際土壤，加入蒸餾水，搖動(dòng)片刻，吸取上層液加入到 無(wú)菌水中，制成懸液；取土壤懸濁液滴加到含2?5%利福平的LB固體培養(yǎng)基平板上，用涂 布棒均勻涂布，并將培養(yǎng)基倒置于28°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1?2天；分離到67株細(xì)菌，編號(hào) T1-T67,涂布于LB培養(yǎng)基上28°C培養(yǎng)24h活化，劃線獲得單菌落，挑取單菌落于LB肉湯培 養(yǎng)液中28°C，150rpm震蕩培養(yǎng)24h ;
[0015] ②.病原菌培養(yǎng)：煙草赤星病菌邊緣的菌絲塊置于新鮮PDA培養(yǎng)基上25°C培養(yǎng)7d 進(jìn)行活化；
[0016] ③.接種：在步驟②長(zhǎng)滿煙草赤星病菌的培養(yǎng)基上獲得菌絲塊，將其接種到PDA 培養(yǎng)基平板上25°C培養(yǎng)12h ;吸取步驟①細(xì)菌培養(yǎng)液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基平板上；將 PDA培養(yǎng)基平板對(duì)扣置于LB固體培養(yǎng)基平板上方，并用封口膜密封兩塊平板邊緣，于25°C 下培養(yǎng)5-7天。
[0017] 優(yōu)選的，所述LB固體培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉 10g/L和瓊脂粉15g/L。
[0018] 優(yōu)選的，所述PDA培養(yǎng)基組成為：馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂15克和水1000 暈升。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：擬香味類(lèi)香味菌T45菌株產(chǎn)生的揮發(fā)性 代謝物能強(qiáng)烈抑制煙草赤星病菌的生長(zhǎng)，主要通過(guò)抑制分生孢子形成、孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng) 以及破壞菌絲形態(tài)的方式。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1為煙草根際細(xì)菌對(duì)煙草赤星病菌生長(zhǎng)不同抑制率的數(shù)量統(tǒng)計(jì)；
[0021] 圖2為細(xì)菌T45基于16S rDNA基因序列的分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；
[0022] 圖3為T(mén)45對(duì)煙草赤星病菌的抑制作用圖；
[0023] 圖片依從上至下從左至右排列順序編號(hào)為A :正常生長(zhǎng)的煙草赤星病菌，B :揮發(fā) 物作用下赤星病菌生長(zhǎng)緩慢，C :正常的孢子和菌絲，D :揮發(fā)物處理后，未見(jiàn)分生孢子，E :掃 描電鏡下正常的菌絲和孢子，F(xiàn) :揮發(fā)物處理后未見(jiàn)分生孢子，菌絲斷裂、表面皺縮，G :對(duì)照 分生孢子正常萌發(fā)長(zhǎng)成菌落，H :分生孢子萌發(fā)受揮發(fā)物抑制，未見(jiàn)菌落形成。
[0024] 圖4為T(mén)45產(chǎn)生的3種揮發(fā)物對(duì)煙草赤星病菌的抑制作用圖
[0025] 其中，圖片依從左至右排列順序?yàn)樗愇齑?、異丁酸、異戊酸?duì)病原菌的作用效 果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，本部分的描述僅是示范性和解釋 性，不應(yīng)對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍有任何的限制作用。
[0027] 實(shí)施例1
[0028] 培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，水1000mL。
[0029] LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，瓊脂15g，水1000mL。
[0030] 供試病原菌：煙草赤星病菌（Alternaria alternate)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研 究所植?？剖姨峁?。試驗(yàn)前，挑取冰箱中保存的病原菌邊緣的菌絲塊置于新鮮PDA培養(yǎng)基 上25°C培養(yǎng)7d進(jìn)行活化。
[0031] 供試細(xì)菌菌株：采用土壤稀釋法，從湖南省采集到的煙草根際土壤中分離到67株 細(xì)菌，編號(hào)T1-T67，-20°C甘油保存。使用前，吸取剛解凍的細(xì)菌培養(yǎng)液涂布于LB培養(yǎng)基上 28°C培養(yǎng)24h活化，劃線獲得單菌落。對(duì)扣試驗(yàn)前，挑取單菌落于LB肉湯培養(yǎng)液中28°C， 150rpm震蕩培養(yǎng)24h。
[0032] 實(shí)施例2拮抗細(xì)菌初篩
[0033] 用平板對(duì)扣法測(cè)試67株細(xì)菌對(duì)煙草赤星病菌的抑制作用。用直徑5_打孔器在 長(zhǎng)滿煙草赤星病菌的培養(yǎng)基上打孔獲得菌絲塊，將其接種到新的PDA平板上25°C培養(yǎng)12h， 使其固著在培養(yǎng)基上。吸取震蕩培養(yǎng)24h的細(xì)菌培養(yǎng)液100 μ L均勻涂布于LB平板上，將 含有赤星病菌的PDA平板對(duì)扣置于LB平板上方，并用Parafilm封口膜密封。以未涂布菌液 的LB平板作為對(duì)照。將不同處理的對(duì)扣平板用保鮮袋密封，于25°C下培養(yǎng)5-7天，至對(duì)照 組赤星病菌菌絲長(zhǎng)滿2/3平板時(shí)，用十字交叉法測(cè)量赤星病菌菌落直徑，計(jì)算細(xì)菌揮發(fā)物 質(zhì)對(duì)其抑制率。每個(gè)處理5個(gè)平板，實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。選取抑制率最高的菌株進(jìn)行下一步研 究。
[0034] 生長(zhǎng)抑制率（％ )=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑X 100 %
[0035] 從煙草根際土壤中分離獲得67株細(xì)菌，平板對(duì)扣試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，分離細(xì)菌所產(chǎn)揮發(fā)物 對(duì)煙草赤星病菌產(chǎn)生不同程度的抑制作用（圖1)。42株細(xì)菌對(duì)赤星病菌的抑制率達(dá)30%以 上，19株細(xì)菌的抑制率達(dá)到50%以上，4株細(xì)菌抑制率達(dá)70%以上，分別為T(mén)46 (71. 19% )、 Τ57(72·83% )、Τ64(76·56% )、Τ45(78·89% )，選取抑制率最高的菌株T45做進(jìn)一步研究。
[0036] 實(shí)施例3細(xì)菌的16S rDNA鑒定
[0037] 采用16S rDNA序列測(cè)定以及構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)的方法對(duì)篩得的高抑制率細(xì)菌進(jìn)行 分子鑒定。利用細(xì)菌基因組提取試劑盒（上海生工）提取細(xì)菌基因組DNA，以此為模 板，用弓丨物 27F : (5,-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGCT-3'）和 1492R : (5, -TACGGCTACCT TGTTACGACTTCACCCC-3'）對(duì)菌株16SrDNA進(jìn)行擴(kuò)增。獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送往生工生 物工程上海有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，見(jiàn)下方序列表。測(cè)序結(jié)果于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST 同源性比對(duì)分析，用ClustalL 83進(jìn)行多重序列對(duì)比，用Mega4. 0中Neighbor-Joining法 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
[0038] GCCAACCGGCAGCTACACATGCAAGTCGAGGGGTAGAAAGAGCTTGCTTTTTTGAGACCGGCGCACGGG TGAGTAACGCGTATGCAACCTACCTTATACAGGGGAATAGCCCGAAGAAATTCGGATTAATGCTCCATGGTTTATCG ATATGGCATCGTATTGATAATAAAGATTTATCGGTATAAGATGGGCATGCGTATCATTAGCTAGTTGGTGTGGTAAC GGCATACCAAGGCAACGATGATTAGGGGTCCTGAGAGGGAGATCCCCCACACTGGTACTGAGACACGGACCAGACTC CTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGAGGCAACTCTGAACCAGCCATGCCGCGTGCAGGATGACGGT CCTATGGATTGTAAACTGCTTTTGTACAGGAAGAAACCTCCCTACGAGTAGGGACTTGACGGTACTGTAAGAATAAG GATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATCCGAGCGTTATCCGGAATTATTGGGTTTAAAGGG TTCGTAGGCGGCTTTGTAAGTCAGTGGTGAAATTTCCTAGCTTAACTAGGACACTGCCATTGATACTGCAGAGCTTG AATAATATGGAAGTAACTAGAATATGTAGTGTAGCGGTGAAATGCTTAGATATTACATGGAATACCAATTGCGAAGG CAGGTTACTACGTATTTATTGACGCTGATGAACGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAC GCCGTAAACGATGGATACTAGCTGTTCGGTTTTCGGACTGAGTGGCTAAGCGAAAGTGATAAGTATCCCACCTGGGG AGTACGTTCGCAAGAATGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAT GATACGCGAGGAACCTTACCAGGGCTTAAATGTAGATTGACAGATTTGGAAACAGATTTTTCTTCGGACAATTTACA AGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTCAGGTTAAGTCCTATAACGAGCGCAACCCCTATTGTT AGTTACCAGCGCGTAGTGGCGGGGACTCTAGCAAGACTGCCGGTGCAAACCGTGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAA TCATCACGGCCCTTACGTCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCAAGTACAGAAAGCAGCTACCTGGCAACAGGAT GCGAATCTCCAAAGCTTGTCTCAGTTCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCTATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCG GATATCAGCCATGATCCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCCATGGAAGCTGGGGGTAC CTGAAGTCGGTGACCGCAAGGAGCTGCCTAGGGTAAAGCTTG
[0039] 提取細(xì)菌基因組DNA，擴(kuò)增后送測(cè)序獲得其16S rDNA序列，提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行 比對(duì)，其序列與擬香味類(lèi)香味菌（Myroidesodoratimimus)相似性達(dá)99%，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化 樹(shù)，如圖2所示，確定其分類(lèi)地位為擬香味類(lèi)香味菌，獲得Genbank登錄號(hào)KF758445。
[0040] 實(shí)施例4篩得細(xì)菌對(duì)煙草赤星病菌的抑制作用
[0041] 對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響：將獲得的高抑制率細(xì)菌按1. 3中方法與煙草赤星病菌對(duì)扣培 養(yǎng)至對(duì)照組病菌菌絲長(zhǎng)至2/3平板。從培養(yǎng)平板邊緣切取病原菌菌落，3%戊二醛固定4h， 0. IM磷酸緩沖液漂洗。1 %鋨酸固定90min，0. IM磷酸緩沖液漂洗，酒精梯度脫水，在30%、 50%、70%、80%、100%依次脫水，其中100%酒精2次，每次1011^11。乙酸異戊脂置換，50% 一次，100%兩次。Eiko公司XD-I型二氧化碳臨界點(diǎn)干燥器干燥，Eiko公司IB-3型離子鍍 金儀噴金鍍膜。JEOL公司JSM-840掃描電鏡觀察。同時(shí)，用無(wú)菌接種針挑取邊緣菌絲均勻 涂布于無(wú)菌載玻片中央的無(wú)菌水中，光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)變化，每個(gè)處理至少觀察5 個(gè)視野。
[0042] 對(duì)分生孢子的影響：接種煙草赤星病菌在PDA培養(yǎng)基上26°C培養(yǎng)5?7d，用無(wú)菌 水洗下，3000r/min離心3min去除菌絲，取上清液即為孢子懸液，稀釋至濃度為102個(gè)/mL。 吸取100 μ L孢子懸液均勻涂布于PDA培養(yǎng)基上，將篩得細(xì)菌的培養(yǎng)液涂布于LB平板上，兩 平板按按1. 3中方法進(jìn)行對(duì)扣培養(yǎng)，以不接種細(xì)菌的LB平板作為對(duì)照。
[0043] 如圖3所示的菌株T45對(duì)煙草赤星病菌的抑制效果圖。培養(yǎng)5d時(shí)，對(duì)照組煙草赤 星病菌長(zhǎng)滿2/3皿（圖3-A)，而與T45菌株對(duì)扣培養(yǎng)的PDA平板中，赤星病菌生長(zhǎng)緩慢，菌 落呈黃白色，抑制效果明顯（圖3-B)。挑取兩培養(yǎng)皿中病原菌邊緣菌絲于顯微鏡下鏡檢觀 察，發(fā)現(xiàn)對(duì)照赤星病菌產(chǎn)生大量分生孢子，菌絲透明均勻細(xì)長(zhǎng)（圖3-C)，而經(jīng)揮發(fā)物處理的 赤星病菌在鏡檢時(shí)未發(fā)現(xiàn)有分生孢子，由于放大倍數(shù)較低菌絲形態(tài)變化不直觀（圖3-D)。 掃描電鏡鏡檢則可以明顯觀察到正常生長(zhǎng)的赤星病菌孢子呈倒棒錘形，菌絲細(xì)長(zhǎng)均勻、表 面光滑（圖3-E)，揮發(fā)物處理后則觀察不到任何孢子，菌絲斷裂、表面發(fā)生皺縮，菌絲形態(tài) 遭到破壞（圖3-F)。孢子涂布實(shí)驗(yàn)顯示對(duì)照孢子萌發(fā)長(zhǎng)成菌落（圖3-G)，而經(jīng)揮發(fā)物處理 的平板上無(wú)菌落形成（圖3-F)，說(shuō)明揮發(fā)物對(duì)病菌孢子萌發(fā)也具有一定抑制作用。因此，菌 株T45產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)主要通過(guò)抑制煙草赤星病菌孢子產(chǎn)生、孢子萌發(fā)，菌絲生長(zhǎng)以及 破壞菌絲形態(tài)的方式對(duì)病原菌產(chǎn)生抑制作用。
[0044] 實(shí)施例5揮發(fā)性抑菌物質(zhì)的GC/MS分析
[0045] 利用頂空固相微萃取-氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定細(xì)菌產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物。在 15mL頂空樣品瓶中加入9ml細(xì)菌培養(yǎng)液和0. Ig硫酸鈉，放入磁力攪拌子，將小瓶固定在恒 溫水浴池中，將75 μ m CAR/PDMS纖維頭穿透樣品瓶膠塞，壓下活塞使纖維頭伸出不銹鋼套 管暴露于樣品上層空氣中，于50°C中速磁力攪拌平衡lh，以LB培養(yǎng)液的揮發(fā)物作為對(duì)照。 萃取后，迅速將纖維頭縮回并拔出針頭，立即插入氣相色譜的氣化室，推出纖維，250°C解吸 2min。GC/MS條件參考文獻(xiàn)中做法。采用NIST08譜庫(kù)進(jìn)行檢索，相似度> 80%鑒定為同種 化合物。
[0046] 實(shí)施例6化合物單體試驗(yàn)
[0047] 根據(jù)GC/MS分析結(jié)果，購(gòu)買(mǎi)相應(yīng)化合物的純品試劑，用分隔平板法測(cè)試其對(duì)煙草 赤星病菌的抑制效果：在一個(gè)兩分格的塑料平板中一側(cè)倒入PDA培養(yǎng)基，接種直徑為5mm的 赤星病菌菌餅，另一側(cè)加入100 μ L純品試劑，以無(wú)菌水作為對(duì)照。封口膜密封，置于25°C培 養(yǎng)5-7天至對(duì)照組菌絲長(zhǎng)滿2/3平板，用十字交叉法計(jì)算生長(zhǎng)抑制率。
[0048] 用SPME-GC/MS對(duì)菌株T45以及LB液體培養(yǎng)基產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物進(jìn)行分析。所 得質(zhì)譜圖經(jīng)NIST08質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索并與標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)比，在T45揮發(fā)物中共鑒定出24種化 合物，對(duì)照中檢出19種化合物，分別屬于醛類(lèi)、酮類(lèi)、烷烴類(lèi)、醚類(lèi)、醇類(lèi)、酯類(lèi)、酸類(lèi)物質(zhì)， 其中十六酸和十八酸在T45和對(duì)照中含量均較高，因此共選定僅在T45中檢出的化合物以 及十六酸和十八酸，購(gòu)買(mǎi)其純品試劑進(jìn)行測(cè)試。除6種未獲得純品試劑外，共測(cè)試了 10種 揮發(fā)物對(duì)煙草赤星病菌的抑菌效果（表1)。由于十五酸、十六酸、十八酸為固體，故用甲醇 溶解后配成lOmg/mL的溶劑進(jìn)行試驗(yàn)。在測(cè)試的十種化合物中異戊醇、異丁酸、異戊酸對(duì)病 原菌的作用效果十分顯著，幾乎完全抑制了病原菌的生長(zhǎng)（圖4)，苯甲醇對(duì)病原菌具有顯 著抑制作用，而八甲基環(huán)四硅氧烷、2_十三烷酮、δ-十二內(nèi)酯則無(wú)明顯抑菌活性。
[0049] 表1細(xì)菌揮發(fā)物純品的抑菌作用
[0050]

【權(quán)利要求】
1. 一種擬香味類(lèi)香味菌（Myroidesodoratimimus)的T45菌株，2014年4月30日保藏 于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3 號(hào)，保藏號(hào)為CGMCC9116。
2. -種如權(quán)利要求1所述擬香味類(lèi)香味菌T45菌株的制備方法，包括以下步驟： (1) 取煙草根際土壤，加入蒸餾水，搖動(dòng)片刻，吸取上層液加入到無(wú)菌水中，制成懸液； (2) 取步驟（1) 土壤懸濁液滴加到含2?5%利福平的LB固體培養(yǎng)基平板上，用涂布 棒均勻涂布，并將培養(yǎng)基倒置于28°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1?2天。
3. 如權(quán)利要求2所述制備方法，其特征在于：所述LB固體培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨 l〇g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L和瓊脂粉15g/L。
4. 如權(quán)利要求2所述制備方法，其特征在于：（3)步驟（2)培養(yǎng)液涂布于LB固體培養(yǎng) 基上28°C培養(yǎng)24h活化，劃線于LB肉湯培養(yǎng)液中28°C，150rpm震蕩培養(yǎng)24h。
5. -種如權(quán)利要求1所述擬香味類(lèi)香味菌T45菌株在對(duì)煙草赤星病菌的抑制方面的應(yīng) 用。
6. 如權(quán)利要求5所述應(yīng)用，包括以下步驟： ① .T45菌株的培養(yǎng)：取煙草根際土壤，加入蒸餾水，搖動(dòng)片刻，吸取上層液加入到無(wú) 菌水中，制成懸液；取土壤懸濁液滴加到含2?5%利福平的LB固體培養(yǎng)基平板上，用涂 布棒均勻涂布，并將培養(yǎng)基倒置于28°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1?2天；分離到67株細(xì)菌，編號(hào) T1-T67,涂布于LB培養(yǎng)基上28°C培養(yǎng)24h活化，劃線獲得單菌落，挑取單菌落于LB肉湯培 養(yǎng)液中28°C，150rpm震蕩培養(yǎng)24h ; ② .病原菌培養(yǎng)：煙草赤星病菌邊緣的菌絲塊置于新鮮PDA培養(yǎng)基上25°C培養(yǎng)7d進(jìn) 行活化； ③ .接種：在步驟②長(zhǎng)滿煙草赤星病菌的培養(yǎng)基上獲得菌絲塊，將其接種到PDA培養(yǎng)基 平板上25°C培養(yǎng)12h ;吸取步驟①細(xì)菌培養(yǎng)液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基平板上；將PDA培 養(yǎng)基平板對(duì)扣置于LB固體培養(yǎng)基平板上方，并用封口膜密封兩塊平板邊緣，于25°C下培養(yǎng) 5-7 天。
7. 如權(quán)利要求6所述應(yīng)用，其特征在于：所述LB固體培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨10g/L、 酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L和瓊脂粉15g/L。
8. 如權(quán)利要求6所述應(yīng)用，其特征在于：所述PDA培養(yǎng)基組成為：馬鈴薯200克、葡萄 糖20克、瓊脂15克和水1000毫升。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK104263668SQ201410318125
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月22日
【發(fā)明者】孔凡玉, 黃樹(shù)立, 游偲, 李錫宏, 張成省, 李青誠(chéng), 陳德鑫, 高加明, 馮超, 王靜 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所, 中國(guó)煙草總公司湖北省公司