一種檢測(cè)黃曲霉及煙曲霉的通用引物及實(shí)時(shí)熒光tHDA試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測(cè)煙曲霉及黃曲霉的通用引物及實(shí)時(shí)熒光tHDA試劑盒。本發(fā)明的檢測(cè)煙曲霉及黃曲霉的通用引物能夠同時(shí)檢測(cè)擴(kuò)增出煙曲霉及黃曲霉，同時(shí)結(jié)合了實(shí)時(shí)熒光tHDA技術(shù)，較其他普通的PCR相比，能夠在恒溫下進(jìn)行擴(kuò)增，省去了變性、退火、延伸等步驟，直接模擬生物體環(huán)境進(jìn)行解旋擴(kuò)增，有利于簡(jiǎn)化設(shè)備，利于在基層推廣。使用本發(fā)明的試劑盒，其檢測(cè)限可達(dá)到104copies(拷貝)/ml，可用于臨床。能夠檢測(cè)出臨床上最常見的兩種曲霉菌感染，不但為臨床節(jié)省大量寶貴的搶救時(shí)間，而且成本低廉、操作方便，具有廣闊的運(yùn)用前景。
【專利說(shuō)明】-種檢測(cè)黃曲霉及煙曲霉的通用引物及實(shí)時(shí)熒光tHDA試 劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于體外診斷核酸檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種在臨床樣本中檢測(cè)煙曲霉和黃 曲霉感染的熒光tHDA(熱穩(wěn)定解旋酶依賴性恒溫?cái)U(kuò)增）試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，隨著腫瘤患者的增多、化療藥物、免疫抑制劑和廣譜抗生素的廣泛使用， 特別的是在惡性血液性疾病、骨髓移植中，侵襲性真菌感染的發(fā)生率明顯增高，曲霉菌感染 是僅次于念珠菌感染的侵襲性真菌感染且逐年上升。有研究表明肺部曲霉菌感染的病死率 為40%，泛發(fā)性曲霉感染為病死率為90%。在反復(fù)運(yùn)用氟康唑預(yù)防真菌感染的尸檢病例中 曲霉已成為首要的致病囷，而在惡性血液病患者尸檢中發(fā)現(xiàn)曲霉囷感染率商達(dá)30%。在中 國(guó)大陸的一項(xiàng)統(tǒng)計(jì)資料表明，在侵襲性曲霉感染中，煙曲霉與黃曲霉占86. 82%，成為曲霉 菌感染的主要病原菌（高露娟，余進(jìn)，李若瑜.中國(guó)大陸地區(qū)曲霉病流行現(xiàn)狀分析[J]. 中國(guó)真菌學(xué)雜志，2010, 04:247-251)。
[0003] 對(duì)于侵襲性曲霉感染，早期診斷不僅能夠減少病死率，而且能夠減少醫(yī)療費(fèi)用及 住院天數(shù)，而目前，侵襲性曲霉菌感染的診斷主要依賴于傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室診斷方法，包括：直 接涂片鏡檢、傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法、組織病理學(xué)方法、影像學(xué)方法、血清學(xué)方法等，然而這些方 法，每種方法均存在缺乏敏感性或特異性，而不能滿足臨床診療的需要。因此，以基因組DNA 為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)診斷方法倍受關(guān)注，成為國(guó)內(nèi)外研究者的探索熱點(diǎn)。近來(lái)，研究人員報(bào) 道了許多應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)（Real-time PCR)檢測(cè)致病性真菌的特異核酸序列的研 究，提出了實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法可以很好地用來(lái)快速準(zhǔn)確地診斷侵襲性真菌感染。然而， 實(shí)踐表明，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法存在著一些不足之處，例如：1)須要昂貴的PCR儀，尤其 是實(shí)時(shí)熒光PCR儀造價(jià)不菲；2)多種因素影響擴(kuò)增效果；3)常引起非特異性擴(kuò)增，難以在 基層推廣應(yīng)用等，亟待更新的方法來(lái)替代。
[0004] 解旋酶依賴性恒溫核酸擴(kuò)增（helicase dependent amplification, HDA)，其原理 是根據(jù)解旋酶在ATP存在下能夠解開DNA雙鏈，隨后兩條特異性引物結(jié)合于單鏈DNA并在 DNA聚合酶的作用下催化合成雙鏈，并將此次合成的DNA雙鏈作為模版依次擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)指數(shù) 倍的擴(kuò)增。采用研究表明，HDA能很好地?cái)U(kuò)增微生物基因組DNA、質(zhì)粒DNA和cDNA等。目 前根據(jù)所采用的解旋酶的不同，可以分為1、室溫HDA，采用大腸桿菌解旋酶和Mutl蛋白在 常溫下即可；2、熱穩(wěn)定 HDA (thermophilic helicase dependent amplification，tHDA)，從 嗜熱桿菌中提取的熱穩(wěn)定解旋酶，此過(guò)程較室溫HDA相比不需要Mutl蛋白及單鏈結(jié)合蛋白 (SSB)。本發(fā)明是采用tHDA作為擴(kuò)增方法，在較高的溫度下擴(kuò)增反應(yīng)可以減少非特異性擴(kuò) 增，同時(shí)更有利于解旋酶進(jìn)行DNA解旋（CN03824150. 1)。
[0005] 作為一種嶄新的核酸擴(kuò)增方法，與普通PCR技術(shù)相比，該方法具有不需要經(jīng)過(guò)變 性-退火-延伸的多次循環(huán)擴(kuò)增，可以簡(jiǎn)化設(shè)備、降低成本更有利于在偏遠(yuǎn)地區(qū)的推廣運(yùn)用 的巨大優(yōu)勢(shì)。另外，較其他常見的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)也具有相應(yīng)優(yōu)勢(shì)，如：鏈替換擴(kuò)增（SDA)需 要4條引物來(lái)實(shí)現(xiàn)早期擴(kuò)增，轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增（TMA)在轉(zhuǎn)錄、cDNA合成以及RNA降解過(guò)程 需要三種酶來(lái)實(shí)現(xiàn)恒溫的擴(kuò)增。
[0006] 實(shí)時(shí)熒光tHDA是tHDA技術(shù)與熒光定量技術(shù)的結(jié)合。僅利用tHDA擴(kuò)增技術(shù)對(duì)終 產(chǎn)物進(jìn)行定性或定量分析，無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，而實(shí)時(shí)熒光tHDA技術(shù)利用熒光信號(hào) 的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)HDA擴(kuò)增反應(yīng)中每一循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過(guò)Ct值及其標(biāo)準(zhǔn)曲線的分 析能夠?qū)ζ鹗寄０暹M(jìn)行定量分析。但是，目前國(guó)際上對(duì)tHDA擴(kuò)增技術(shù)處于起步階段，雖現(xiàn) 有利用tHDA擴(kuò)增技術(shù)運(yùn)用于曲霉菌的檢測(cè)（王小婷.解旋酶依賴性DNA恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)用 于黃曲霉檢測(cè)的研究[D].福建醫(yī)科大學(xué)，2012.)，但其敏感性較低，并且無(wú)法定量分析起 始模板，目前國(guó)內(nèi)外尚未有將實(shí)時(shí)熒光tHDA技術(shù)運(yùn)用于曲霉菌的檢測(cè)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對(duì)上述問題，本發(fā)明首次建立起一種快速檢測(cè)曲霉菌的實(shí)時(shí)熒光tHDA技術(shù)，從 而更有利于建立簡(jiǎn)單便捷的臨床和實(shí)驗(yàn)室診斷，也使對(duì)于基因?qū)用娴拇才詸z驗(yàn)成為可能。
[0008] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一組作為引物使用的，能夠同時(shí)檢測(cè)出煙曲霉及黃曲霉 的寡核苷酸序列。
[0009] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種既快速、準(zhǔn)確，又易于標(biāo)準(zhǔn)化的能夠檢測(cè)煙曲霉 及黃曲霉的實(shí)時(shí)熒光定量tHDA試劑盒。
[0010] 具體而言，一方面，本發(fā)明提供一組檢測(cè)曲霉菌的引物，該組引物包括序 列表SEQ ID N0 :1和SEQ ID N0 :2所示的寡核苷酸序列。其中，擴(kuò)增檢測(cè)曲霉 菌的正向引物為：TGCATTTAATAGCAATGCACGATAC ;擴(kuò)增檢測(cè)曲霉菌的反向引物為： CAAAGTAAGGAGCGAAAGGTAATCTA 〇
[0011] 為解決所述第二個(gè)技術(shù)問題，本發(fā)明采用的檢測(cè)曲霉菌的實(shí)時(shí)熒光tHDA試劑盒， 保存于-20°C。包括DNA提取劑，tHDA反應(yīng)液，酶混合物，dNTP，熒光染料：包括EvaGreen Dye和ROX reference Dye (其為市售染料名稱，目前尚無(wú)統(tǒng)一中文譯文）；滅菌純水；陰性 對(duì)照：無(wú)插入有特異性片段的PUC18-T載體質(zhì)粒；陽(yáng)性對(duì)照：含有煙曲霉或黃曲霉DNA樣 本；標(biāo)準(zhǔn)品：含有插入有曲霉的特異性片段的PUC18-T載體質(zhì)粒。本發(fā)明將采用EvaGreen Dye作為實(shí)時(shí)熒光定量的染料，該染料與常用的熒光定量染料相比，具有良好的穩(wěn)定性，對(duì) 擴(kuò)增反應(yīng)的抑制性也小。
[0012] 所述的標(biāo)準(zhǔn)品為含有插入曲霉菌特異序列的PUC18-T載體質(zhì)粒，所插入的序列如 下：
[0013] GATGGCTACAGCTTTCTTAGGTTATGTTTTACCTTATGGTCAAATGAGTTTATGAGGTGCTACAGTTAT TACTAATCTTATGAGTGCTATACCTTGAATAGGTCAAGATATAGTTGAATTTATATGAGGTGGTTTCTCTGTAAATA ATGCTACATTAAATAGATTCTTTGCATTACATTTCTTATTACCTTTTGTTTTAGCTGCATTAGTAATAATGCATTTA ATAGCAATGCACGATACTGTAGGATCTGGTAATCCTTTAGGTATTTCTGGTAATTATGATAGATTACCTTTCGCTCC TTACTTTGTATTTAAAGATTTAGTTACTGTATTTATTTTCTTTATAGTATTATCTGTATTTGTATTCTTCATGCCTA ACGCATTAGGTGATAGTGAAAATTATGTTATGGCTAATCCAATGCAAACTCCACC
[0014] 所插入的DNA序列為采用正向引物序列（GATGGCTACAGCTTTCTTAGGT)、反向引物序 列（GGTGGAGTTTGCATTGGATTAG)為擴(kuò)增引物，并以煙曲霉DNA為模板進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增所 得擴(kuò)增產(chǎn)物。該擴(kuò)增產(chǎn)物包含有以通用引物tHDA擴(kuò)增的特異性DNA序列。標(biāo)準(zhǔn)品制備方 法是將擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳并利用微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行回 收。然后回收產(chǎn)物lul加入至50 μ 1感受態(tài)細(xì)胞中冰浴30分鐘。然后42°C熱擊45秒，迅 速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中，冰上靜置2-3分鐘。加入450 μ 1無(wú)菌的LB培養(yǎng)基，混勻后置于 37°C搖床，150轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)45分鐘，使菌體復(fù)蘇。取適量已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，加到 含有X-Gal、IPTG和Amp的LB固體培養(yǎng)基上，用無(wú)菌的涂布棒將細(xì)胞均勻涂開，將平板置于 37°C，直至液體被吸收后，倒置培養(yǎng)，37°C培養(yǎng)12-16小時(shí)。挑選白色菌落進(jìn)行進(jìn)一步增殖 培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并通過(guò)PCR反應(yīng)鑒定及測(cè)序驗(yàn)證，再用紫外分光光度計(jì)定量并-20°C保存作 為標(biāo)準(zhǔn)品。
[0015] 所述的標(biāo)準(zhǔn)品為稀釋濃度IX 108拷貝（copies)/ml、IX 107拷貝/ml、IX 106拷貝 /ml、IX 105 拷貝 /ml、IX 104 拷貝 /ml 及 IX 103 拷貝 /ml ;
[0016] 所述的陰性對(duì)照品為無(wú)插入的曲霉菌的序列的載體質(zhì)粒。
[0017] 二、試劑盒的試劑組成成分：
[0018] 1. DNA 提取試劑：Buffer I、Buffer II、Buffer III、溶壁酶（Lyticase)、蛋白酶 K ;
[0019] 2. tHDA反應(yīng)液，其中包括：tHDA緩沖液、MgS04、NaCl、dNTP、引物I、引物II ;其中 所述的引物I的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1所示，引物II的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0 :2 所示；
[0020] 3.酶混合物，其中包括：熱穩(wěn)定DNA解旋酶，Bst聚合酶和極高熱穩(wěn)定性單鏈結(jié)合 蛋白；
[0021] 4.突光染料：包括 EvaGreen Dye 和 ROX reference Dye ;
[0022] 5.陰性對(duì)照：無(wú)插入曲霉的特異性片段的pUC18-T載體質(zhì)粒；
[0023] 6.陽(yáng)性對(duì)照：為含有煙曲霉或黃曲霉DNA樣本；
[0024] 7.標(biāo)準(zhǔn)品：為插入有曲霉的特異性片段的pUC18-T載體質(zhì)粒；
[0025] 8.滅菌純水；
[0026] 三、根據(jù)本發(fā)明提供的試劑盒，對(duì)人血流感染的曲霉菌感染進(jìn)行檢測(cè)，該方法步驟 包括：
[0027] 1.用DNA提取試劑進(jìn)行待測(cè)樣本的DNA提??；
[0028] 2.將提取的DNA和定量標(biāo)準(zhǔn)品加入到含有tHDA反應(yīng)液中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光tHDA擴(kuò) 增，使用實(shí)時(shí)熒光PCR儀進(jìn)行檢測(cè)；
[0029] 3.利用定量標(biāo)準(zhǔn)品制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線通過(guò)軟件分析確定待測(cè)樣品對(duì)應(yīng)濃度。
[0030] 本發(fā)明中所指的曲霉菌為煙曲霉和黃曲霉。
[0031] 本發(fā)明中通過(guò)對(duì)不同的真菌及臨床上常見的細(xì)菌進(jìn)行了特異性分析，結(jié)果顯示具 有良好的特異性。
[0032] 本發(fā)明通過(guò)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋分析，可以達(dá)到104拷貝/ml。
[0033] 本發(fā)明是采用了實(shí)時(shí)熒光tHDA方法檢測(cè)曲霉菌感染。能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)控，閉管檢測(cè)， 具有快速簡(jiǎn)便、靈敏度高等特點(diǎn)（能夠達(dá)到1〇 4拷貝/ml)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以 快速的測(cè)定判斷樣本中是否含有并含有相應(yīng)的煙曲霉或黃曲霉。同時(shí)采用空白對(duì)照可以有 效的扣除可能發(fā)生感染的，在加樣規(guī)程中進(jìn)行了質(zhì)量控制，能夠判斷是否在加樣中發(fā)生了 污染。通過(guò)快速的鑒定可以為臨床的決策判斷提供有效的證據(jù)，及時(shí)合理的運(yùn)用抗生素，減 少耐藥的產(chǎn)生，同時(shí)減少患者的住院費(fèi)用及時(shí)間。
[0034] 本發(fā)明具有的有益結(jié)果如下：
[0035] 1.本發(fā)明首次將tHDA擴(kuò)增方法結(jié)合應(yīng)用于曲霉菌的檢測(cè)，有利于簡(jiǎn)化儀器，節(jié)約 儀器研發(fā)的成本投入，更有利于在基層的開展以及運(yùn)用，也為基因?qū)用娴拇才詸z驗(yàn)提供思 路；
[0036] 2.本發(fā)明結(jié)合熒光tHDA技術(shù)，采用發(fā)明人創(chuàng)新設(shè)計(jì)的用于煙曲霉及黃曲霉的通 用引物檢測(cè)臨床上最常見的曲霉，可以同步對(duì)兩種常見的曲霉菌進(jìn)行檢測(cè)，能夠?yàn)榕R床侵 襲性真菌感染早期病原體診斷提供依據(jù)，以便早期及時(shí)的制定治療方案，為患者的及時(shí)準(zhǔn) 確的提供強(qiáng)大的證據(jù)支持，減少患者的醫(yī)療費(fèi)用以及縮短患者的住院時(shí)間；本發(fā)明的發(fā)明 人也嘗試驗(yàn)證其他引物進(jìn)行曲霉的檢驗(yàn)，但均未獲得同樣效果。
[0037] 3.本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的引物和試劑盒具有良好的靈敏度及特異性， 同時(shí)檢測(cè)速度快，步驟簡(jiǎn)單，可重復(fù)性高，在臨床診斷上具有強(qiáng)大的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0038] 圖1為以煙曲霉DNA擴(kuò)增模板為例的實(shí)時(shí)熒光tHDA擴(kuò)增的設(shè)置條件；
[0039] 圖2為標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)時(shí)熒光tHDA定量的擴(kuò)增曲線，針對(duì)的模板數(shù)為104?108拷貝/ml 進(jìn)行的tHDA分析，圖中的橫坐標(biāo)代表擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)代表熒光強(qiáng)度，其中1-5分別代 表標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線，針對(duì)不同的拷貝數(shù)；
[0040] 圖3為標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)時(shí)突光tHDA定量檢測(cè)在Standard Curve標(biāo)簽下的標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖 中橫坐標(biāo)代表標(biāo)準(zhǔn)品濃度（拷貝/ml)，縱坐標(biāo)代表閾值循環(huán)數(shù)，標(biāo)記代表檢測(cè)的樣本；
[0041] 圖4為標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)時(shí)熒光tHDA定量檢測(cè)的溶解曲線，橫坐標(biāo)表示溫度（tHDA產(chǎn)物熔 解溫度），縱坐標(biāo)是表示熒光強(qiáng)度/溫度的導(dǎo)數(shù)值（Derivative)。圖中的每一條曲線代表 樣本的溶解曲線，僅有單一峰出現(xiàn)表示該擴(kuò)增產(chǎn)物具有較好的特異性，無(wú)引物二聚體形成。
[0042] 圖5為通用引物tHDA擴(kuò)增特異性分析電泳圖。

【具體實(shí)施方式】
[0043] 本發(fā)明所用的真菌購(gòu)買于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)醫(yī)學(xué)真菌中心，細(xì)菌標(biāo) 本均為從臨床中分離得到的常見的細(xì)菌，人類標(biāo)本為臨床收集。
[0044] 實(shí)施例1 :曲霉tHDA引物設(shè)計(jì)與合成
[0045] 根據(jù)Genbank中煙曲霉的線粒體基因序列，選擇曲霉的保守序列，通過(guò)IDT在線 引物設(shè)計(jì)進(jìn)行設(shè)計(jì)引物，得到用于tHDA擴(kuò)增的通用曲霉引物包括正向引物（其序列為 TGCAITTAATAGCAATGCACGATAC)和反向引物（其序列為 TGCAITTAATAGCAATGCACGATAC)引物 由上海英濰捷基公司合成。
[0046] 實(shí)施例2 :構(gòu)成檢測(cè)侵襲性曲霉菌的熒光定量tHDA快速診斷試劑盒制備。該試劑 盒包括DNA提取劑、實(shí)時(shí)熒光定量tHDA反應(yīng)液及質(zhì)粒模板定量標(biāo)準(zhǔn)品
[0047] 一、DNA提取劑，其包括如下組分：
[0048] 1.8肛作1'1:其為細(xì)胞裂解液，包括0.5%的十二烷基硫酸鈉（505)，0.1111 〇1/1 恥(：1，0.05111〇1/11'1^8-(：1&!17.6)，1臟〇1/1乙二胺四乙酸出0了八）；
[0049] 2.Buffer II :其為真菌破壁液，包含有500mmol/L Tris ;10mmol/L EDTA ;1% β - 疏基乙醇；
[0050] 3. Buffer III為苯酚：氯仿：異戊醇（25:24:1);
[0051] 4.蛋白酶 K(10U/ul);
[0052] 5.溶壁酶 lyticase(10U/ul);
[0053] 二、實(shí)時(shí)熒光定量tHDA反應(yīng)液
[0054] tHDA反應(yīng)液包括：10XtHDA緩沖液、20uM正向引物、20uM反向引物、lOOmM MgS04、 500mM NaCl、dNTP 混合液、酶混合液、2ul Evagreen20X、lul ROX reference Dye;
[0055] 1.其中 lOXtHDA 緩沖液含有 lOmM KCl、20mM Tris-HCl(25。C 時(shí) pH8. 8);
[0056] 2.其中 dNTP 為 4. 28mM dCTP，4. 28mM dGTP，61. 4mM dATP, 4. 28mM dTTP ;
[0057] 3.其中酶混合液為lOU/ul Bst DNA聚合酶、3. 3ng/ul熱穩(wěn)定DNA解旋酶（購(gòu)自 biohelix公司）、8. 3ng/ul極高熱穩(wěn)定性單鏈結(jié)合蛋白（購(gòu)自北京NEB公司）。
[0058] 三、標(biāo)準(zhǔn)品的制備
[0059] 本步驟中采用質(zhì)粒用于定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備。采用正向引物序列 (GATGGCTACAGCTTTCTTAGGT)、反向引物序列（GGTGGAGITTGCATTGGATTAG)為擴(kuò)增引物，并以 煙曲霉為DNA模板進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增。該擴(kuò)增產(chǎn)物包含有以通用引物tHDA擴(kuò)增的DNA序 列。將擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳并利用微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行 回收。然后將回收得到的DNA利用TA連接試劑盒進(jìn)行連接。首先將回收產(chǎn)物lul加入至 50 μ 1感受態(tài)細(xì)胞中冰浴30分鐘。然后42°C熱擊45秒，迅速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中，冰上 靜置2-3分鐘。加入450 μ 1無(wú)菌的LB培養(yǎng)基，混勻后置于37°C搖床，150轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培 養(yǎng)45分鐘，使菌體復(fù)蘇。取適量已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，加到含有X-Gal、IPTG和Amp的LB 固體培養(yǎng)基上，用無(wú)菌的涂布棒將細(xì)胞均勻涂開，將平板置于37°C，直至液體被吸收后，倒 置培養(yǎng)，37°C培養(yǎng)12-16小時(shí)。挑選白色菌落進(jìn)行進(jìn)一步增殖培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并通過(guò)PCR反 應(yīng)鑒定及測(cè)序驗(yàn)證，再用紫外分光光度計(jì)定量并-20°C保存作為標(biāo)準(zhǔn)品。
[0060] 實(shí)施例3實(shí)時(shí)熒光定量tHDA進(jìn)行曲霉菌檢測(cè)的敏感性及特異性分析
[0061] 本實(shí)施例對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量tHDA敏感性分析通過(guò)檢測(cè)不同梯度下的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品， 得到最低陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為敏感性的指標(biāo)，特異性分析則通過(guò)以實(shí)驗(yàn)室提取的真菌、細(xì) 菌標(biāo)本及人類DNA作為擴(kuò)增模板，觀察是否能夠非特異性擴(kuò)增。
[0062] 一、取若干反應(yīng)管，分別作為敏感性分析及特異性分析檢測(cè)，tHDA體系的加樣量按 表1進(jìn)行，實(shí)時(shí)熒光tHDA定量分析采用ABI7500定量?jī)x進(jìn)行檢測(cè)。
[0063] 表1為實(shí)時(shí)熒光定量tHDA反應(yīng)體系
[0064]

【權(quán)利要求】
1. 一組檢測(cè)煙曲霉及黃曲霉的通用引物，其特征在于，所述通用引物包括正向引物和 反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1所示，所述反向引物的核苷酸 序列如序列表SEQ ID NO :2所示。
2. -種檢測(cè)曲霉菌感染的實(shí)時(shí)熒光tHDA試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括以下組 分： (1) DNA提取試劑； (2) tHDA反應(yīng)液，其中包括：tHDA緩沖液、1%504、似(：1、(1階1\引物1、引物11，其中，所述 引物I的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示，所述引物II的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :2 所示； (3) 酶混合物，其中包括：熱穩(wěn)定DNA解旋酶、Bst聚合酶和熱穩(wěn)定性單鏈結(jié)合蛋白ET SSB ； (4) 熒光染料； (5) 陰性對(duì)照：為無(wú)插入煙曲霉或黃曲霉的特異性片段的pUCIS-T載體質(zhì)粒； (6) 陽(yáng)性對(duì)照：為含有煙曲霉或黃曲霉DNA的樣本；； (7) 標(biāo)準(zhǔn)品：為插入有煙曲霉或黃曲霉的特異性片段的pUCIS-T載體質(zhì)粒； (8) 滅菌純水。
3. 如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述DNA提取試劑包括：Buffer I， Buffer II, Buffer III，蛋白酶K，溶壁酶（lyticase);所述突光染料包括：EvaGreen Dye和 ROX reference Dye。
4. 如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)品中插入的特異性序列如下： GATGGCTACAGCTTTCTTAGGTTATGTTTTACCTTATGGTCAAATGAGTTTATGAGGTGCTACAGTTATTAC TAATCTTATGAGTGCTATACCTTGAATAGGTCAAGATATAGTTGAATTTATATGAGGTGGTTTCTCTGTAAATAATG CTACATTAAATAGATTCTTTGCATTACATTTCTTATTACCTTTTGTTTTAGCTGCATTAGTAATAATGCATTTAATA GCAATGCACGATACTGTAGGATCTGGTAATCCTTTAGGTATTTCTGGTAATTATGATAGATTACCTTTCGCTCCTTA CTTTGTATTTAAAGATTTAGTTACTGTATTTATTTTCTTTATAGTATTATCTGTATTTGTATTCTTCATGCCTAACG CATTAGGTGATAGTGAAAATTATGTTATGGCTAATCCAATGCAAACTCCACC〇
5. 如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)品稀釋濃度為1 X 108拷貝/ml、 1 X107 拷貝 /ml、1 X106 拷貝 /ml、1 X105 拷貝 /ml、1 X104 拷貝 /ml、1 X103 拷貝 /ml。
6. -種檢測(cè)真菌感染的tHDA方法，用于對(duì)黃曲霉和/或煙曲霉感染進(jìn)行檢測(cè)，其特征 在于，包括如下步驟： (1) 提取樣品的DNA ; (2) 以步驟（1)所得DNA為模版，利用權(quán)利要求1所述通用引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光tHDA擴(kuò) 增，該實(shí)時(shí)熒光tHDA擴(kuò)增具體包括： 第一步：在61°C下預(yù)熱2min，然后61°C下擴(kuò)增2min，并收集熒光，進(jìn)行45個(gè)擴(kuò)增循環(huán)， 以獲得Ct值和擴(kuò)增曲線； 第二步：使用實(shí)時(shí)熒光PCR儀器系統(tǒng)進(jìn)行溶解曲線分析，以獲得相應(yīng)溶解曲線。 (3) 對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行判定，該步驟包括： 如果Ct值< 45并且> 0,并出現(xiàn)特定的S型擴(kuò)增曲線，同時(shí)溶解曲線出現(xiàn)單一峰值，并 且單一峰在退火溫度附近，則判定樣本中存在煙曲霉或黃曲霉，進(jìn)而根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品所繪制的 標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定樣品中黃曲霉或煙曲霉的DNA拷貝數(shù)； 如果Ct值< 0,并且無(wú)擴(kuò)增曲線，則判定樣本中無(wú)煙曲霉及黃曲霉； 如果陽(yáng)性對(duì)照組中不出現(xiàn)特定的S型擴(kuò)增曲線和/或Ct值，或者陰性對(duì)照中出現(xiàn)特定 的S型曲線和/或Ct值，則判定此次擴(kuò)增無(wú)效。
7.如權(quán)利要求6所述的tHDA方法，其特征在于，所述步驟（2)中的HDA擴(kuò)增體系為： lOXtHDA緩沖液5ul，DNA序列如SEQ ID NO :2所示的引物I 0. 75ul、DNA序列如SEQ ID N0:2 所示的引物 II0.75ul，模版DNA4ul，4mM MgS04、40mM NaCl、0.4mM dNTP、4mM dATP、30U Bst DNA聚合酶、lOng熱穩(wěn)定DNA解旋酶、25ng熱穩(wěn)定性單鏈結(jié)合蛋白、2ul EvaGreen Dye、 lul ROX reference Dye，加滅菌純水至 50ul。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK104087665SQ201410320294
【公開日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2014年7月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月7日
【發(fā)明者】沈建箴, 肖世極, 吳淡森, 付海英, 周華蓉, 黃金梅, 黃勁龍, 王小婷, 張勝藍(lán) 申請(qǐng)人:福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院