一種蚜蟲共生菌基因的dsRNA及其在抑制蚜蟲生長中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種蚜蟲共生菌基因的dsRNA及其在抑制蚜蟲生長中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的dsRNA，為由序列表中序列2所示的核苷酸和其反向互補(bǔ)序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明得到麥蚜體內(nèi)共生菌Hamiltonella?defensa28469基因，采用體外飼喂dsRNA方法，可抑制或沉默麥蚜體內(nèi)共生菌Hamiltonella?defensa28469基因，導(dǎo)致麥蚜生長發(fā)育受阻并產(chǎn)生致死效應(yīng)。
【專利說明】【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種蚜蟲共生菌基因的dsRNA及其在抑制蚜 蟲生長中的應(yīng)用。 一種蚜蟲共生菌基因的dsRNA及其在抑制蚜蟲生長中的應(yīng) 用 【背景技術(shù)】
[0002] 麥蚜是危害中國小麥生產(chǎn)的主要害蟲之一，據(jù)統(tǒng)計，中國每年小麥蚜蟲危害面積 可高達(dá)0. 17億公頃，占小麥總種植面積的62%，造成減產(chǎn)15% -30%，嚴(yán)重時可高達(dá)50%。 近年來，由于全球氣候變暖、耕作制度變化等因素，使蚜蟲的繁殖能力和適應(yīng)性顯著增強(qiáng)， 其危害日趨嚴(yán)重。目前，蚜蟲防治以噴灑農(nóng)藥為主，但大量使用農(nóng)藥，不僅對人畜有害，而且 造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。培育抗蚜蟲小麥和蔬菜品種是防止蚜蟲危害的最有效途徑，但由 于現(xiàn)有種質(zhì)資源中缺乏有效的抗蚜基因，抗性機(jī)制尚不明確，常規(guī)育種難以奏效。挖掘和利 用新型抗蚜基因并通過基因工程培育小麥抗蚜新種質(zhì)具有重要意義。
[0003] 植物介導(dǎo)的RNAi技術(shù)已成為農(nóng)作物抗蟲基因工程的熱點(diǎn)之一，RNAi現(xiàn)象其作用 過程是雙鏈RNA(dsRNA)進(jìn)入生物體內(nèi)，被Dicer酶切割成21-23nt的siRNA，siRNA與RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合物結(jié)合，與互補(bǔ)序列的靶mRNA結(jié)合，被Dicer識別，造成靶基因表達(dá)量的下 降。近年來，利用dsRNA體外飼喂或注射來篩選RNA靶標(biāo)基因，導(dǎo)致靶標(biāo)基因表達(dá)和沉默，已 經(jīng)廣泛應(yīng)用于昆蟲生長發(fā)育關(guān)鍵基因的鑒定和功能分析。孟山都公司通過植物介導(dǎo)的昆蟲 腸道特異基因 RNAi技術(shù)成功獲得了抗玉米根螟的轉(zhuǎn)基因玉米，有效緩解了長期應(yīng)用Bt轉(zhuǎn) 基因玉米誘發(fā)昆蟲產(chǎn)生抗性等問題，目前已完成生產(chǎn)性試驗。棉鈴蟲腸道中特異P450基因 可提高棉鈴蟲幼蟲對棉花次生代謝物質(zhì)和棉酚的耐受性，試驗表明，利用表達(dá)棉鈴蟲P450 基因 dsRNA的轉(zhuǎn)基因煙草和棉花葉片飼喂棉鈴蟲幼蟲，可導(dǎo)致幼蟲體內(nèi)P450基因的表達(dá)量 下降，同時幼蟲發(fā)育受阻，表現(xiàn)出抗棉鈴蟲性能。
[0004] 共生菌在昆蟲體內(nèi)的生長、繁殖過程中起著十分重要的作用，如營養(yǎng)功能、解毒作 用、調(diào)控生殖及與寄主適應(yīng)性等等。Hamiltonella defensa是半翅目昆蟲體內(nèi)存在的一 種次級共生細(xì)菌，存在于刺吸食害蟲如蚜蟲、木虱和粉虱體等昆蟲體內(nèi)。在蚜蟲體內(nèi)中， Hamiltonella defensa在含菌體、腸道、卵巢等部位存在。通過寄主植物表達(dá)相應(yīng)昆蟲寄生 菌特異基因的dsRNA，昆蟲取食植物后沉默其體內(nèi)相應(yīng)的共生菌的基因，導(dǎo)致共生菌死亡或 者數(shù)量下降，影響昆蟲的正常生長，從而達(dá)到控制害蟲危害的目的。通過RNAi技術(shù)沉默共 生菌相關(guān)基因的方式，間接控制蚜蟲的研究還尚未有報道。此研究將為挖掘有效的RNAi靶 標(biāo)基因及利用其創(chuàng)制新型抗蚜轉(zhuǎn)基因新種質(zhì)奠定基礎(chǔ)。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個目的是提供了 dsRNA。
[0006] 本發(fā)明提供的dsRNA，為由序列表中序列2所示的核苷酸和其反向互補(bǔ)序列所示 的核苷酸組成的雙鏈RNA。
[0007] 上述dsRNA的編碼基因或含有該編碼基因的DNA片段也是本發(fā)明保護(hù)的范圍，上 述dsRNA的編碼基因具體為序列表中序列1所示的核苷酸。
[0008] 上述dsRNA或上述的編碼基因在如下1)_4)中至少一種中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù) 的范圍：
[0009] 1)防治蚜蟲或制備防治蚜蟲產(chǎn)品；
[0010] 2)促進(jìn)蚜蟲死亡或制備促進(jìn)蚜蟲死亡產(chǎn)品；
[0011] 3)抑制蚜蟲生長中或制備抑制蚜蟲生長產(chǎn)品；
[0012] 4)抑制姆蟲體內(nèi)共生菌Hamiltonella defensa28469基因的表達(dá)或在制備抑制 蟲牙蟲體內(nèi)共生菌Hamiltonella defensa28469基因的表達(dá)產(chǎn)品。
[0013] 上述應(yīng)用為將上述dsRNA導(dǎo)入蚜蟲，實現(xiàn)防治蚜蟲、促進(jìn)蚜蟲死亡、抑制蚜蟲生長 和/或抑制姆蟲體內(nèi)共生菌Hamiltonella defensa28469基因的表達(dá)；所述導(dǎo)入具體為飼 喂；
[0014] 所述蚜蟲為麥蚜。
[0015] 本發(fā)明的另一個目的是提供具有功能的產(chǎn)品，其活性成分為上述dsRNA或其編碼 基因；
[0016] 所述功能為如下1)-4)中任意一種：1)防治蚜蟲；2)促進(jìn)蚜蟲死亡；3)抑制蚜蟲 生長；4)抑制姆蟲體內(nèi)共生菌Hamiltonella defensa28469基因表達(dá)。
[〇〇17] 所述蚜蟲為麥蚜。
[0018] 姆蟲體內(nèi)共生菌Hamiltonella defensa28469基因的核苷酸序列為序列表中序列 1〇
[0019] 本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明得到麥姆的共生菌Hamiltonella defensa28469cDNA 的保守序列的dsRNA，采用體外飼喂dsRNA方法，進(jìn)行了利用RNAi技術(shù)沉默麥蚜體內(nèi)共生 菌Hamiltonella defensa28469基因，導(dǎo)致麥蚜產(chǎn)生致死效應(yīng)，并且隨著飼喂時間延長，麥 蚜的死亡率均逐漸增加。對飼喂后蚜蟲體內(nèi)共生菌Hamiltonella defensa28469基因?qū)崟r 熒光定量PCR研究表明，28469的表達(dá)明顯受到抑制。表明蚜蟲體內(nèi)共生菌Hamiltonella defensa的28469基因的保守序列可應(yīng)用于通過植物介導(dǎo)的RNAi技術(shù)提高小麥抗蚜性的研 究。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1蚜蟲體內(nèi)共生菌Hamiltonella defensa28469基因和GFP的PCR擴(kuò)增
[0021] 圖2姐蟲體內(nèi)共生菌Hamiltonella defensa28469基因和GFP的體外合成dsRNA 【具體實施方式】
[0022] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0023] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0024] 下述實施例中麥蚜（錢幼亭，周廣和，張淑香，張向才.麥蚜有性世代的研究.植 物保護(hù)，1982, 1:14-15。公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué) 院植物保護(hù)研究所提供，飼養(yǎng)蚜蟲的小麥品種為科農(nóng)199,將蚜蟲接種到小麥幼苗上，放入 人工氣候箱中（溫度（20±2)°C，濕度60%-80%，光周期L : D = 16 : 8)進(jìn)行繁殖。
[0025] 質(zhì)粒提取試劑盒購自Biomega公司，內(nèi)切酶BamH I、EcoR V及Hiscribe T7體外 轉(zhuǎn)錄試劑盒購自NEB公司，大腸桿菌菌株DH5 α、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金公司，rTaq DNA 聚合酶購自 TaKaRa 公司，MinElute PCR Cleaning Kit、MinElute Gel Extraction Kit、RNA Cleaning Kit購自Qiagen公司，各種氨基酸及其它試劑均購自北京拜爾迪公司。
[0026] 實施例1、姆蟲體內(nèi)共生菌Hamiltonella defensa28469基因的dsRNA的獲得
[0027] 1、麥蚜總RNA的提取和cDNA的合成
[0028] 分別取約20頭麥蚜，按照北京全式金公司的Trizol試劑盒說明書提取總RNA，用 RNA Cleaning Kit進(jìn)行純化，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，操作步驟均參考試劑盒說明書。
[0029] 2、引物設(shè)計與基因克隆
[0030] 根據(jù)麥蚜腸道轉(zhuǎn)錄組測序得到蚜蟲共生菌相關(guān)基因28469 (獲得的28469的一個 片段用于RNAi干擾），利用Primer Primer5. 0軟件設(shè)計引物P1 (表1)，由北京華大基因公 司合成。綠色熒光蛋白基因（GFP)片段從國家小麥改良中心實驗室保存的GFP質(zhì)粒上擴(kuò)增， 利用Primer Primer5. 0軟件設(shè)計引物P2 (表1)。
[0031] PCR 反應(yīng)體系為 10 X PCR Buffer5 μ L、dNTP (2. 5mmol · Γ1) 4 μ L、rTaqO. 5 μ L， Forward primer (20 μ mol · I71) 1 μ L、Reverse primer (20 μ mol · I71) 1 μ L、cDNA/GFP 質(zhì)粒 lyL，用 ddH20 補(bǔ)足至 50yL。PCR 的反應(yīng)條件為 94°C 4min ;94°C 30s，55°C 30s，72°C 30s， 39 個循環(huán)；72°C lOmin ;4°C保存。
[0032] 以麥蚜的cDNA為模板，用PI作為引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到283bp PCR產(chǎn)物（含40bp 的T7啟動子序列），經(jīng)過測序，該283bp PCR產(chǎn)物具有序列表中的序列1 (可人工合成）所 示的核苷酸。
[0033] 以GFP質(zhì)粒為模板，用P2作為引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到360bp PCR產(chǎn)物（含40bp的T7 啟動子序列），其具有序列表中的序列3 (可人工合成）所示的核苷酸。
[0034] 將上述 PCR 電泳結(jié)果如圖 1 所不，M :100bp marker ;1 :麥蟲牙 Sitobion avenae2 : GFP，可以看出得到目的片段。
[0035] 將上述283bp PCR產(chǎn)物核苷酸序列去掉T7啟動子序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫 (http://blast. ncbi. nlm. nih. gov/)進(jìn)行BLAST比對分析，BLAST結(jié)果表明，與豌豆蟲牙體內(nèi) 次級共生菌基因具有100%同源性，可確定該核苷酸序列為保守序列。
[0036] 表1為共生菌基因28469與GFP的PCR擴(kuò)增引物
[0037]
【權(quán)利要求】
1. dsRNA，為由序列表中序列2所示的核苷酸和其反向互補(bǔ)序列所示的核苷酸組成的 雙鏈RNA。
2. 權(quán)利要求1所述dsRNA的編碼基因或含有該編碼基因的DNA片段。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于：所述dsRNA的編碼基因的核苷酸序 列為序列表中序列1。
4. 權(quán)利要求1所述dsRNA或權(quán)利要求2所述的編碼基因在如下1)-4)中至少一種中的 應(yīng)用： 1) 防治蚜蟲或制備防治蚜蟲產(chǎn)品； 2) 促進(jìn)蚜蟲死亡或制備促進(jìn)蚜蟲死亡產(chǎn)品； 3) 抑制!牙蟲生長中或制備抑制!牙蟲生長廣品； 4) 抑制姆蟲體內(nèi)共生菌Hamiltonella defensa28469基因的表達(dá)或在制備抑制姆蟲 體內(nèi)共生菌Hamiltonella defensa28469基因的表達(dá)產(chǎn)品。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述應(yīng)用為將權(quán)利要求1或2所述 dsRNA導(dǎo)入蚜蟲，實現(xiàn)防治蚜蟲、促進(jìn)蚜蟲死亡、抑制蚜蟲生長和/或抑制蚜蟲體內(nèi)共生菌 Hamiltonella defensa28469 基因的表達(dá)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于： 所述導(dǎo)入為飼喂。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一所述的應(yīng)用，其特征在于： 所述蚜蟲為麥蚜。
8. -種具有功能的產(chǎn)品，其活性成分為權(quán)利要求1所述dsRNA或權(quán)利要求2所述的編 碼基因，所述功能為如下1)_4)中任意一種：1)防治蚜蟲；2)促進(jìn)蚜蟲死亡；3)抑制蚜蟲生 長；4)抑制姐蟲體內(nèi)共生菌Hamiltonella defensa28469基因表達(dá)。
【文檔編號】C12N15/113GK104109671SQ201410328123
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2014年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月10日
【發(fā)明者】夏蘭琴, 孫永偉, 蔡洵 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所