一種miRNA、miRNA的前體、以及它們的編碼基因和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種miRNA、miRNA的前體、以及它們的編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明保護(hù)一種miRNA，如序列表的序列2所示。編碼所述miRNA的基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明還保護(hù)一種RNA(miRNA的前體)，如序列表的序列1所示。編碼所述RNA的基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。含有編碼所述RNA的基因的DNA分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明還保護(hù)一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將編碼所述miRNA的基因、編碼所述RNA的基因或序列表的序列3自5’末端第9-387位核苷酸所示的DNA分子導(dǎo)入目的植物，得到耐冷性高于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明對(duì)于培育耐冷植物，從而增加植物產(chǎn)量具有重大價(jià)值。
【專利說(shuō)明】—種miRNA、miRNA的前體、以及它們的編碼基因和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種miRNA、miRNA的前體、以及它們的編碼基因和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]低溫冷害嚴(yán)重影響植物生長(zhǎng)發(fā)育及作物產(chǎn)量，已經(jīng)成為農(nóng)作物生產(chǎn)的重要限制因子。作為一種冷敏感型農(nóng)作物，水稻從種子發(fā)芽到成熟的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育期間都極易受到冷害威脅，嚴(yán)重時(shí)致水稻減產(chǎn)30% -40%。因此，解決水稻冷害問(wèn)題對(duì)于提高水稻產(chǎn)量、品質(zhì)，促進(jìn)水稻產(chǎn)區(qū)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重大的戰(zhàn)略意義。隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的日趨成熟，通過(guò)轉(zhuǎn)基因分子育種培育耐冷轉(zhuǎn)基因水稻已成為可能。
[0003]miRNA (microRNA,微小RNA)是一類在生物體中廣泛存在的長(zhǎng)度約為20_24nt的內(nèi)源單鏈非編碼小分子RNA。近年來(lái)大量研究表明，miRNA通過(guò)完全/不完全與靶mRNA3’UTR互補(bǔ)結(jié)合抑制靶mRNA的翻譯或直接介導(dǎo)靶mRNA的降解，進(jìn)而調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育以及逆境脅迫應(yīng)答等眾多重要生物學(xué)過(guò)程。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種miRNA、miRNA的前體、以及它們的編碼基因和應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明保護(hù)一種miRNA，如序列表的序列2所示。編碼所述miRNA的基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。含有編碼所述miRNA的基因的DNA分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。含有編碼所述miRNA的基因的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0006]本發(fā)明還保護(hù)一種RNA (miRNA的前體)，如序列表的序列I所示。編碼所述RNA的基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。含有編碼所述RNA的基因的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0007]含有編碼所述miRNA的基因的DNA分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。含有編碼所述miRNA的基因的DNA分子具體可如序列表的序列3自5’末端第9-387位核苷酸所示。含有序列表的序列3自5’末端第9-387位核苷酸所示的DNA分子的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組質(zhì)粒具體可為在pCAMBIA330035Su載體中插入序列表的序列3自5’末端第9-387位核苷酸所示的雙鏈DNA分子得到的重組質(zhì)粒 pCAMBIA-pre-miR1868。
[0008]本發(fā)明還保護(hù)一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將編碼所述miRNA的基因、編碼所述RNA的基因或序列表的序列3自5’末端第9-387位核苷酸所示的雙鏈DNA分子導(dǎo)入目的植物，得到耐冷性高于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。所述方法具體可為:將重組質(zhì)粒pCAMBIA-pre-miR1868導(dǎo)入目的植物，得到耐冷性高于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物具體可為水稻，如水稻品種“空育131”。
[0009]所述耐冷性高具體可體現(xiàn)為如下(I )、( II )、( III)和(IV )中的至少一種:
[0010]( I )在低溫環(huán)境中，所述轉(zhuǎn)基因植物的存活率高于所述目的植物；
[0011]( II )在低溫環(huán)境中，所述轉(zhuǎn)基因植物地上部分的游離脯氨酸含量高于所述目的植物；
[0012](III)在低溫環(huán)境中，所述轉(zhuǎn)基因植物葉片的可溶性糖含量高于所述目的植物；
[0013](IV )在低溫環(huán)境中，所述轉(zhuǎn)基因植物葉片的電導(dǎo)率低于所述目的植物。
[0014]以上任一所述低溫環(huán)境具體可為4°C環(huán)境。
[0015]本發(fā)明還保護(hù)編碼所述miRNA的基因、編碼所述RNA的基因或序列表的序列3自5’末端第9-387位核苷酸所示的雙鏈DNA分子在培育耐冷植物中的應(yīng)用。所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物具體可為水稻，如水稻品種“空育131”。
[0016]本發(fā)明對(duì)于培育耐冷植物，從而增加植物產(chǎn)量具有重大價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1為miR1868的相對(duì)表達(dá)量。
[0018]圖2為重組質(zhì)粒的構(gòu)建流程示意圖。
[0019]圖3為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0020]圖4為重組質(zhì)粒pCAMBIA-pre-miR1868的部分元件示意圖。
[0021]圖5為再生植株P(guān)CR鑒定的部分結(jié)果。
[0022]圖6為PCR陽(yáng)性植株Southern Blot鑒定的結(jié)果。
[0023]圖7為轉(zhuǎn)基因水稻株系中miR1868的相對(duì)表達(dá)量。
[0024]圖8為轉(zhuǎn)基因水稻的耐冷性分析的結(jié)果。
[0025]圖9為轉(zhuǎn)pre_miR1868水稻冷脅迫下生理指標(biāo)的測(cè)定的結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0026]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。農(nóng)桿菌菌株EHA105:上海邁其生物科技有限公司。
[0027]pCAMBIA330035Su 載體:參考文獻(xiàn):Advancing uracil-excis1n based cloningtowards an ideal technique for cloning PCR fragments,Hussam H.Nour-Eldin, BjarneG.Hansen, Morten H.H.Norhohn, Jacob K.Jensen and Barbara A.Halkier, NucleicAcids Research, 2006，3(18):el22。
[0028]水稻品種“空育131”:黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院水稻研究所；參考文獻(xiàn):孟昭河，黃少鋒，張莉萍，劉國(guó)權(quán)，劉永巍，劉勝國(guó)，水稻新品種空育131特性及優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)栽培技術(shù)，墾殖與稻作，2002 (5): 28-29。
[0029]實(shí)施例1、miR1868的發(fā)現(xiàn)和表達(dá)模式
[0030]一、miR1868 的發(fā)現(xiàn)
[0031]發(fā)明人通過(guò)芯片技術(shù)構(gòu)建水稻苗期冷脅迫miRNA表達(dá)譜，將篩選出的一個(gè)miRNA命名為miR1868。
[0032]miR1868的前體序列如序列表的序列I所示。
[0033]miR1868的前體序列長(zhǎng)度為169bp，其中包含水稻miR1868成熟體序列(見序列表的序列2)以及一個(gè)發(fā)卡結(jié)構(gòu)。
[0034]二、miR1868的表達(dá)模式
[0035]取成熟的、飽滿的水稻品種“空育131”的種子，42°C處理3_5天以打破休眠，去皮后用10% NaClO水溶液滅菌30分鐘，然后用無(wú)菌蒸餾水清洗5遍，然后置于黑暗條件下浸種I天，然后將萌動(dòng)的水稻種子轉(zhuǎn)移至30°C黑暗培養(yǎng)I天以催芽，然后將萌發(fā)的水稻苗轉(zhuǎn)移到Y(jié)oshida營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)至三葉期(28°C、12h光照；25°C、12h黑暗)，然后將水稻苗置于4°C光照培養(yǎng)Oh、0.5h、Ih、3h、6h、9h、12h或24h，然后分別取地上部分，液氮速凍，備用。
[0036]提取地上部分的總RNA，電泳檢測(cè)結(jié)果表明28S與18S亮度比值接近2:1，且無(wú)降解拖尾,證明總RNA提取質(zhì)量好。
[0037]將總RNA進(jìn)行DNA消化后,采用Super Script III反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,合成cDNA第一鏈。以cDNA為模板，采用Fl和Rl組成的引物對(duì)進(jìn)行RT-PCR以檢測(cè)miR1868，采用F2和R2組成的引物對(duì)進(jìn)行RT-PCR以檢測(cè)osa-elfl-α基因(內(nèi)參基因)，miR1868的相對(duì)表達(dá)量見圖1。結(jié)果表明，miR1868在水稻冷脅迫來(lái)臨時(shí)，表達(dá)量持續(xù)下調(diào)，冷處理3h下調(diào)接近10倍，達(dá)到最大幅度。
[0038]Fl:5’ -CCAAGGCATTGTTCTTACCG-3’ ；
[0039]Rl:5，-TTGCAAGAAACACACCGTTT-3，。
[0040]F2:5， -AGCCTCCTCCTCTCGCCAT-3，；
[0041 ] F2:5，-TGTTCATCTCAGCGGCTTC-3，。
[0042]實(shí)施例2、轉(zhuǎn)基因植物的獲得和鑒定
[0043]一、重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0044]重組質(zhì)粒的構(gòu)建流程示意圖見圖2。
[0045]1、提取水稻品種“空育131”的葉片的基因組DNA。
[0046]2、以步驟I提取的基因組DNA為模板，采用F3和R3組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(394bp)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖3。
[0047]F3:5， -GGCTTAAUGCCCAAGCGGTAGTTGTCTC-3> ；
[0048]R3:5， -GGTTTAAUCGTTTAGAAGCTCGGGAAGC-3，。
[0049]PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列見序列表的序列3。
[0050]3、用限制性內(nèi)切酶PaCI和Nt.BbvCI酶切pCAMBIA330035Su載體，回收約9.5kb的酶切產(chǎn)物。
[0051 ] 4、將步驟3的酶切產(chǎn)物、步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和USER酶(New EnglandB1labs)，37°C溫育 20min、然后 25°C溫育 20min，得到重組質(zhì)粒 pCAMBIA-pre_miR1868。
[0052]重組質(zhì)粒pCAMBIA-pre-miR1868的部分元件示意圖見圖4。根據(jù)測(cè)序結(jié)果,對(duì)重組質(zhì)粒pCAMBIA-pre-miR1868進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下:在pCAMBIA330035Su載體的兩個(gè)PaCI酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列3自5’末端第9-387位核苷酸所示的雙鏈DNA分子。
[0053]二、轉(zhuǎn)基因水稻的獲得
[0054]1、將重組質(zhì)粒pCAMBIA-pre-miR1868導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株EHA105，得到重組農(nóng)桿菌。
[0055]2、用步驟I得到的重組農(nóng)桿菌的菌液侵染水稻品種“空育131”的胚性愈傷組織20min，然后將愈傷組織轉(zhuǎn)接到共培養(yǎng)培養(yǎng)基(含20mg/L乙酰丁香酮的NB培養(yǎng)基，pH5.2)，25 °C黑暗培養(yǎng)2-4天。
[0056]3、完成步驟2后，取愈傷組織，用500mg/L頭孢霉素?zé)o菌水溶液清洗，然后接種至篩選培養(yǎng)基(含15mg/L固殺草和100mg/L阿莫西林克拉維酸鉀的NB培養(yǎng)基，pH5.8)，32°C、24h光照條件下培養(yǎng)6周(每?jī)芍芾^代一次)。
[0057]4、完成步驟3后，取愈傷組織，接種至分化培養(yǎng)基(含30g/L山梨醇、2g/L酪蛋白水解物、100mg/L阿莫西林克拉維酸鉀、2mg/L KT和0.02mg/L NAA的MS培養(yǎng)基，pH5.8)，首先在25°C、黑暗的條件下培養(yǎng)5-7天，然后轉(zhuǎn)移至26°C、16h光照/8h黑暗的條件下培養(yǎng)至愈傷組織表面有綠點(diǎn)產(chǎn)生。
[0058]5、完成步驟4后，將有綠點(diǎn)的愈傷組織轉(zhuǎn)移至新的分化培養(yǎng)基，在26°C、16h光照/Sh黑暗的條件下培養(yǎng)至再生芽長(zhǎng)度約為2cm。
[0059]6、完成步驟5后，將幼苗轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基(含100mg/L阿莫西林克拉維酸鉀的MS培養(yǎng)基，pH5.8)，在26°C、16h光照/8h黑暗的條件下培養(yǎng)至株高為10-15cm且根系發(fā)達(dá)，共得到17株再生植株隊(duì)代)。
[0060]7、將步驟6得到的再生植株移栽到事先拌好的培養(yǎng)基質(zhì)(培養(yǎng)基質(zhì)的組成:1質(zhì)量份草炭土 +1質(zhì)量份君子蘭土 +3質(zhì)量份土壤)，澆水，先放置在暗光條件下培養(yǎng)3-5天，然后移至戶外正常培養(yǎng)。
[0061]8、分別取17株再生植株的葉片，提取基因組DNA，采用Bar_sp和Bar_asp組成的引物對(duì)(以Bar基因?yàn)榘谢?，目的片段大?52bp)進(jìn)行PCR鑒定，
[0062]Bar-sp: 5，-ATGAGCCCAGAACGACGCCC-3，；
[0063]Bar-asp:5’-TCAAATCTCGGTGACGGGCA-3’ 。
[0064]部分結(jié)果見圖5。圖5中，代表空白對(duì)照(水)，“NT”代表陰性對(duì)照(水稻品種“空育131”，“ + ”代表陽(yáng)性對(duì)照(重組質(zhì)粒pCAMBIA-pre-miR1868)，1-12為部分再生植株。結(jié)果表明，17株再生植株中，11株P(guān)CR鑒定為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為64.7%。
[0065]9、分別取PCR鑒定陽(yáng)性的11株再生植株的葉片，提取基因組DNA并用限制性內(nèi)切酶Hind III酶切,采用地高辛標(biāo)記的Bar基因片段進(jìn)行Southern Blot鑒定。Southern雜交采用的探針的核苷酸序列如序列表的序列4所示。
[0066]部分結(jié)果見圖6。圖6中，NT代表陰性對(duì)照(水稻品種“空育131” )，1-9為部分PCR鑒定陽(yáng)性的再生植株。11株P(guān)CR鑒定陽(yáng)性的植株中的9株，pre-miR1868均已經(jīng)成功的整合到水稻基因組中，并且不同植株的插入位點(diǎn)不同，插入的拷貝數(shù)不同。
[0067] 10、分別取Southern Blot鑒定陽(yáng)性的植株的嫩葉，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，采用Fl和Rl組成的引物對(duì)進(jìn)行RT-PCR以檢測(cè)miR1868，采用F2和R2組成的引物對(duì)進(jìn)行RT-PCR以檢測(cè)osa-elfl-α基因(內(nèi)參基因)。部分植株的結(jié)果見圖7。圖7中，WT代表水稻品種“空育131”，1-3代表不同Southern Blot鑒定陽(yáng)性的植株。結(jié)果表明pre-miR1868能夠正常的轉(zhuǎn)錄，并且在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)量要高于未轉(zhuǎn)基因水稻。
[0068]11、將步驟10中Southern Blot鑒定陽(yáng)性的植株自交,每個(gè)單株分別收獲T1代種子，按照步驟9的方法對(duì)T1代種子長(zhǎng)成的植株進(jìn)行Southern Blot鑒定^^Southern Blot鑒定陽(yáng)性的T1代植株進(jìn)行自交，每個(gè)單株分別收獲T2代種子，按照步驟9的方法對(duì)T2代種子長(zhǎng)成的植株進(jìn)行Southern Blot鑒定；對(duì)于某一 T1代植株來(lái)說(shuō)，如果其自交得到的T2代植株均為Southern Blot鑒定陽(yáng)性，該T1代植株為一個(gè)純合的轉(zhuǎn)基因植株，該T1代植株及其自交后代為一個(gè)純合的轉(zhuǎn)基因株系。
[0069]隨機(jī)取兩個(gè)純合的轉(zhuǎn)基因株系(0X-4株系和0X-6株系)進(jìn)行步驟四和步驟五的鑒定。
[0070]三、轉(zhuǎn)空載體水稻的獲得
[0071]用pCAMBIA330035Su載體代替重組質(zhì)粒pCAMBIA-pre_miR1868，其它同步驟二，得到轉(zhuǎn)空載體水稻。
[0072]四、轉(zhuǎn)基因水稻的耐冷性分析
[0073]分別取0X-4株系的T2代種子、0X-6株系的T2代種子、轉(zhuǎn)空載體水稻的T2代種子和水稻品種“空育131”(WT)的種子進(jìn)行如下鑒定:
[0074]1、取種子，42°C處理3-5天以打破休眠，消毒后置于濕潤(rùn)濾紙上黑暗條件下發(fā)芽。
[0075]2、完成步驟I后，取發(fā)芽的種子，移至Youshida營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)至苗高為3cm。
[0076]3、取步驟2得到的幼苗，移至去除底部的96孔板中，使用Youshida營(yíng)養(yǎng)液，培養(yǎng)(培養(yǎng)條件:28°C、12h光照/25°C、12h黑暗)至3葉期，然后在4°C、12h光照/12h黑暗的條件下培養(yǎng)4天(冷脅迫處理)，然后再恢復(fù)培養(yǎng)(培養(yǎng)條件:28°C、12h光照/25°C、12h黑暗)14天。
[0077]冷脅迫處理前的植株照片見圖8A，恢復(fù)培養(yǎng)14天后的植株照片見圖SB，冷脅迫處理前和恢復(fù)培養(yǎng)14天后的存活率見圖SC。存活率為三次試驗(yàn)的平均值，每次試驗(yàn)中每個(gè)株系統(tǒng)計(jì)100株植株。轉(zhuǎn)空載體水稻的表型和存活率與水稻品種“空育131”的表型和存活率均一致。
[0078]4、取步驟2得到的幼苗，移至營(yíng)養(yǎng)土中，培養(yǎng)(培養(yǎng)條件:28°C、12h光照/25°C、12h黑暗)至3葉期，然后在4°C、12h光照/12h黑暗的條件下培養(yǎng)4天(冷脅迫處理)，然后再恢復(fù)培養(yǎng)(培養(yǎng)條件:28°C、12h光照/25°C、12h黑暗)14天。
[0079]冷脅迫處理前的植株照片見圖8D，恢復(fù)培養(yǎng)14天后的植株照片見圖SE，冷脅迫處理前和恢復(fù)培養(yǎng)14天后的存活率見圖8F。存活率為三次試驗(yàn)的平均值，每次試驗(yàn)中每個(gè)株系統(tǒng)計(jì)100株植株。轉(zhuǎn)空載體水稻的表型和存活率與水稻品種“空育131”的表型和存活率均一致。
[0080]步驟3和步驟4的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)pre-miR1868株系冷脅迫后的存活率顯著高于野生型，即pre-miR1868超量表達(dá)能夠增強(qiáng)水稻對(duì)冷脅迫的耐受性。
[0081]五、轉(zhuǎn)pre_miR1868水稻冷脅迫下生理指標(biāo)的測(cè)定
[0082]植物在遭受到冷脅迫時(shí)，植物體內(nèi)的物質(zhì)含量會(huì)發(fā)生改變，尤其是細(xì)胞體內(nèi)游離脯氨酸及可溶性糖。由于植物遭受冷害使細(xì)胞膜會(huì)發(fā)生變化，細(xì)胞內(nèi)的這些物質(zhì)的積累，能夠增加胞質(zhì)的濃度，減少冷害對(duì)細(xì)胞膜的損害。
[0083]分別取0X-4株系的T2代種子、0X-6株系的T2代種子、轉(zhuǎn)空載體水稻的T2代種子和水稻品種“空育131”(WT)的種子進(jìn)行如下鑒定:
[0084]步驟I至3同步驟三的1-3。
[0085]檢測(cè)水稻植株地上部分游離脯氨酸含量的方法參見文獻(xiàn):王學(xué)奎，植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù).北京:高等教育出版社，2006.p278-279。
[0086]檢測(cè)葉片中可溶性糖含量的方法參見文獻(xiàn):王學(xué)奎，植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù).北京:高等教育出版社，2006.p202-203。
[0087]檢測(cè)葉片的電導(dǎo)率的方法參見文獻(xiàn):李海林，殷緒明，龍小軍.低溫脅迫對(duì)水稻幼苗抗寒性生理生化指標(biāo)的影響[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006.11:50-53。
[0088]冷脅迫處理前的植株和剛完成冷脅迫處理的植株地上部分的游離脯氨酸含量見圖9A(三次試驗(yàn)的平均值，每次試驗(yàn)中每個(gè)株系統(tǒng)計(jì)100株植株)。冷脅迫處理前，轉(zhuǎn)pre-miR1868水稻體內(nèi)的游離脯氨酸含量與野生型沒(méi)有顯著差別。冷脅迫處理后，野生型水稻和轉(zhuǎn)pre-miR1868水稻體內(nèi)的游離脯氨酸含量都急劇增加，但轉(zhuǎn)pre_miR1868水稻體內(nèi)游離脯氨酸的增加量明顯高于野生型水稻。各個(gè)階段轉(zhuǎn)空載體水稻的結(jié)果與水稻品種“空育131”均一致。
[0089]冷脅迫處理前的植株和剛完成冷脅迫處理的植株葉片中的可溶性糖含量見圖9B(三次試驗(yàn)的平均值，每次試驗(yàn)中每個(gè)株系統(tǒng)計(jì)100株植株)。冷脅迫處理前，轉(zhuǎn)pre-miR1868水稻體內(nèi)的可溶性糖含量即顯著高于野生型水稻。冷脅迫處理后，野生型水稻和轉(zhuǎn)pre-miR1868水稻體內(nèi)的可溶性糖含量含量都急劇增加，但轉(zhuǎn)pre-miR1868水稻體內(nèi)可溶性糖的增加量明顯高于野生型水稻。各個(gè)階段轉(zhuǎn)空載體水稻的結(jié)果與水稻品種“空育131”均一致。
[0090]冷脅迫處理前的植株和剛完成冷脅迫處理的植株葉片的電導(dǎo)率見圖9C(三次試驗(yàn)的平均值，每次試驗(yàn)中每個(gè)株系統(tǒng)計(jì)100株植株)。冷脅迫處理前，轉(zhuǎn)pre-miR1868水稻的電導(dǎo)率與野生型水稻沒(méi)有顯著差別。冷脅迫處理后，轉(zhuǎn)pre-miR1868水稻的電導(dǎo)率顯著低于野生型水稻。各個(gè)階段轉(zhuǎn)空載體水稻的結(jié)果與水稻品種“空育131”均一致。
[0091]以上結(jié)果表明，在冷脅迫處理后，轉(zhuǎn)pre_miR1868的水稻植株細(xì)胞內(nèi)的可溶性物質(zhì)含量增多，細(xì)胞膜的完整性得到保護(hù)，使植株的耐冷性得到了提高。
【權(quán)利要求】
1.一種miRNA，如序列表的序列2所示。
2.—種RNA，如序列表的序列I所示。
3.編碼權(quán)利要求1所述miRNA的基因。
4.編碼權(quán)利要求2所述RNA的基因。
5.含有權(quán)利要求3或4所述基因的DNA分子。
6.如權(quán)利要求5所述的DNA分子，其特征在于:所述DNA分子如序列表的序列3自5’末端第9-387位核苷酸所示。
7.含有權(quán)利要求3所述基因、權(quán)利要求4所述基因、權(quán)利要求5所述DNA分子或權(quán)利要求6所述DNA分子的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
8.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求3所述基因、權(quán)利要求4所述基因、權(quán)利要求5所述DNA分子或權(quán)利要求6所述DNA分子導(dǎo)入目的植物，得到耐冷性高于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物。
10.權(quán)利要求1所述miRNA、權(quán)利要求2所述RNA、權(quán)利要求3所述基因、權(quán)利要求4所述基因、權(quán)利要求5所述DNA分子或權(quán)利要求6所述DNA分子在培育耐冷植物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N1/15GK104164425SQ201410327915
【公開日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2014年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月10日
【發(fā)明者】孫曉麗, 朱延明, 端木慧子, 王孫婷, 孫中文 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)