一種單引物引發(fā)的核酸恒溫擴增方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于核酸檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種單引物引發(fā)的核酸恒溫擴增方法。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種單引物引發(fā)的核酸恒溫擴增方法，避免了現(xiàn)有技術(shù)的傳統(tǒng)恒溫檢測方法中引物設(shè)計復(fù)雜，檢測成本高等缺點。本發(fā)明提供的技術(shù)方案為一種單引物引發(fā)的核酸恒溫擴增方法，通過對引物序列的設(shè)計使得引物在與目標(biāo)核酸配對后自身互補配對，形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)繼而從目標(biāo)核酸上脫離，在切刻酶和聚合酶共同作用下不斷產(chǎn)生核苷酸片段。本發(fā)明技術(shù)方案可在等溫條件下完成，僅僅利用可保持恒定溫度的設(shè)備就可得以施行，操作方便；擴增過程中只需一條引物，從而使檢測方案更加簡便易行，提高了核酸擴增及檢測的效率。
【專利說明】—種單引物引發(fā)的核酸恒溫擴增方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于核酸檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種單引物引發(fā)的核酸恒溫擴增方法。

【背景技術(shù)】
[0002]核酸檢測已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床診斷，環(huán)境監(jiān)測以及傳染疾病的預(yù)防與控制等許多方面，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain React1n, PCR)能對微量核酸模板進行指數(shù)性擴增，其高靈敏度使其成為目前使用最廣泛的核酸擴增方法，然而，傳統(tǒng)PCR需要使用熱變性的方法制備單鏈核酸模板，使引物與模板退火，此過程需要具有精確調(diào)控溫的儀器。此外，PCR反應(yīng)的特異性取決于引物退火的特異性，為了得到特異性的擴增，常常需要對退火溫度進行優(yōu)化，工作較繁瑣。此外，PCR的產(chǎn)物也可以作為模板進行擴增，大量的產(chǎn)物極大的增加了污染的可能性，因此，對產(chǎn)物的處理要非常謹(jǐn)慎。為了克服上述傳統(tǒng)PCR費時、費力、工作繁瑣等的缺點，自20世紀(jì)90年代初以來很多實驗室嘗試發(fā)展無需熱變性的DNA等溫擴增技術(shù)。美國New England B1labs的研究人員模擬生物體內(nèi)DNA的復(fù)制機制發(fā)明了一種新的體外恒溫基因擴增技術(shù)一依賴于解旋酶恒溫基因擴增技術(shù)(Helicase DependentIsothermal DNA Amplificat1n, HDA),此方法使用解旋酶將雙鏈核酸變成單鏈核酸,代替了傳統(tǒng)PCR的熱變性方法，使得整個反應(yīng)可以在恒溫下進行，是一種恒溫條件下進行的PCR反應(yīng)，不需要溫度的反復(fù)調(diào)控，省時、省力。但是此過程需要加入打開雙鏈核酸的解旋酶、使核酸保持單鏈狀態(tài)的單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)和聚合酶，導(dǎo)致檢測費用增加。1992年美國Becton Dickinson研究中心的Walker等首次報道鏈置換擴增技術(shù)(Strand DisplacementAmplificat1n, SDA)，其首先使用熱變性方法將雙鏈DNA轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂?，帶有限制性?nèi)切酶識別序列的引物與單鏈模板退火，聚合酶延伸形成模板的互補鏈，加入的外引物鏈置換下形成的模板互補鏈，另一個帶有限制性酶識別序列的引物與形成的模板互補鏈退火，延伸，實驗中使用硫代dNTP作為合成底物，使得內(nèi)切酶只能裂解其中一條鏈，形成切口，聚合酶和內(nèi)切酶共同作用進行指數(shù)擴增。此方法需要預(yù)先的熱變性過程，需要額外的加入硫代dNTP合成底物，增加了設(shè)計的復(fù)雜性和實驗費用。雖然后來切刻酶的發(fā)明解決了使用硫代dNTP合成底物來使內(nèi)切酶裂解其中一條鏈的問題，節(jié)約了硫代dNTP合成的成本，但是需要設(shè)計四條引物和預(yù)先高溫變性的問題仍沒有解決。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(Loop MediatedIsothermal Amplificat1n, LAMP)是由日本學(xué)者Notomi等于2000年建立的一種新的體外擴增特異DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，該技術(shù)是用4條特異性引物分別識別目標(biāo)DNA的6個特定區(qū)域，通過2個環(huán)狀結(jié)構(gòu)和鏈置換反應(yīng)實現(xiàn)DNA的快速等溫擴增。LAMP反應(yīng)過程包括啞鈴狀模板合成階段 、循環(huán)擴增階段、伸長和再循環(huán)階段。其特別之處在于引物的設(shè)計，它包括2條內(nèi)引物FIP、BIP及2條外引物F3、B3，其中兩條內(nèi)引物在模板上延伸之后會自身形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，兩條外引物在聚合酶延伸作用下，鏈置換下延伸的內(nèi)引物。該方法反應(yīng)迅速，一小時內(nèi)可有效的擴增檢測ι-?ο個拷貝的目的基因，特異性強，恒溫檢測，不需要特殊的儀器。但是此方法四條引物設(shè)計比較困難，對設(shè)計人員要求高，此過程雙鏈的解離需要依靠加入解鏈溫度調(diào)節(jié)劑，并且擴增的含有重復(fù)結(jié)構(gòu)的大量產(chǎn)物易形成氣溶膠，造成假陽性結(jié)果。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中所存在的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種單引物引發(fā)的核酸恒溫擴增方法，避免了現(xiàn)有的傳統(tǒng)恒溫檢測方法中需要預(yù)先通過變溫手段打開雙鏈核酸再進行擴增及引物設(shè)計復(fù)雜，檢測成本高等缺點。
[0004]本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:
[0005]一種引發(fā)核酸恒溫擴增反應(yīng)的單引物，引物至少含有a、b’、x、c四個區(qū)，其中b’區(qū)和a區(qū)的5’側(cè)相連，X區(qū)和b’區(qū)的5’側(cè)相連，c區(qū)和X的5’側(cè)相連；a區(qū)是和靶標(biāo)核酸互補配對的核苷酸序列，b’區(qū)是與使用該引物延伸合成反應(yīng)產(chǎn)物的3’末端區(qū)域互補的核苷酸序列，X區(qū)包含切刻酶的識別位點和切刻位點核苷酸序列，c區(qū)是利用其合成的互補核酸進行信號檢測的核苷酸序列；引物a區(qū)聚合延伸形成b區(qū)，形成的a+b區(qū)可在反應(yīng)溫度下與模板核酸動態(tài)解離；引物延伸形成的b區(qū)與引物原有序列自身折疊互補配對，形成自身莖環(huán)結(jié)構(gòu)；形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)3’端在聚合酶作用下延伸形成切刻酶切刻位點。
[0006]本文所述一種引發(fā)核酸恒溫擴增反應(yīng)的的單引物，其至少含有a、b’、x、c四個區(qū)，也就是說此單引物不僅僅局限于這四個區(qū)，也可含有多個切刻酶位點，在此設(shè)計下，單個引物即可引發(fā)該擴增反應(yīng)，方法簡便，易于操作。
[0007]本文所述的靶標(biāo)模板a+b區(qū)可由5-200個堿基組成，更優(yōu)選10_50個堿基對。
[0008]本文所述的引物延伸形成的b區(qū)自身折疊形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，不僅僅局限于與引物自身的b’區(qū)互補，特征在于形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)在聚合延伸后能形成新的切刻酶位點。
[0009]一種單引物引發(fā)的核酸恒溫擴增方法，(I)引物的3’端a區(qū)與核酸模板近5’端的區(qū)域a’區(qū)退火；(2)聚合酶以退火后的引物的a區(qū)3’末端為合成起點，以核酸模板未發(fā)生互補配對的b’區(qū)為模板，進行合成反應(yīng)；(3)步驟(2)產(chǎn)生的引物延伸產(chǎn)物可以在反應(yīng)溫度下自身退火并和核酸模板發(fā)生解離，形成含有a區(qū)的環(huán)，而核酸模板又可重復(fù)參與步驟(I)中與引物的反應(yīng)過程；(4)步驟(3)中形成了莖環(huán)結(jié)構(gòu)的延伸產(chǎn)物以自身為模板，以與b’區(qū)退火的b區(qū)的3’末端為合成起點，合成其自身的互補鏈；(5)切刻酶在步驟(4)形成的延伸產(chǎn)物的V區(qū)進行單核酸鏈的切刻，形成切口，聚合酶以切口 5’側(cè)的V區(qū)的3’末端為合成起點，以自身為模板，進行鏈置換合成反應(yīng)，置換步驟(4)所合成的互補鏈c’ ；其中聚合酶在切刻形成的切口處進行聚合反應(yīng)形成的產(chǎn)物和步驟(4)形成的產(chǎn)物一樣，可進行步驟(5)的反應(yīng)，不斷循環(huán)置換產(chǎn)生互補鏈C’。
[0010]所述地，反應(yīng)產(chǎn)生的大量的c’不會和引物再引發(fā)擴增反應(yīng)，避免了傳統(tǒng)擴增反應(yīng)中產(chǎn)物再擴增從而產(chǎn)生的產(chǎn)物污染問題。
[0011] 優(yōu)化地，所述的單引物引發(fā)的核酸恒溫擴增方法，處理雙鏈核酸，得到核酸模板。包括:含有切刻酶切刻位點的雙鏈核酸在聚合酶和切刻酶的共同作用下不斷產(chǎn)生含有特定區(qū)域的單鏈核酸模板分子，與后續(xù)級聯(lián)擴增反應(yīng)相結(jié)合(如圖1)，使得信號擴增更強，此反應(yīng)只需要切刻酶聚合酶共同作用在等溫條件下進行解鏈過程，不需要傳統(tǒng)擴增方法所必須的變溫過程。
[0012]處理雙鏈核酸的方法可采用酶或超聲等手段，得到的核酸結(jié)構(gòu)含有能與引物a區(qū)退火互補配對的a’單鏈區(qū)域，所得到的核酸模板的b’區(qū)是單鏈或者雙鏈結(jié)構(gòu)對本實驗無影響。如果b’區(qū)為雙鏈結(jié)構(gòu)，在引物延伸過程中由于聚合酶的鏈置換特性也會將原與模板鏈配對的部分區(qū)域打開變?yōu)閱捂?，進行合成延伸。
[0013]優(yōu)化地，所述的單引物引發(fā)的核酸恒溫擴增方法，所述核酸模板為DNA或RNA。
[0014]優(yōu)化地，所述的單引物引發(fā)的核酸恒溫擴增方法，可在步驟(3)中加入解鏈溫度調(diào)節(jié)劑促使引物延伸產(chǎn)物從模板解離。
[0015]本文所用術(shù)語“解鏈溫度調(diào)節(jié)劑”是指降低解核酸鏈溫度的調(diào)控物，如甜菜堿、三甲胺N氧化物、脯氨酸、二甲基亞砜和甲酰胺等。
[0016]—種檢測目的核苷酸序列的方法，包括上述任一種擴增方法，還包括基于信號變化測定是否已產(chǎn)生步驟(5)中產(chǎn)生的擴增反應(yīng)產(chǎn)物。
[0017]優(yōu)化地，所述的檢測目的核苷酸序列的方法，所述信號變化是基于加入核酸檢測試劑，包括熒光檢測試劑、電化學(xué)檢測試劑、比色檢測試劑、化學(xué)發(fā)光檢測試劑。
[0018]所述的熒光檢測試劑一般包括能嵌插入DNA發(fā)光的試劑，如溴化乙錠、SYBR Green
1、GoodView等,也包括標(biāo)記有突光基團的分子彳目標(biāo)等。
[0019]所述的熒光檢測可以利用能保持恒定溫度和熒光掃描的儀器進行檢測，也可以利用現(xiàn)有的PCR儀在恒定溫度下進行反應(yīng)，如實施例所示的伯樂CFX96熒光定量PCR儀器。
[0020]所述的電化學(xué)檢測試劑包括利用電化學(xué)手段進行寡核苷酸的檢測，如辣根過氧化物酶電化學(xué)體系，三聯(lián)吡啶釕電化學(xué)體系等。
[0021]所述的比色檢測試劑包括納米金比色、鈣黃綠素比色、ABTS比色等能發(fā)生顏色變化的試劑。
[0022]所述的化學(xué)反光檢測試劑包括魯米諾及其衍生物-過氧化氫體系、吖啶脂類-過氧化氫體系、釕聯(lián)吡啶+TPA體系等。
[0023]基于檢測目的核苷酸序列的方法進行突變檢測的方法，其中要被擴增的核苷酸序列中的野生型或突變至少一個在3’末端防止互補鏈的合成，其3’末端是構(gòu)成擴增方法的互補鏈合成的起點，其中所述的3’端選自:引物a區(qū)的3’末端或上述步驟(2)中合成的互補鏈b的3’末端。
[0024]本文所述的突變檢測方法可以對野生型或者突變型任一一個進行設(shè)計相對應(yīng)引物，進行檢測，具體的，可以設(shè)計野生型對應(yīng)的引物進行檢測，此情況下突變型不會有信號變化；也可以設(shè)計突變型對應(yīng)的引物進行檢測，此情況下野生型不會有信號變化。
[0025]單引物引發(fā)的核酸恒溫擴增試劑盒，包括以下組分:寡核苷酸引物，其至少包括前述引物的a、b’、x、c區(qū)；催化鏈置換型互補鏈合成反應(yīng)的DNA聚合酶；能夠特異的切刻雙鏈核酸其中一條核酸鏈的切刻酶；核苷酸，其作為聚合酶的底物。
[0026]本文所用術(shù)語“試劑盒”是指本發(fā)明擴增檢測所需的各種試劑可被預(yù)先包裝，并以試劑盒的形成提供，具體地，本發(fā)明所提供的試劑盒包含作為合成互補鏈合成的引物，用于互補鏈合成的底物dNTPs，用于實現(xiàn)鏈置換型互補鏈合成的DNA聚合酶，用于切刻雙鏈DNA特定一條鏈的切刻酶，為酶反應(yīng)提供合適條件的緩沖液，和用于檢測合成反應(yīng)產(chǎn)物的所必須的介質(zhì)。具體地，本發(fā)明優(yōu)選的模式中，反應(yīng)期間無需加入試劑，并由此對于移入反應(yīng)容器后一個反應(yīng)所必須供給的試劑，其中僅通過加入樣品就可以啟動該反應(yīng)，通過利用發(fā)光信號、電信號或熒光信號可在反應(yīng)容器內(nèi)檢測反應(yīng)產(chǎn)物的系統(tǒng)。反應(yīng)后不必打開或關(guān)閉容器，這對于預(yù)防污染是非?？扇〉摹?br> [0027]在同一反應(yīng)體系檢測多個靶標(biāo)核酸的方法，基于單引物引發(fā)的核酸恒溫擴增方法，在同一反應(yīng)體系中至少含有兩條引物，通過至少一個檢測信號實現(xiàn)多個靶標(biāo)核酸的同時分別檢測或多個靶標(biāo)核酸的兼并性檢測。
[0028]本文所用術(shù)語“同時分別檢測”是指同時檢測不同的靶標(biāo)核酸時用不同的信號分別指示，即針對同一體系中不同的靶標(biāo)核酸設(shè)計相應(yīng)的引物，擴增反應(yīng)產(chǎn)生不同的信號。
[0029]本文所用術(shù)語“兼并性檢測”是指同時檢測不同的靶標(biāo)核酸時用同一種信號指示，即針對同一體系中不同的靶標(biāo)核酸設(shè)計相應(yīng)的引物，擴增反應(yīng)產(chǎn)生同一種信號。
[0030]本文中所用術(shù)語“切口 ”指對雙鏈核酸的兩條鏈中的一條進行內(nèi)部切割。
[0031]本文中所用術(shù)語“切刻酶”指切刻內(nèi)切酶，它可以識別DNA的特異序列，并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA中一條DNA鏈的一類內(nèi)切酶。如Nb.BbvCI,Nb.BsmI,Nb.BsrDI,Nb.Bts1、Nt.Alw1、Nt.BbvC1、Nt.BsmA1、Nt.BspQ1、Nt.BstNB1、Nt.CviPII 或者其他類似的具有切刻功能的酶。
[0032]本文中所用術(shù)語“聚合酶”為具有鏈置換活性的聚合酶，即該酶具有鏈置換的活性，說的更確切些，該聚合酶可在作為模板的核酸序列基礎(chǔ)上進行DNA復(fù)制并置換DNA鏈以釋放退火到模板鏈上的互補鏈。如9° NmTmDNA聚合酶、Bst DNA聚合酶，大片段、Bsu DNA聚合酶，大片段、Deep VentRTm DNA 聚合酶、Deep VentRTm(excT) DNA 聚合酶、Klenow 片段3’ -5’ exo\ DNA 聚合酶 I，(Klenow)大片段、M-MuLV 反轉(zhuǎn)錄酶、phi29DNA 聚合酶、VcntRRDNA聚合酶、VentR (exol DNA聚合酶或其他類似功能的聚合酶中的一種。
[0033]本文中所用術(shù)語“解離”是雙鏈核苷酸變成單鏈核苷酸的過程。
[0034]本文中所用術(shù)語“退火”指的是通過根據(jù)沃森-克里克定律的堿基配對，形成雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸。
[0035]本文中所用術(shù)語“自身折疊互補配對”是指寡核苷酸自身含有互補配對的核苷酸序列，自身發(fā)生堿基互補配對。
[0036]本文中所用術(shù)語“核酸”，本發(fā)明核酸通常既包括DNA又包括RNA。然而，功能為合成互補鏈的模板的，來自天然DNA或RNA的其核苷酸被人工衍生物所替代的核酸或修飾核苷酸也包括在本發(fā)明的核酸范圍內(nèi)，通常本發(fā)明的核酸被包括于生物樣品中，生物樣品包括動物，植物或微生物的組織，細(xì)胞，培養(yǎng)物和分泌物，或它們的提取物。本發(fā)明的生物樣品包括細(xì)胞內(nèi)寄生物基因組DNA或RNA例如病毒或支原體，本發(fā)明的核酸一般由包含在所述生物樣品的核酸衍生而來。例如由mRNA合成cDNA，基于生物樣品衍生來的核酸而擴增的核酸，是本發(fā)明的核酸的典型實例。
[0037]本文中所用術(shù)語“核酸”、“DNA”以及類似術(shù)語還包括核酸類似物，即具有磷酸二酯主鏈以外的類似物。舉例來說，本領(lǐng)域已知并且在主鏈上具有肽鍵而非磷酸二酯鍵的所謂“肽核酸”，被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0038]本文所用術(shù)語“目的核苷酸序列”是指將對其進行擴增或者檢測或者既擴增又檢測的一段目標(biāo)(靶)區(qū)域。目的核苷酸序列作為擴增和檢測的對象可以是任何核酸。目的核苷酸序列可以是RNA、cDNA、基因組DNA，或者來自如一種致病的微生物或病毒的DNA或RNA。目的核苷酸序列還可以是經(jīng)化學(xué)試劑、各種酶類以及物理暴露處理過的DNA。一份樣品中的目的核苷酸序列可以以單鏈DNA或RNA如cDNA、mRNA、其他RNA，或以分離的互補鏈的形式存在?？梢酝ㄟ^物理的、化學(xué)的或酶學(xué)的方法實現(xiàn)目標(biāo)的核酸互補鏈的分離。
[0039]本文所用術(shù)語“引物”是指一種自然產(chǎn)生或人工合成的寡核苷酸，所述寡核苷酸當(dāng)被置于誘發(fā)與一條核酸鏈互補的一種引物延伸產(chǎn)物合成的條件下時，能夠作為合成的起始點，其中所述條件即有核苷酸和一種聚合反應(yīng)試劑如DNA聚合酶的存在，以及適當(dāng)?shù)臏囟群途彌_條件。本文中的引物是經(jīng)過選擇從而與待擴增的各特異性序列的不同鏈充分互補的。也就是說引物與它們各自的對應(yīng)鏈必須充分互補以能與之雜交。一段非互補的核苷酸片段可以與引物的5’端相聯(lián)，而該引物序列的其余部分與目標(biāo)堿基序列的診斷區(qū)互補。除了當(dāng)非互補的核苷酸如上文所述存在于預(yù)先確定的引物末端時以外，引物通常是互補的。
[0040]本文所用術(shù)語“與……互補”是指一個核苷酸能與另一個特定的核苷酸堿基配對。即腺苷與尿苷或胸苷互補，鳥苷與胞苷互補。根據(jù)本說明書的目的應(yīng)當(dāng)認(rèn)為，盡管在某些情況下胸苷與鳥苷可以堿基配對，亦不應(yīng)將它們視為互補的。
[0041]本文所用術(shù)語“雙鏈”是指一條寡-多聚核苷酸與互補的寡-多聚核苷酸雜交。
[0042]本文所用術(shù)語“擴增”是指在核酸序列的混合物中令一種特定核酸序列的濃度升高的任何擴增過程。
[0043]本文所用術(shù)語“發(fā)卡(Hairpin) ”結(jié)構(gòu)也被稱作“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)，是指一種寡核苷酸分子，其可形成一種包括雙鏈區(qū)域(莖部)的二級結(jié)構(gòu)，所述的雙鏈區(qū)域由該寡核苷酸分子的兩個區(qū)域(位于同一分子上)形成，兩個區(qū)域分列雙鏈部分的兩側(cè)；其還包括至少一個“環(huán)”結(jié)構(gòu)，包括非互補的核苷酸分子，即單鏈區(qū)域。發(fā)卡結(jié)構(gòu)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，通常在獲得了一條具有一級結(jié)構(gòu)的寡核苷酸序列后，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定該核酸是否能形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。
[0044]本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在以下方面:
[0045]I)本發(fā)明技術(shù)方案可在等溫條件下完成，等溫是指技術(shù)方案中全過程的每個步驟的反應(yīng)溫度是不變的，每步都是在基本恒定的溫度下進行，本發(fā)明在核酸合成乃至檢測全過程無需對溫度進行上下調(diào)節(jié)，因此本發(fā)明提供了等溫合成核酸及檢測的方法，多種傳統(tǒng)的核酸擴增方法要求對溫度進行上下調(diào)節(jié)以使目的核酸從合成的鏈中解離出來，這些方法要求特殊的反應(yīng)設(shè)備，如熱循環(huán)儀來達到其目的，然而本發(fā)明的方法僅僅利用可保持恒定溫度的設(shè)備就可得以施行，操作方便。
[0046]2)本發(fā)明技術(shù)方案實施擴增過程中只需一條引物，無需現(xiàn)有技術(shù)中LAMP法所述的四條引物，實驗設(shè)計簡單，投入成本較低，從而使檢測方案更加簡便易行，進一步提高了核酸擴增及檢測的效率。
[0047]3)本發(fā)明技術(shù)方案可以針對多條靶標(biāo)核酸模板設(shè)計相應(yīng)的引物實現(xiàn)同一體系的多重靶標(biāo)核酸的同時檢測，也可以利用不同的信號指示實現(xiàn)多重靶標(biāo)核酸同時進行區(qū)別性檢測。
[0048]4)本發(fā)明技術(shù)方案主要利用產(chǎn)生的大量的寡聚核苷酸進行信號的檢測，并且擴增期間產(chǎn)生的核酸都不能被引物利用作為模板進行擴增，這就減少了產(chǎn)物污染導(dǎo)致的假陽性結(jié)果問題。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0049]圖1為雙鏈核酸模板檢測實驗原理圖；
[0050]圖2為本發(fā)明涉及的實施例1檢測結(jié)果的熒光信號圖；
[0051]圖3為本發(fā)明涉及的實施例1檢測結(jié)果的電泳結(jié)果圖；
[0052]圖4為本發(fā)明涉及的實施例2檢測結(jié)果的熒光信號圖；
[0053]圖5為本發(fā)明涉及的實施例2檢測結(jié)果的線性關(guān)系圖；
[0054]圖6為本發(fā)明涉及的實施例3檢測結(jié)果的熒光信號圖；
[0055]圖7為本發(fā)明涉及的實施例4檢測的納米金檢測原理圖；
[0056]圖8為本發(fā)明涉及的實施例4檢測結(jié)果比色結(jié)果圖；
[0057]圖9為本發(fā)明涉及的實施例5檢測結(jié)果的熒光信號圖；
[0058]圖10為本發(fā)明涉及的實施例6檢測結(jié)果的熒光信號圖；
[0059]圖11為本發(fā)明涉及的實施例7檢測結(jié)果的熒光信號圖；
[0060]圖12為本發(fā)明實驗原理圖。

【具體實施方式】
[0061]下面通過實施例并結(jié)合附圖作進一步說明。
[0062]序列表獨立文本:
[0063]SEQ ID N0.1(5，_3，):分子信標(biāo) MBl ；
[0064]SEQ ID N0.2(5’ _3，):primer ；
[0065]SEQ ID N0.3(5’ _3，):PBS 質(zhì)粒；
[0066]SEQ ID N0.4(5’ -3’ ):巰基修飾的納米金 DNAl ；
[0067]SEQ ID N0.5(5，_3，):巰基修飾的納米金 DNA2 ；
[0068]SEQ ID N0.6(5’ _3，):雞的序列；
[0069]SEQ ID N0.7(5’ _3，):牛的序列；
[0070]SEQ ID N0.8(5’ _3，):魚的序列；
[0071]SEQ ID N0.9(5’ -3，):primer 雞 I ;
[0072]SEQ ID N0.10(5，_3，):primer 牛；
[0073]SEQ ID N0.11 (5，_3，):primer 魚；
[0074]SEQ ID N0.12(5’ _3，):分子信標(biāo) MB2 ；
[0075]SEQ ID N0.13(5’ -3，):primer 雞 2 ；
[0076]SEQ ID N0.14(5’ _3’ ):突變 DNA 鏈 B ；
[0077] SEQ ID N0.15(5’ -3’ ):突變 DNA 鏈 C。
[0078]實施例1:驗證方法的可行性及其原理的正確性。
[0079]本實施例是利用PBS質(zhì)粒作為靶標(biāo)核酸，利用單引物進行擴增的恒溫檢測，通過熒光信號驗證方法的可行性和原理的正確性。向該恒溫擴增系統(tǒng)加入I μ L(5X 10_6M)的分子信標(biāo) MBl (序列為 5’-FAM-CGCTTGGTAGGCTCCGGTTCCCAACGATCAGATCCTGCTACCAAGCG-DABCYL-3，即 SEQ ID N0.1), I XNEBuffer3.KlOOmM NaCl, 50mM Tris-HCl, 1mM MgCl2, 100 μ g/mL BSA ρΗ7.9i25°C) ,0.05 μ L Bst2.0ffarmStart? DNA聚合酶，0.4μ L Nt.BstNBI 切刻酶，
Iμ L(2.5mM) dNTPs, 0.2 μ L(1yM)primer (序列為 5’ -GGTTCCCAACGATCAGATCCTGGTGAGACTCAACTATGCTATTTCGTTCATC-3’ 即 SEQ ID N0.2)，I μ L (I X I(T12M)靶目標(biāo) PBS 質(zhì)粒(序列為 5’-CTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTC-3’ 即 SEQ ID N0.3)，體系最后加水至 10 μ L。利用伯樂CFX96?實時熒光定量PCR儀每分鐘檢測一次熒光信號，55°C反應(yīng)60分鐘。結(jié)果如圖2所示，圖中A為上述反應(yīng)體系熒光信號變化，B、C和D分別為上述體系不含Bst2.0ffarmStart?DNA聚合酶、不含切刻酶Nt.BstNBI和不含primer (即SEQ ID N0.2)的熒光信號變化。實驗表明沒有聚合酶、切刻酶和primer任意一種物質(zhì)，實驗都不能進行反應(yīng)，從而驗證了實驗的原理。
[0080]本實施例是利用PBS質(zhì)粒作為靶標(biāo)核酸，利用單引物進行擴增的恒溫檢測，通過電泳結(jié)果驗證方法的可行性和原理的正確性，向該恒溫擴增系統(tǒng)加入I μ L(5X 10_6M)的分子信標(biāo) MBl ( BP SEQ ID N0.1)，I X NEBuffer3.1,0.05 μ L Bst2.0ffarmStart? DNA 聚合酶，0.4μ L Nt.BstNBI 切刻酶，I μ L(2.5mM) dNTPs，0.2 μ L(10yM)primer (即 SEQ ID N0.2),再分別加入IuLlX ΙΟΙ，I X 1-9M, I X 10-10Μ，I X KT11M靶目標(biāo)PBS質(zhì)粒，體系最后加水至10 μ L0利用伯樂CFX96?實時熒光定量PCR儀每分鐘檢測一次熒光信號，55°C反應(yīng)30分鐘。非變性聚丙烯酰胺電泳膠濃度17.5%，電壓135V，電泳70分鐘，EB染色；檢測結(jié)果如圖3所示，圖中泳道I代表含有模板濃度為I X 10_9M PBS質(zhì)粒反應(yīng)體系的產(chǎn)物，泳道2代表含有模板濃度為I X 1^10M PBS質(zhì)粒反應(yīng)體系的產(chǎn)物，泳道3代表含有模板濃度為I X 10_nMPBS質(zhì)粒反應(yīng)體系的產(chǎn)物，泳道4代表含有模板濃度為I X 10_12M PBS質(zhì)粒反應(yīng)體系的產(chǎn)物，泳道5代表濃度為2 X 1-7M Primer (即SEQ ID N0.2)的引物條帶，泳道6代表分子信標(biāo)濃度為5X1(TM MBl的條帶，泳道M代表20bp DNA Marker條帶。由電泳圖中可以看出，一定時間內(nèi)不同濃度模板間產(chǎn)物的生成量變化，驗證了實驗的原理的正確性和可行性。
[0081]實施例2:利用單引物引發(fā)的核酸恒溫擴增檢測方法檢測PBS質(zhì)粒。
[0082]本實施例檢測不同濃度的PBS質(zhì)粒，檢驗該核酸檢測方法的靈敏度。向該恒溫擴增系統(tǒng)加入 I μ L(5X 10_6M)的分子信標(biāo) MBl (即 SEQ ID N0.1), I XNEBuffer3.1,0.05 μ L Bst2.0ffarmStart? DNA 聚合酶，0.4yL Nt.BstNBI 切刻酶，I μ L (2.5mM) dNTPs,0.2 μ L(10yM)primer (即 SEQ ID N0.2)，再向該體系分別加入 I μ LI X 10-8Μ、I X 10-9Μ、I X 10-10Μ、I X 10-ηΜ、I X 10-12Μ、I X 10-13Μ、I X 10-14Μ、I X 10-15Μ、I X 10-16Μ 及 OM 的靶目標(biāo) PBS質(zhì)粒(即SEQ ID N0.3)，體系加水至10 μ L。利用伯樂CFX96?實時熒光定量PCR儀每分鐘檢測一次熒光信號，55°C反應(yīng)70分鐘；結(jié)果如圖4所示，濃度梯度從左到右依次遞減。圖4的結(jié)果表明，本方法有較寬的檢測范圍(從I X KT9M到I X I(T17M)，較低的檢測限，能夠檢測到濃度為I X 10_17M的PBS質(zhì)粒。并由圖5可以得出其線性方程為POI = -114.5_91g C (moI)(R = 0.9988)和 POI = -33.14-4.271g C(mol) (R = 0.9945) (POI 即 point of inflect1n,表示擴增曲線斜率最大值對應(yīng)的時間點)，說明本方法有較好的線性檢測范圍。
[0083]實施例3:檢測在復(fù)雜體系環(huán)境下，本方法的抗背景干擾檢測靶核酸的能力。
[0084]本實施例檢測在含有大腸桿菌基因組復(fù)雜體系下，本方案的抗背景干擾能力。向恒溫擴增系統(tǒng)加入1uL(5X1(T6M)的分子信標(biāo)MBl (即SEQ ID N0.1)，I XNEBuffer3.1，0.05 μ L Bst2.0ffarmStart? DNA 聚合酶，0.4μ L 切刻酶 Nt.BstNBI，I μ L(2.5mM) dNTPs,0.2 μ L(10yM)primer (即 SEQ ID N0.2)，I μ LI X KT12M PBS 質(zhì)粒，再向該體系分別加入I μ LI X 10-10Μ、I X 10-ηΜ、I X 10-12Μ、I X 1(T13M、OM的大腸桿菌基因組，體系最后加水至10 μ L0利用伯樂CFX96?實時熒光定量PCR儀每分鐘檢測一次熒光信號，55°C反應(yīng)50分鐘。本實施例的檢測結(jié)果如圖6所示，圖6中曲線結(jié)果A、B、C、D、E分別表示為含有大腸桿菌基因組濃度分別為I X 10_nM、I X 10_12M、I X 10_13M、I X 10_14M、0M的反應(yīng)體系熒光信號。如圖6所示，檢測結(jié)果表明，加入不同濃度的大腸桿菌基因組對實驗幾乎沒有影響，說明本實驗復(fù)雜體系下的抗干擾能力較強，同時也說明了本方法特異性很好。
[0085]實施例4:納米金比色法對恒溫擴增產(chǎn)物進行檢測。
[0086]向恒溫擴增系統(tǒng)加入I X NEBuf fer3.1,0.05 μ L Bst2.0ffarmStart? DNA 聚合酶，0.4yL Nt.BstNBI 切刻酶，I μ L (2.5mM) dNTPs，0.2 μ L (10 μ M) primer (即 SEQ IDN0.2)，再向該體系分別加入 I μ LI X 10-ηΜ、I X 10-12Μ、I X 10-13Μ、I X KT14M 及 OM 的靶目標(biāo)PBS質(zhì)粒(即SEQ ID N0.3)，體系最后加水至10μ L。利用伯樂CFX96?實時熒光定量PCR儀55 °C保溫25分鐘；將反應(yīng)產(chǎn)物加入納米金體系(圖7)，即20yL巰基修飾的納米金DNAl (5，-SH-GGTTCCCAACGT-3，即SEQ IDN0.4)和20 μ L巰基修飾的納米DNA2(5’-ATCAGATCCTG-SH-3’ 即 SEQ IDN0.5)，其中納米金的緩沖體系為 1mM PBS,0.3MNaCl和8mM MgCl2。結(jié)果如圖8所示，其中體系濃度含有I X 1(T12M、I X 10-13Μ、I X 10-14Μ的靶目標(biāo)核苷酸均變藍色，I X 1^l5M的靶目標(biāo)核苷酸變色不明顯，OM的陰性對照體系沒有變色，這是由于反應(yīng)25分鐘后，IX 10_12Μ、1Χ 10_13Μ、1Χ 10_14Μ的靶標(biāo)核苷酸體系擴增產(chǎn)生了大量的產(chǎn)物與納米金反應(yīng)，使其聚集變色；而IXlO-15M的靶目標(biāo)核苷酸此段時間內(nèi)擴增的產(chǎn)物量太少，使得納米金變色不明顯；沒加靶目標(biāo)核苷酸的的陰性體系沒有引發(fā)擴增反應(yīng)，沒有產(chǎn)物產(chǎn)生使得納米金變色。因此實驗結(jié)果表明，本實驗可以利用納米金比色法進行檢測，不需要特殊的熒光儀器和標(biāo)記昂貴的熒光分子信標(biāo)，并且可以進一步利用納米金試紙條來進行檢測，便宜、方便、應(yīng)用范圍廣，更可進一步用于現(xiàn)場的快速檢測。
[0087]實施例5:對本實驗單一體系的多重檢測能力進行驗證。
[0088]本實驗利用雞(序列為5’ -AGACTTCAAGGACCTCTCATTTGACTC-3’ 即 SEQ ID N0.6)、牛(序列為 5’ -GAGTCCATATCGACAATAGGGTTTACGA-3’ BP SEQ ID N0.7)、魚(序列為5’-GAGTCCATATCGACGAGGGGGTTTAC-3’ 即 SEQ ID N0.8)的基因組 DNA 作為目標(biāo)鏈，及相應(yīng)的引物 primer 雞 I (序列為 5’ -GGTTCCCAACGATCAGATCCTGGTGAGACTCGAGAGGTAGACTTCAAGGAC-3，即 SEQ ID N0.9) ,primer 牛(序列為 5，-GGTTCCCAACGATCAGATCCTGGTGAGACTCTCGACATCGTAAACCCTA-3’ 即 SEQ ID N0.10) ,primer 魚(序列為 5’ -GGTTCCCAACGATCAGATCCTGGTGAGACTCTCGACGGTAAACCCCCTC-3’即SEQ ID N0.11)檢驗本方法同一體系檢測多重靶標(biāo)的能力。該體系含有 I μ L(5X I(T6M)的分子信標(biāo) MBl (即 SEQ ID N0.1), I XNEBuffer3.1,0.05 μ L Bst2.0ffarmStart? DNA 聚合酶，0.4yL Nt.BstNBI 切刻酶，I μ L (2.5mM) dNTPs,0.2 μ L(10 μ M)不同物種對應(yīng)的引物，然后分別向該體系中加入雞、牛、魚的混合目標(biāo)鏈(即 SEQ ID N0.6,N0.7,N0.8)和其對應(yīng)的引物(即 SEQ ID N0.9,N0.10,N0.11)、雞的目標(biāo)鏈(即SEQ ID N0.6)和其對應(yīng)的引物(即SEQ ID N0.9)、魚的目標(biāo)鏈(即SEQ ID N0.8)和其對應(yīng)的引物(即SEQ ID N0.11)、牛的目標(biāo)鏈(即SEQ IDN0.7)和其對應(yīng)的引物(即SEQ ID N0.10)以及水和雞、牛、魚的引物(即SEQ IDN0.9、N0.10、N0.11)，各體系加水補充至10 μ L。利用伯樂CFX96?實時熒光定量PCR儀每分鐘檢測一次熒光信號，55°C反應(yīng)60分鐘。
[0089]本實施例的檢測結(jié)果如圖9所示，其中A為雞、魚、?；旌夏繕?biāo)鏈和其對應(yīng)引物的體系的突光信號，B、C、D、E分別為雞目標(biāo)鏈和其對應(yīng)的引物體系的突光信號、魚目標(biāo)鏈和其對應(yīng)的引物體系的熒光信號、牛目標(biāo)鏈和其對應(yīng)的引物體系的熒光信號、水和雞、魚、牛的引物體系的熒光信號。由實驗結(jié)果可以得出:同時含有雞、魚、牛目標(biāo)鏈體系的熒光信號較單獨含有其中任意一個目標(biāo)鏈體系的熒光信號出現(xiàn)的早，此結(jié)果表明本實驗可以實現(xiàn)對多個目標(biāo)核酸的同一體系的同時檢測，減少了檢測多個靶標(biāo)核酸的工作量。
[0090]實施例6:利用多重?zé)晒鈽?biāo)記的分子信標(biāo)進行多重目標(biāo)的同時區(qū)別性檢測。
[0091]本實驗利用雞(即SEQ ID N0.6)和魚(即SEQ ID N0.8)的目標(biāo)鏈作為檢測模板，利用標(biāo)記不同熒光物質(zhì)的分子信標(biāo)進行同時檢測。該體系含有I μ L(2X I(T6M)的分子信標(biāo)MBl (即SEQ ID N0.1，可以特異的顯示魚的擴增信號)，I μ L(2X I(T6M)的分子信標(biāo)MB2(序列為 5’-HEX-CCGATCGAACGCTCCCGTGTGTGCAGCCTACAACCAAGTTCGATCGG-DABCYL-3’ 即 SEQ IDN0.12，可以特異的顯示雞的擴增信號)，IXNEBuffer3.1,0.05 μ L Bst2.0ffarmStart? DNA聚合酶，0.4μ L Nt.BstNBI 切刻酶，I μ L(2.5mM) dNTPs, 0.2 μ L (10 μ M) primer 雞 2(序列為 5’ -CGTGTGTGCAGCCTACAACCAAGTGAGACTCGAGAGGTAGACTTCAAGGAC-3’ 即 SEQ ID N0.13)，
0.2 μ L(10 μ M)primer魚(即SEQ ID N0.11)，分別向該體系中加入雞和魚的混合目標(biāo)鏈(即SEQ ID N0.6,N0.8)、雞的目標(biāo)鏈(即SEQID N0.6)、魚的目標(biāo)鏈(即SEQ ID N0.8)和7jC,體系加水補充至10 μ L0利用伯樂CFX96?實時熒光定量PCR儀每分鐘檢測一次熒光信號，55°C反應(yīng)60分鐘。本實施例的檢測結(jié)果如圖10所示，圖中A表示只有雞的目標(biāo)鏈體系中HEX的信號,E表不該體系中FAM的信號；C表不只有魚的目標(biāo)鏈體系中FAM信號,F表不該體系中HEX信號；圖中B表不含有雞和魚的混合目標(biāo)鏈的體系中HEX信號,D表不該體系中FAM信號；圖中G、H分別表示陰性水的體系中的HEX信號和FAM信號。結(jié)果顯示，混合體系中不同模板產(chǎn)生的特異性信號與其單獨體系時產(chǎn)生的特異性信號相一致，由此表明，本實驗可以利用多重?zé)晒庑艠?biāo)對多重目標(biāo)同時但區(qū)別性的特異的檢測。
[0092]實施例7:本實驗對突變堿基的檢測。
[0093]以 DNA 鏈 A(即 SEQ ID N0.3)、突變 DNA 鏈 B(5，-CTATTTCGTTCATGCATAGTTGCCTGACTC-3’ 即 SEQ ID N0.14),突變 DNA 鏈 C(5’-CTATTTCGTTCATCCATAGTAGCCTGACTC-3’即SEQ ID N0.15)為目標(biāo)鏈進行突變基因的檢測，其中鏈B、C含有一個突變堿基。該體系含有 I μ L(5X I(T6M)的分子信標(biāo) MBl (即 SEQ ID N0.1), I XNEBuffer3.1,0.05 μ L Bst2.0ffarmStart? DNA 聚合酶，0.4μ L 切刻酶 Nt.BstNBI，I μ L(2.5mM) dNTPs,0.2 μ L(10 μ M)primer ( gp SEQ ID N0.2)，向該體系分別加入 I μ LI X 10-12Μ模板DNA鏈A(即SEQ ID N0.3)、突變 DNA 鏈 B (即 SEQ ID N0.14)及突變 DNA 鏈 C (即 SEQ ID N0.15)，體系加水補充至?ο μ L0利用伯樂CFX96?實時熒光定量PCR儀每分鐘檢測一次熒光信號，55°C反應(yīng)50分鐘。實驗結(jié)果如圖11所示，圖中A表示正常的模板DNA鏈A擴增體系的熒光信號，B、C分別表示含有單個堿基突變的DNA鏈B、C擴增體系的熒光信號，可以看出即使只有一個堿基的突變，本實驗也可以很好地區(qū)分出來，說明本實驗可以特異的對堿基突變進行檢測。
[0094]需要指出的是，以上所述，僅為本發(fā)明的【具體實施方式】，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化相替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護范圍應(yīng)以所述權(quán)利要求的保護范圍為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1.一種引發(fā)核酸恒溫擴增的單引物，其特征在于: (1)引物至少含有a、b’、x、c四個區(qū)，其中b’區(qū)和a區(qū)的5’側(cè)相連，x區(qū)和b’區(qū)的5’側(cè)相連，c區(qū)和X的5’側(cè)相連； (2)a區(qū)是和靶標(biāo) 核酸互補配對的核苷酸序列，b’區(qū)是與該引物延伸合成反應(yīng)產(chǎn)物的3’末端區(qū)域互補的核苷酸序列，X區(qū)包含切刻酶的識別位點和切刻位點核苷酸序列，c區(qū)是利用其合成的互補核酸進行信號檢測的核苷酸序列； (3)引物a區(qū)聚合延伸形成b區(qū)，形成的a+b區(qū)在反應(yīng)溫度下與模板核酸動態(tài)解離； (4)引物延伸形成的b區(qū)與引物原有序列發(fā)生折疊互補配對，形成自身莖環(huán)結(jié)構(gòu)； (5)形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)3’端在聚合酶作用下延伸形成切刻酶切刻位點。
2.一種單引物引發(fā)的核酸恒溫擴增方法，其特征在于: (1)引物的3’端a區(qū)與核酸模板近5’端的區(qū)域a’區(qū)退火； (2)聚合酶以退火后的引物的a區(qū)3’末端為合成起點，以核酸模板未發(fā)生互補配對的b’區(qū)為模板，進行合成反應(yīng)； (3)步驟(2)產(chǎn)生的引物延伸產(chǎn)物可以在反應(yīng)溫度下自身退火并和核酸模板發(fā)生解離，形成含有a區(qū)的環(huán)，而核酸模板又可重復(fù)參與步驟(1)中與引物的反應(yīng)過程； (4)步驟(3)中形成了莖環(huán)結(jié)構(gòu)的延伸產(chǎn)物以自身為模板，以與b’區(qū)退火的b區(qū)的3’末端為合成起點，合成其自身的互補鏈； (5)切刻酶在步驟(4)形成的延伸產(chǎn)物的X’區(qū)進行單核酸鏈的切刻，形成切口，聚合酶以切口 5’側(cè)的V區(qū)的3’末端為合成起點，以自身為模板，進行鏈置換合成反應(yīng)，置換步驟(4)所合成的互補鏈c’ ； 其中聚合酶在切刻形成的切口處進行聚合反應(yīng)形成的產(chǎn)物和步驟(4)形成的產(chǎn)物一樣，可進行步驟(5)的反應(yīng)，不斷循環(huán)置換產(chǎn)生互補鏈C’。
3.如權(quán)利要求2所述的一種單引物引發(fā)的核酸恒溫擴增方法，其特征在于:處理雙鏈核酸，得到權(quán)利要求2所述的核酸模板，包括:含有切刻酶切刻位點的雙鏈核酸，在聚合酶和切刻酶的共同作用下不斷產(chǎn)生含有特定區(qū)域的單鏈核酸模板分子。
4.如權(quán)利要求2或3所述的任一種單引物引發(fā)的核酸恒溫擴增方法，其特征在于:權(quán)利要求2所述核酸模板為DNA或RNA。
5.如權(quán)利要求2或3所述的任一種單引物引發(fā)的核酸恒溫擴增方法，其特征在于:可在權(quán)利要求2所述的步驟(3)加入解鏈溫度調(diào)節(jié)劑促使引物延伸產(chǎn)物從模板解離。
6.一種檢測目的核苷酸序列的方法，其特征在于:所述方法包括權(quán)利要求2或3所述的任一種擴增方法，還包括基于信號變化測定是否已產(chǎn)生權(quán)利要求2步驟(5)中產(chǎn)生的擴增反應(yīng)產(chǎn)物。
7.如權(quán)利要求6所述的檢測目的核苷酸序列的方法，其特征在于:所述信號變化是基于加入核酸檢測試劑，包括熒光檢測試劑、電化學(xué)檢測試劑、比色檢測試劑、化學(xué)發(fā)光檢測試劑。
8.通過權(quán)利要求7所述的檢測方法檢測突變的方法，其特征在于:其中要被擴增的核苷酸序列中的野生型或突變至少一個在3’末端防止互補鏈的合成，其3’末端是構(gòu)成擴增方法的互補鏈合成的起點，其中所述的3’端選自:引物a區(qū)的3’末端或權(quán)利要求2步驟(2)中合成的互補鏈b的3’末端。
9.單引物引發(fā)的核酸恒溫擴增試劑盒，其特征在于:試劑盒包括以下組分:寡核苷酸引物，其至少包括權(quán)利要求1所述的a、b’、x、c區(qū)；催化鏈置換型互補鏈合成反應(yīng)的DNA聚合酶；能夠特異的切刻雙鏈核酸其中一條核酸鏈的切刻酶；核苷酸，其作為聚合酶的底物。
10.在同一反應(yīng)體系檢測多個靶標(biāo)核酸的方法，其特征在于:通過權(quán)利要求2所述的方法，在同一反應(yīng)體系中至少含有兩條引物，通過至少一個檢測信號實現(xiàn)多個靶標(biāo)核酸的同時分別檢測或多個靶標(biāo) 核酸的兼并性檢測。
【文檔編號】C12N15/11GK104164488SQ201410324430
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年7月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月9日
【發(fā)明者】石超, 馬翠萍, 韓典昂, 鄧美蓮 申請人:青島科技大學(xué)