蝦類網(wǎng)格蛋白輕鏈基因及其靶向dsRNA的制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】蝦類網(wǎng)格蛋白輕鏈基因及其靶向dsRNA的制備方法與應(yīng)用，涉及一種網(wǎng)格蛋白輕鏈基因。蝦類網(wǎng)格蛋白輕鏈基因?yàn)樵醋约t螯螯蝦(C.quadricarinatus)，命名為Cq-CLC。靶向蝦類網(wǎng)格蛋白輕鏈基因的dsRNA靶向基因?yàn)镃q-CLC，命名為Cq-CLC?dsRNA。制備方法：1)參考試劑盒設(shè)計(jì)引物及制備dsRNA；2)將步驟1)所得的dsRNA轉(zhuǎn)染紅螯螯蝦Hpt細(xì)胞，檢測(cè)其對(duì)靶向基因Cq-CLC的敲除效率；3)按照步驟2)敲除Cq-CLC，并感染W(wǎng)SSV，檢測(cè)Cq-CLC敲除的Hpt細(xì)胞中WSSV入胞量，與對(duì)照組進(jìn)行比較。Cq-CLC可作為抗WSSV類新藥開發(fā)的重要靶點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】蝦類網(wǎng)格蛋白輕鏈基因及其靶向dsRNA的制備方法與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種網(wǎng)格蛋白輕鏈基因 （Clathrin light chain, CLC)，尤其涉及一種 從紅螯螯奸（Cherax quandricarinatus)分離得到的CLC一Cq-CLC基因，該基因參與對(duì)蟲下 白斑病毒（WSSV)入胞感染；還涉及到一種靶向Cq-CLC的雙鏈RNA(Double strands RNA， dsRNA)，該dsRNA介導(dǎo)的Cq-CLC基因敲除能夠抑制WSSV感染。

【背景技術(shù)】
[0002] 內(nèi)吞作用是細(xì)胞通過(guò)質(zhì)膜變形運(yùn)動(dòng)將細(xì)胞外物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的過(guò)程，所轉(zhuǎn)運(yùn)物 質(zhì)包括一些大分子物質(zhì)（如糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等）或顆粒（如細(xì)菌、病毒）。根據(jù)入胞機(jī) 制的差異可將細(xì)胞內(nèi)吞分為多種不同方式，如網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞、巨胞飲、小窩介導(dǎo)的內(nèi) 吞和其他內(nèi)吞作用等。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)吞是許多病毒入胞的重要途徑（Yamauchi Y，HeleniUS A. Virus entry at a glance [J].J Cell Sci, 2013, 126 (Pt6) :1289-1295),而網(wǎng)格蛋白介導(dǎo) 的內(nèi)吞是目前報(bào)道最多的病毒入胞途徑，其核心組成包括網(wǎng)格蛋白和銜接蛋白（Adaptor protein，AP)復(fù)合體。
[0003] 在水生甲殼動(dòng)物中，研究人員發(fā)現(xiàn)，網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞是黃頭病毒（Yellow head virus)感染斑節(jié)對(duì)奸（Penaeus monodon)的重要途徑，基因敲除銜接蛋白AP17明顯 抑制 YHV 的感染增殖（Jatuyosporn T, Supungul P, Tassanakajon A, et al. The essential role of clathrin-mediated endocytosis in yellow head virus propagation in the black tiger shrimp Penaeus monodon[J]· Dev Comp Immunol, 2014, 44(1) : 100-110) 〇
[0004] 對(duì)于WSSV,目前有研究報(bào)道，小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑可能參與病毒感染或螯 蟲下(Duan H, Jin S, Zhang Y, et al. Granulocytes of the red claw crayfish Cherax quadricarinatus can endocytose beads, E.coli and WSSV, but in different ways[J]. Dev Comp Immunol, 2014；Huang Z J,Kang S T,Leu J H, et al.Endocytic pathway is indicated for white spot syndrome virus(WSSV)entry in shrimp[J]. Fish Shellfish Immunol, 2013, 35 (3) : 707-715)，但其分子機(jī)制有待于進(jìn)一步的確證。前期研究中 本 申請(qǐng)人:從WSSV感染紅螯螯奸造血組織（Haematopoietic tissue, Hpt)干細(xì)胞 cDNA文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)Cq-CLC基因表達(dá)被WSSV感染誘導(dǎo)（Liu H P, Chen R Y, Zhang Q X，et al. Differential gene expression profile from haematopoietic tissue stem cells of red claw crayfish, Cherax quadricarinatus, in response to WSSV infection [J]. Dev Comp Immunol, 2011，35(7) :716-724)，提示 Cq-CLC 分子可能參與 WSSV 感染過(guò)程。
[0005] RNA干擾（RNA interference, RNAi)是一種在進(jìn)化上高度保守的、高效特異性 降解同源mRNA的現(xiàn)象。RNAi以其快速、簡(jiǎn)便地特異敲除目的基因表達(dá)特性成為鑒定基 因功能的重要研究手段，并且在人類疾病治療領(lǐng)域也具有快速發(fā)展（Czech M P，Aouadi M, Tesz G J. RNAi-based therapeutic strategies for metabolic disease[J]. Nat Rev Endocrinol, 2011，7(8):473-484)。
[0006] 在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，RNAi在典型水產(chǎn)病害防治方面也具有廣闊的應(yīng)用前景（Lima P C, Harris J 0, Cook M. Exploring RNAi as a therapeutic strategy for controlling disease in aquaculture[J]. Fish Shellfish Immunol, 2013, 34(3) :729-743) 〇


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的第一目的在于提供一種蝦類網(wǎng)格蛋白輕鏈基因。
[0008] 本發(fā)明的第二目的在于提供靶向蝦類網(wǎng)格蛋白輕鏈基因的dsRNA及其制備方法。
[0009] 本發(fā)明的第三目的在于提供Cq-CLC dsRNA的應(yīng)用。
[0010] 所述蝦類網(wǎng)格蛋白輕鏈基因?yàn)樵醋约t螯螯蝦（C.quadricarinatus)，故又命名為 Cq-CLC。所述靶向蝦類網(wǎng)格蛋白輕鏈基因的dsRNA靶向基因?yàn)镃q-CLC，故又命名為Cq-CLC dsRNA。
[0011] 所述Cq-CLC基因的序列為：
[0012] ggagtgggca gcactgacag ctggcacgac catcacacac catctacacc tctctctatc 60 accatggatg ggtttggcga tagttttgta cctctagtgg aagggtctgc accagcagca 120 gaggtggatc ctgctgcaga attcttagct cgggagcagg accagctagc tggct-tgggg 180 gacgatattc ttccagctac cctaggtcaa gatcagtcaa cagtggcatc aggccttggt 240 ggagaagctg acttgtttgg ctgtgccccc gtcaatggtg gccctgacct ggagagtttt 300 gagatgctgg gtggagatga ggttgcccaa gcccggtcgc ctattcccca tgtggtaagg 360 gaggatccag agaaaataaa aatct-ggcgt gagcaacaac ggatccgtct- ggagcagaaa 420 gatgctgctg aggaggtaag Cciagatagag cttaaggaga aagcaaggaa agagcttgaa 480 gactggtata agcagcatga agaacaggtt gctaaaacac gacaggccaa caggtctgct 540 gagaaggaac tagttgctga tacagcgaag atggaaccag gcacagagtg ggaacgaata 600 accaagttgt gcaattttaa ccctaagact tccaaatcct caagagacat ttctcgaatg 680
[0013] cgctccatc? ttctgc?ggt gaagcagiiat cctcccatcit aggctt<isiat gctcaa<ii-iac 720 ttiuitcttcc attgttatga gtitacatgta 1111<stgata cc;tgt:attat gitaacacHg 780 tatatgatca afitatgatag antc11tgcc ttactgtaga ggctacagca aa.-maaaaaa 840 i'iaa<ic'iaa<iaa <ifiaa<iaa 85?
[0014] 所述Cq-CLC dsRNA其中一鏈的序列為：
[0015] t_tacgact. cactataggg aacagtggca t.caggccttg gtggagaagc tgacttgttt 60 ggctgtgccc ecgtaiatgg tggecctgHC ctggagiigtt ttgagatgct gggtggHgat 120 gaggttgccc Hagcceggte geetattecc eatgtggtaa gggHggatix agagaaaata 180 a；ruuitctggc gtgaguaaea aeggatccgt ctggagcaga migatgetge tgaggaggta 240 agcaagatag agcttaagga gaaagcaagg aaagagcttg aagactggta taagcagcat 300 gaagaacagg ttgctaaaac acgacaggcc aacaggtctg ctgagaagga actagttgct 380 gatacagcga agatggaacc aggcacagag tgggaaegaa taaccaagtt gtgcaatlrt.t 120 aaecetaaga cttcx'aaate ctcaagagac atttctcgaa tgegetccat cattctgcag 480 gtgaagcaga atccteccat caaggcttaa atgcccctat agtgagtcgt atta 53-1
[0016] 所述Cq-CLC dsRNA的制備方法包括以下步驟：
[0017] 1)參考試劑盒設(shè)計(jì)引物及制備dsRNA ;
[0018] 2)將步驟1)所得的dsRNA(400ng/孔）轉(zhuǎn)染紅螯螯蝦Hpt細(xì)胞，檢測(cè)其對(duì)靶向基 因 Cq-CLC的敲除效率；
[0019] 3)按照步驟2)敲除Cq-CLC，并感染W(wǎng)SSV，檢測(cè)Cq-CLC敲除的Hpt細(xì)胞中WSSV入 胞量，與對(duì)照組進(jìn)行比較。
[0020] 在步驟 1)中，所述試劑盒可選用 MEGAscript? T7Transcription Kit (Ambion) 等。
[0021] 所述Cq-CLC是WSSV入胞感染重要因子，Cq-CLC dsRNA轉(zhuǎn)染能夠降低Cq-CLC表達(dá) 量，明顯降低WSSV入胞數(shù)量，因此Cq-CLC可作為抗WSSV類新藥設(shè)計(jì)或篩選的靶點(diǎn)。
[0022] 本發(fā)明根據(jù)獲得的Cq-CLC基因序列設(shè)計(jì)引物，利用試劑盒合成dsRNA，所制備的 dsRNA可以高效敲除Hpt細(xì)胞中的目的基因，并抑制WSSV入侵Hpt細(xì)胞。因此，Cq-CLC可 能是WSSV感染細(xì)胞所必需的關(guān)鍵性宿主因子，可作為抗病毒感染新靶點(diǎn)設(shè)計(jì)開發(fā)抗WSSV 藥物；Cq-CLC dsRNA可以高效抑制Cq-CLC基因表達(dá)，從而阻斷WSSV入胞途徑，為抗WSSV感 染藥物設(shè)計(jì)開發(fā)提供重要參考。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖1為PCR擴(kuò)增獲得dsRNA體外轉(zhuǎn)錄模板。
[0024] 圖2為Real-time PCR檢測(cè)所制備的Cq-CLC dsRNA轉(zhuǎn)染Hpt細(xì)胞后目的基因表達(dá) 量變化，以GFP dsRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞為參比，即為1。
[0025] 圖 3 為 Western blotting 檢測(cè) WSSV 入侵 Cq-CLC 敲除 Hpt 細(xì)胞：VP28 代表 WSSV， actin為內(nèi)參。
[0026] 圖4為用Quantity One分析圖3所示結(jié)果光密度統(tǒng)計(jì)分析圖，以GFP dsRNA為參 t匕，即為1，t檢驗(yàn)分析差異顯著性。

【具體實(shí)施方式】
[0027] 以下通過(guò)實(shí)施例結(jié)合附圖詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0028] 實(shí)施例1紅螯螯蝦Cq-CLC雙鏈RNA合成
[0029] 參照 MEGAscript? T7Transcription Kit 設(shè)計(jì)引物及制備 dsRNA。
[0030] dsDNA合成與純化
[0031] 取2ng連接有Cq-CLC cDNA全長(zhǎng)的質(zhì)粒，作為PCR模板，配制PCR反應(yīng)體系如下：
[0032] dNTP (lOmMcach) 0,4 μ? 10 xExTaq Buffer 2 μ? F 引物(ΙΟμΜ) 0,5 μ? R 引物(+10μΜ+) 0.5 μ! i .x I ;iq 0,1 μ? 校扳質(zhì)粒 WOng 無(wú)菌超純水 ~16μ1 總反應(yīng)體枳 20 μ?
[0033] 混勻后，在熱循環(huán)儀上按照以下程序進(jìn)行PCR反應(yīng)：94°C，5min ;30個(gè)循環(huán)（94°C， 30s ；60〇C,30s ；72〇C,35s) ；72〇C,3min〇
[0034] PCR產(chǎn)物在1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果。
[0035] 將單一擴(kuò)增條帶的 PCR 產(chǎn)物用 QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen,德國(guó)）純 化獲得雙鏈模板DNA。
[0036] dsRNA合成及純化
[0037] 配制dsRNA合成反應(yīng)體系如下：
[0038] 2 μ? ATP soiuiion 2 μ? GTP solution 2 μ? UTP solution 2 μΙ CTP solution 2 μ? 10X Reaction Buffer 2 μ? Enzyme Mix 1雙鏈DNA 反 1$體稿 20 μ!(補(bǔ) iff Nudease-Free 水）
[0039] 混勻后，在37°C培養(yǎng)箱孵育21?22h。
[0040] 反應(yīng)結(jié)束，取出反應(yīng)產(chǎn)物用酚氯仿抽提法提純dsRNA，具體步驟如下：
[0041] 1、在反應(yīng)EP管中加入530 μ 1 Nuclease-Free水，加入0· 5ml酚：氯仿：異戊醇 (25 : 24 : 1)，震蕩 20 次，混勻，室溫靜置 2!1^11，41：13000\8離心101^11;
[0042] 2、取上層水相于一新管中，加入0. 5ml氯仿，震蕩20次，混勻，室溫靜置2min， 4°C 13000 Xg 離心 lOmin ;
[0043] 3、取上層水相于一新管中，加入兩倍體積的異丙醇，混勻，4 °C放置30min， 4°C 13000Xg 離心 20min ;
[0044] 4、棄上清，在RNA沉淀中加入0.8ml75%的乙醇洗滌沉淀，4°C 13000Xg離心 5min ；
[0045] 5、棄上清，室溫干燥3min，加入50 μ 1無(wú) RNA酶水溶解沉淀，即得dsRNA溶液；
[0046] 6、紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA溶液的濃度和純度。
[0047] 至此完成dsRNA合成。
[0048] RNAi 試驗(yàn)
[0049] 在96孔細(xì)胞板上開展RNAi試驗(yàn)。
[0050] 1、以Cellfectin_II (Invitrogen)作為轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)dsRNA轉(zhuǎn)染，對(duì)目的基因 mRNA進(jìn)行敲除。
[0051] 2、48h后，取適量WSSV感染dsRNA處理的Hpt細(xì)胞。
[0052] lh后，收集細(xì)胞，用Western blotting檢測(cè)細(xì)胞中WSSV病毒粒子的含量；
[0053] 或者，收集細(xì)胞，提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，用定量PCR檢測(cè)目的基因 Cq-CLC 的敲除效率。本發(fā)明涉及的引物及其序列參見表1。
[0054] 表 1
[0055]

【權(quán)利要求】
1. 蝦類網(wǎng)格蛋白輕鏈基因，為源自紅螯螯蝦（C.quadricarinatus)，故又命名為 Cq-CLC〇
2. 靶向蝦類網(wǎng)格蛋白輕鏈基因的dsRNA靶向基因，為Cq-CLC，故又命名為 Cq-CLCdsRNA。 3. Cq_CLC基因的序列為： g，gtggg€.a gcact gacag gtggeacgae catcacacac ca.tctaeacc tctetetaie 60 accatggHtg ggtttggcga tagttttgtH cctctagtgg aagggtctgc aca-igcagca 120 gnggtggHtc ctgctgcaga eggga.gc卿τ 補(bǔ)c tggetf.gggg 180 g'acgi-jtat.te cctaggteari gateagteaa eagf.ggeat-c aggecttggt 240 ggagaagctg acttgtttgg ctgtgccccc gtcaatggti gccctgacct ggagagtttt 300 gagatgctgg gtggagatga igttgcccaa gcecggtcgc etattcccca tgtggtaagg 360 gaggatccag agaaaataaa aatctggcgt gagcaacaac ggatccgtct ggagcagaaa 420 gatgctgctg aggaggtaag caagatagag cttaaggaga aagcaaggaa agagcttgaa -?80 gactggtata agcagcatga agaacaggft gctaaaacac gacaggccaa caggtctgct 540 gagaaggaac tagttgctga tacagcgaag atggaaecag gcacagagtg ggaacgaata 600 m-cecf<)figuct fee mm tcct cuagagcieaf tt.ct.egmitg 860 cgctccatCH ttctgCHggt gaagaigaat ceteceatca aggettiumt gctxaaaaac； 720 ttaatcttcc a11g11atga gctachtgtn ttttatgata ectgtattat gttaacacag 780 tatatgatea agtatgatiig aiitctttgec ttaetgtaga ggctacagca aaaaaaaaaa 840 aaaaaaaaaa aaaaaaa 857s
4. 如權(quán)利要求2所述Cq-CLC dsRNA，其中一鏈的序列為： tcjatacgact cactataggg aaeagtggca teaggeettg gtggagaagc tgact*tgttt 60 ggetgtgccc ccgtcaatgg tggccctgac ctggagagtt ttgagatget gggtggagat 120 gaggttgccc aagcccggtc gcctattcce catgtggtaa gggaggatcc 180 aaaatctggc gtgageaaca acggatec-gt c-tggagetiga aagatgclrgc tgaggaggta 240 agcaagatag agettaagga gaaagcaagg iiaagagcttg aagaetggta taageageat 300 guagacjcagg ttgctcHiaac acgHcaggcc aacaggtctg ctgagaagga actagttgct 360 gatacagcga agatggaacc aggcacagag tgggaacgaa taaceaagtt: gtgcaatttt 420 aaccctmiga ettcxaaatc ctcaagagac atttetcgaa fg(-'geti-'cat cattctgcag 480 gtgaageaga atectcccat caaggcttaa. atgcccctat agtgagtcgt atta 534,
5. 如權(quán)利要求2所述Cq-CLC dsRNA的制備方法，其特征在于包括以下步驟： 1)參考試劑盒設(shè)計(jì)引物及制備dsRNA ; 2) 將步驟1)所得的dsRNA轉(zhuǎn)染紅螯螯蝦Hpt細(xì)胞，檢測(cè)其對(duì)靶向基因 Cq-CLC的敲除 效率；dsRNA 為 400ng/ 孔； 3) 按照步驟2)敲除Cq-CLC，并感染W(wǎng)SSV，檢測(cè)Cq-CLC敲除的Hpt細(xì)胞中WSSV入胞 量，與對(duì)照組進(jìn)行比較。
6. 如權(quán)利要求5所述Cq-CLC dsRNA的制備方法，其特征在于在步驟1)中，所述試劑盒 選用 IVIK lAsui.ipl 丨、' T7Transcription Kit (Ambion)。
7. 如權(quán)利要求1所述Cq-CLC作為抗WSSV類新藥設(shè)計(jì)或篩選的靶點(diǎn)。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104059923SQ201410327740
【公開日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2014年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月10日
【發(fā)明者】劉海鵬, 陳榮元, 王克堅(jiān) 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)