用真核分泌表達系統(tǒng)制備重組谷胱甘肽過氧化物酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明的用真核分泌表達系統(tǒng)制備重組谷胱甘肽過氧化物酶的方法，屬于生物技術(shù)的領(lǐng)域。先將靶基因連同SeCys插入序列組裝到分泌型哺乳類細胞表達載體上，再將SeCys插入序列結(jié)合蛋白2組裝到胞內(nèi)型哺乳類細胞表達載體上，將兩種載體共轉(zhuǎn)染同一哺乳細胞株，在亞硒酸鈉存在下用哺乳細胞合成GPX。本發(fā)明方法簡單，重組GPX活力和產(chǎn)量高、穩(wěn)定性好，避免包涵體復性造成的產(chǎn)率下降和失活，從而解決天然GPX來源有限和性質(zhì)不穩(wěn)定問題。
【專利說明】用真核分泌表達系統(tǒng)制備重組谷胱甘肽過氧化物酶的方法
[0001] 本發(fā)明專利申請是分案申請。原申請的發(fā)明名稱為"基因工程法制備重組谷胱甘 肽過氧化物酶"，申請日為2013年4月24日，申請?zhí)枮?01310142866. 1。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明是一種應(yīng)用基因工程法制備重組谷胱甘肽過氧化物酶的方法，屬于生物技 術(shù)領(lǐng)域，涉及基因重組技術(shù)、基因突變技術(shù)和重組蛋白表達技術(shù)。

【背景技術(shù)】
[0003] 含硒的谷胱甘肽過氧化物酶（GPX)的底物是谷胱甘肽（GSH)，催化基團是硒代半 胱氨酸（SeCys)。在生物體內(nèi)，GPX同超氧化物歧化酶（S0D)、過氧化氫酶（CAT) -起構(gòu)成 了機體抗氧化防御體系。GPX在該體系中發(fā)揮著重要的作用，它以底物GSH為還原劑，分解 體內(nèi)的過氧化氫和各類氫過氧化物，因而能清除體內(nèi)活性氧（R0S)，防止脂質(zhì)過氧化，治療 由活性氧引起的各種疾病，如衰老、紫外線輻射、心腦血管疾病、白內(nèi)障、腫瘤等。與其它抗 氧化酶不同，GPX除了能清除R0S外，還能降解脂質(zhì)過氧化物，防止細胞過氧化損傷，這種獨 特的保護細胞的功能使它在抗氧化酶體系中占有特別重要的位置。然而，由于天然GPX的 來源相當有限、穩(wěn)定性差，致使它的人工產(chǎn)物及其模擬物的研究備受關(guān)注。
[0004] 小分子模擬物主要有PZ51 (ebselen)，AL3823A，BXT系列產(chǎn)品，它們的弱點是活力 低，僅為天然GPX的千分之一左右。大分子的模擬物主要有抗體酶（中國專利94102481. 4 和96112628.0)和以谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST)為蛋白模板制備的GPX模擬酶，其活力顯著 高于小分子模擬物。顯然，以具有谷胱甘肽（GSH)結(jié)合部位的蛋白為模板制備的大分子GPX 模擬酶收到了更好的效果，因此開發(fā)制備這些高活力的GPX模擬酶制備技術(shù)就成了學術(shù)界 的研究熱點，對于分子生物學，生物工程學及醫(yī)學等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。迄今已成 功開發(fā)的方法有：用化學法（中國專利94102481. 4,96112628. 0)或缺陷型原核表達系統(tǒng) (中國專利200810050556.6)在非GPX類模板蛋白中引入GPX的催化基團硒代半胱氨酸 (SeCys)〇
[0005] 中國專利 94102481. 4,96112628. 0,99104234. 4,200810050556. 6 公開的各類含 硒抗體酶的制備方法就是應(yīng)用化學突變（修飾）法在抗體類模板蛋白中引入GPX的催化基 團SeCys，有以下缺點：（1)在制備過程中，僅化學突變（修飾）這一步就會損失20-40%的 酶蛋白，導致模擬酶產(chǎn)率顯著下降；(2)制備模擬酶的周期長，操作繁瑣，時間長；(3)在化 學突變過程中需使用苯甲基磺酰氟、乙腈等，這些物質(zhì)為有毒性的物質(zhì)；(4)缺乏靶向性， 對于大的蛋白分子而言，一次化學反應(yīng)常在不同位點引入多個非特異性催化基團，因此化 學突變引入催化基團無法達到基因突變法那樣的專一性。
[0006] 中國專利200810050556. 6也公開了人源單鏈含硒抗體酶的另一種制備方法是用 缺陷型原核表達系統(tǒng)（大腸桿菌）和基因突變法引入催化基團，但其僅限于人源單鏈含硒 抗體酶的制備，不包括重組谷胱甘肽過氧化物酶（GPX)及其它GPX模擬酶的制備方法。另 有報道：具有GPX活性的谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST)的制備方法。這種方法雖然也采用缺陷 型原核表達系統(tǒng)和基因突變法引入催化基團，但其僅限于以GST為模板蛋白制備GPX模擬 酶，不包括以天然GPX為模板制備重組GPX。用缺陷型原核表達系統(tǒng)在非GPX類模板蛋白中 引入催化基團制備模擬酶的方法是將催化基團引入到與GPX有相同底物GSH結(jié)合部位的它 種蛋白中使其產(chǎn)生GPX活力。然而由于這些模板蛋白不具備天然GPX自身的催化基團，因 此很難找到理想而準確的催化基團的位置；同時由于這些模板蛋白中也沒有象天然GPX那 樣理想的催化三聯(lián)體，因此這類模擬酶的催化效率不高。如果以天然GPX為模板用基因工 程方法來制備重組GPX則可克服這些缺點。
[0007] 由于編碼GPX的催化基團SeCys的密碼子UGA是終止密碼子，在普通原核表達系 統(tǒng)中，需在GPX基因的開放閱讀框內(nèi)、緊鄰SeCys的密碼子UGA下游引入頸環(huán)結(jié)構(gòu)才能將 UGA翻譯成SeCys而不是終止密碼子，而開放閱讀框內(nèi)頸環(huán)的引入必然會引起GPX空間構(gòu)象 的改變，進而影響酶活性。因此普通原核表達系統(tǒng)不適于直接表達具有GPX活性的含硒蛋 白。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種應(yīng)用基因工程法制備谷胱甘肽過氧化物酶（GPX)的 方法。應(yīng)用基因工程技術(shù)、細胞培養(yǎng)技術(shù)、營養(yǎng)缺陷型原核表達技術(shù)和SPP (Single protein production，單一蛋白生產(chǎn)）系統(tǒng)低溫表達技術(shù)制備具有高GPX活力的人工重組GPX。是 用基因工程技術(shù)在哺乳動物細胞株或營養(yǎng)缺陷型原核表達系統(tǒng)及其SPP低溫表達系統(tǒng)中 直接表達具有高酶活性的重組GPX的方法。本方法不需化學修飾即可制備具有較高GPX活 力的人工酶。本發(fā)明方法在生物制藥方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0009] 本發(fā)明的制備重組谷胱甘肽過氧化物酶的方法，先將靶基因組裝到分泌型原核表 達載體上，用基因突變（或氨基酸替換）法，通過營養(yǎng)缺陷型原核表達系統(tǒng)或通過營養(yǎng)缺 陷型原核和SPP低溫聯(lián)合表達系統(tǒng)，將GPX的催化基團硒代半胱氨酸（SeCys)引入到GPX 的底物結(jié)合部位，因而在該蛋白上既有GPX的底物結(jié)合部位，又有催化基團，結(jié)果賦予其高 的GPX的活性，就產(chǎn)生了高活力的重組谷胱甘肽過氧化物酶。或先將靶基因連同硒代半胱 氨酸插入序列組裝到分泌型哺乳類細胞表達載體上，再將硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白 2 (SBP2)組裝到胞內(nèi)型哺乳類細胞表達載體上，將兩種載體共轉(zhuǎn)染同一哺乳細胞株，然后用 篩選得到的同時含有GPX和SBP2兩種基因的陽性細胞株制備各型重組GPX，就在體外產(chǎn)生 了高活力的基因工程重組谷胱甘肽過氧化物酶，從而解決天然GPX來源有限的問題。
[0010] 本發(fā)明的具體制備步驟：
[0011] 本發(fā)明的第一種方法是用營養(yǎng)缺陷型原核表達系統(tǒng)制備重組GPX。
[0012] 1、表達載體的構(gòu)建：
[0013] 在保持氨基酸序列不變的前提下，根據(jù)基因文庫中GPX基因（見NCBI)序列設(shè)計 引物擴增或直接合成其編碼基因，確保GPX基因的5'端含有起始密碼子（ATG)，3'端含 有終止密碼子；用多克隆位點將GPX基因組裝到分泌型原核表達載體上；在保持其它氨基 酸序列不變的前提下，根據(jù)要突變?yōu)榘腚装彼幔–ys)的SeCys的位置和它比鄰的氨基酸的 基因序列設(shè)計完全等長互補的兩條定點突變引物，以突變氨基酸的密碼子為中心，引物長 35-50bp ;用定點突變引物和快速定點突變試劑盒（Invitrogen公司，按試劑盒說明書操 作），將構(gòu)建在原核表達載體上的GPX基因中的SeCys的編碼序列突變成Cys的密碼子（比 如TGC);同樣將GPX基因中的其它Cys突變成絲氨酸（Ser);通過DNA測序確定突變成功， 且無其它意外基因突變發(fā)生；所述的多克隆位點，是載體上固有的由多個核酸限制性內(nèi)切 酶識別的堿基組成的DNA序列；
[0014] 2、陽性轉(zhuǎn)化子的篩選及蛋白的表達與純化：
[0015] 將含有突變的GPX基因的載體轉(zhuǎn)化營養(yǎng)缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys的感受態(tài)細 胞，涂含Cys的營養(yǎng)瓊脂平板，篩選陽性轉(zhuǎn)化子；將陽性轉(zhuǎn)化子擴培養(yǎng)后，在含有SeCys、必 需生長因子和營養(yǎng)素的培養(yǎng)基里，經(jīng)異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG)誘導，營養(yǎng)缺陷型 菌株-BL21 (DE3) Cys能用Cys的密碼子合成SeCys，最后直接表達出在底物GSH的結(jié)合部位 含有SeCys的GPX，酶蛋白以可溶性形式表達并分泌到菌體的周質(zhì)腔里；先小量培養(yǎng)篩選高 表達株，再擴大培養(yǎng)和誘導表達；收集、洗滌、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶蛋白，將液體低 溫離心，去除菌體沉淀、獲得上清液；用谷胱甘肽（GSH)親和層析純化GPX，透析凍干后即得 酶蛋白純品。
[0016] 該方法通過基因突變和營養(yǎng)缺陷型原核表達系統(tǒng)在GPX的底物結(jié)合部位引入了 催化基團，因而產(chǎn)生高活力的重組GPX。
[0017] 所述的用谷胱甘肽（GSH)親和層析純化GPX，是用pH7. 5, 50mmol/L Tris-Cl平衡 并洗脫雜蛋白，用含10mm〇l/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白。
[0018] 所述的將液體低溫離心，可以在4°C，8000-12000g離心15-30min。
[0019] 本發(fā)明的第二種方法是用SPP系統(tǒng)和營養(yǎng)缺陷型原核表達系統(tǒng)聯(lián)合制備重組 GPX。
[0020] 1、表達載體的構(gòu)建：
[0021] 在保持氨基酸序列不變的前提下，根據(jù)基因文庫中GPX的基因序列直接合成其編 碼基因，確保GPX基因的5'端含有起始密碼子（ATG)，3'端含有終止密碼子，GPX基因的 SeCys的編碼序列替換為Cys的密碼子（可以是TGC等），GPX基因中其它所有Cys的密碼 子替換為絲氨酸（Ser)的密碼子，且GPX基因全長不含有ACA序列；用多克隆位點將GPX基 因組裝到分泌型原核表達載體上；所述的多克隆位點，是載體上固有的由多個核酸限制性 內(nèi)切酶識別的喊基組成的DNA序列；
[0022] 2、陽性轉(zhuǎn)化子的篩選及蛋白的表達與純化：
[0023] 將含有合成的GPX基因的載體轉(zhuǎn)化營養(yǎng)缺陷型菌株-BL21 (DE3) Cys的感受 態(tài)細胞，涂含Cys的營養(yǎng)瓊脂平板，篩選陽性菌株；再將含有表達核酸內(nèi)切酶MazF的 pMazF(TAKARA，Cat#3367)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化陽性菌株，用含雙抗性的M9固體培養(yǎng)基篩選陽性轉(zhuǎn)化 子；將陽性轉(zhuǎn)化子擴培養(yǎng)后，在含有SeCys、必需生長因子和營養(yǎng)素的培養(yǎng)基里，經(jīng)IPTG低 溫4-25°C誘導表達，營養(yǎng)缺陷型菌株-BL21 (DE3) Cys能用Cys的密碼子合成SeCys，直接表 達出在底物GSH的結(jié)合部位含有SeCys的重組GPX，酶蛋白以可溶性形式表達并分泌到菌體 的周質(zhì)腔里，而MazF能通過識別并切斷單鏈RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白質(zhì)的表達；先 小量培養(yǎng)篩選高表達株，再擴大培養(yǎng)和誘導表達；收集、洗滌、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶 蛋白，將液體低溫離心，去除菌體沉淀、獲得上清液；用谷胱甘肽（GSH)親和層析純化GPX， 透析凍干后即得酶蛋白純品。
[0024] 該方法通過低溫下誘導營養(yǎng)缺陷型原核表達系統(tǒng)在GPX的底物結(jié)合部位引入了 催化基團，因而產(chǎn)生高活力的重組GPX。
[0025] 所述的用谷胱甘肽（GSH)親和層析純化GPX，是用ρΗ7· 5, 50mmol/L Tris-Cl平衡 并洗脫雜蛋白，用含10mm〇l/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白。
[0026] 所述的將液體低溫離心，可以在4°C，8000-12000g離心15-30min。
[0027] 第三種方法：用哺乳類細胞制備重組谷胱甘肽過氧化物酶（GPX)。
[0028] 1.表達載體的構(gòu)建：
[0029] 在保持氨基酸序列不變的前提下，根據(jù)基因文庫中GPX基因序列設(shè)計引物擴增或 直接合成GPX的編碼基因，確保GPX基因的5'端含有起始密碼子（ATG)和期望的酶切位 點，3'端在終止密碼子下游引入硒代半胱氨酸插入序列（SECIS)和期望的酶切位點；用多 克隆位點將GPX基因連同硒代半胱氨酸插入序列組裝到分泌型哺乳類細胞表達載體上；在 保持氨基酸序列不變的前提下，根據(jù)基因文庫中硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2(SBP2， 見NCBI，NM_024077. 3)C端的512個氨基酸（343-854aa)的基因序列設(shè)計引物擴增或直接 合成其編碼基因，確?；虻?'端含有起始密碼子（ATG)和期望的酶切位點，3'端含有 終止密碼子和期望的酶切位點，用多克隆位點將SBP2基因組裝到胞內(nèi)型哺乳類細胞表達 載體上；所述的多克隆位點，是載體上固有的由多個核酸限制性內(nèi)切酶識別的堿基組成的 DNA序列；
[0030] 2.陽性細胞株的篩選：
[0031] 用含有SBP2和GPX基因的載體在轉(zhuǎn)染試劑的介導下共轉(zhuǎn)染哺乳類細胞，用兩個載 體上的抗性基因通過抗生素濃度從高到低逐級遞減法篩選兼具兩種抗性的陽性細胞克隆， 再用多孔培養(yǎng)板逐級放大培養(yǎng)陽性克隆，最終獲得同時穩(wěn)定表達SBP2和GPX兩種外源蛋白 的陽性細胞株；檢測GPX蛋白的表達量并篩選靶蛋白表達量高的細胞株；
[0032] 3.靶蛋白的表達與純化：
[0033] 在搖瓶中將同時表達兩種外源蛋白的細胞株放大培養(yǎng)，在含有亞硒酸鈉的培養(yǎng)基 里用哺乳類細胞表達重組GPX，酶蛋白以可溶性形式分泌到培養(yǎng)基里，用谷胱甘肽（GSH)親 和層析純化重組GPX，透析凍干后即得酶蛋白純品。
[0034] 所述的檢測GPX蛋白的表達量，可以用每種靶蛋白的抗體和ELISA或GPX活力測 定技術(shù)進行檢測；
[0035] 所述的用谷胱甘肽GSH親和層析純化重組GPX，是用ρΗ7· 5, 50mmol/L Tris-Cl平 衡并洗脫雜蛋白，用含10mm〇l/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白。
[0036] 本發(fā)明的第四種方法是分步用含有SBP2基因的載體和含有GPX基因的載體轉(zhuǎn)染 同一哺乳類細胞。
[0037] 1.表達載體的構(gòu)建：
[0038] 在保持氨基酸序列不變的前提下，根據(jù)基因文庫中GPX的基因序列設(shè)計引物擴增 或直接合成GPX的編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子（ATG)和期望的酶切位點， 3'端在終止密碼子下游引入硒代半胱氨酸插入序列（SECIS)和期望的酶切位點；用多克 隆位點將GPX基因連同硒代半胱氨酸插入序列組裝到分泌型哺乳類細胞表達載體上；在保 持氨基酸序列不變的前提下，根據(jù)基因文庫中SBP2 (見NCBI，NM_024077. 3) C端的512個氨 基酸（343-854aa)的基因序列設(shè)計引物擴增或直接合成其編碼基因，確?；虻?'端含 有起始密碼子（ATG)和期望的酶切位點，3'端含有終止密碼子和期望的酶切位點，用多克 隆位點將SBP2基因組裝到胞內(nèi)型哺乳類細胞表達載體上；所述的多克隆位點，是載體上固 有的由多個核酸限制性內(nèi)切酶識別的堿基組成的DNA序列；
[0039] 2.陽性細胞株的篩選：
[0040] 先用含有SBP2基因的載體轉(zhuǎn)染哺乳類細胞，通過該載體上的抗性基因篩選穩(wěn)定 表達SBP2的細胞株。再用含有GPX基因的載體轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達SBP2的細胞株，用兩個載體 上的抗性基因篩選同時穩(wěn)定表達SBP2和GPX兩種外源蛋白的細胞株；檢測GPX蛋白的表達 量并篩選靶蛋白表達量高的細胞株；
[0041] 3.靶蛋白的表達與純化：
[0042] 在搖瓶中將同時表達兩種外源蛋白的細胞株放大培養(yǎng)，在含有亞硒酸鈉的培養(yǎng)基 里用哺乳類細胞表達重組GPX，酶蛋白以可溶性形式分泌到培養(yǎng)基里；用谷胱甘肽親和層 析純化重組GPX，透析凍干后即得酶蛋白純品。
[0043] 在陽性細胞株的篩選中，所述的陽性細胞株的篩選，也可先轉(zhuǎn)染GPX基因，后轉(zhuǎn)染 SBP2基因，再用兩個載體上的抗性基因篩選同時穩(wěn)定表達SBP2和GPX兩種外源蛋白的細胞 株。所述的檢測GPX蛋白的表達量，可以用每種靶蛋白的抗體和ELISA或GPX活力測定技 術(shù)進行檢測。
[0044] 所述的用谷胱甘肽親和層析純化重組GPX，是用ρΗ7· 5, 50mmol/L Tris-Cl平衡并 洗脫雜蛋白，用含10mm〇l/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白。
[0045] 本發(fā)明具有以下特點：
[0046] ⑴本發(fā)明使用簡單的基因合成或擴增、基因突變和表達等基因工程技術(shù)，制備方 法簡單。
[0047] ⑵本發(fā)明方法制備的重組GPX活力高，已達到天然GPX活力的數(shù)量級水平，細胞生 物學實驗已證實對過氧化氫損傷的心肌細胞有防護作用。
[0048] ⑶本發(fā)明使用的分泌型表達載體，能將GPX以可溶性形式表達并分泌到大腸桿菌 的周質(zhì)腔或哺乳類細胞的體外，引導蛋白分泌表達的前導信號肽由菌體或細胞自動切除， 所表達的蛋白為可溶性，具有天然蛋白的空間構(gòu)象和活性，不需復性，可避免包涵體復性過 程造成的產(chǎn)率下降和失活，因而生產(chǎn)周期短。
[0049] ⑷本發(fā)明使用的SPP低溫表達系統(tǒng)能利用MazF蛋白酶特異性識別并切割含有ACA 序列的mRNA的特性，使菌體只能合成編碼基因中無 ACA序列的蛋白質(zhì)，因此新合成的蛋白 主要是外源重組蛋白，從而提高產(chǎn)率和Cys向SeCys的轉(zhuǎn)化率。
[0050] (5)本發(fā)明使用的營養(yǎng)缺陷型原核表達系統(tǒng)及其與SPP低溫表達系統(tǒng)聯(lián)合制備的 重組GPX具有超強的穩(wěn)定性，不易失活，這一特性明顯優(yōu)于天然GPX。
[0051] (6)本發(fā)明所用的真核表達直接使用GPX自身的硒代半胱氨酸插入序列（SECIS)， 不需另外引入SECIS進入表達載體，因而操作簡單且可用常規(guī)真核表達載體實施。
[0052] 這些優(yōu)點均有利于大規(guī)模生產(chǎn)，為今后的實際應(yīng)用打下了堅實的基礎(chǔ)，解決天然 GPX來源不足和性質(zhì)不穩(wěn)定的問題，在生物制藥方面有廣闊的應(yīng)用前景。

【具體實施方式】：
[0053] 實施例1 :用營養(yǎng)缺陷型原核表達系統(tǒng)制備基因工程人GPX1
[0054] 在保持氨基酸序列不變的前提下，根據(jù)基因文庫中公開的GPX1的基因（參見 NCBI，NM_000581.2)序列設(shè)計引物擴增或直接合成其編碼基因，確?；虻?'端含有起 始密碼子（ATG)和Nde I酶切位點，3'端含有終止密碼子和Hind III酶切位點。用限制 性內(nèi)切酶Nde I和Hind III雙酶切后，連接到同樣酶切的pCold III(TAKARA，Cat.#3369) 載體上。在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據(jù)49號SeCys比鄰的氨基酸的基因序列 設(shè)計完全等長互補的兩條定點突變引物，引物長35-50bp，以49號SeCys的密碼子（TGA)為 中心。用這兩條完全互補的引物和快速定點突變試劑盒（Invitrogen公司，按試劑盒說明 書操作），將構(gòu)建在原核表達載體pCold III上的GPX1基因的第49號SeCys的編碼序列 TGA突變成Cys的密碼子（TGC)，通過DNA測序確定突變成功，且無其它意外基因突變發(fā)生， 用同樣方法將GPX1基因中其它所有Cys的密碼子突變成Ser的密碼子（TCA)。
[0055] 用裝有突變的GPX1基因的載體（pCold III-GPX1)轉(zhuǎn)化營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌 BL21(DE3)Cys，涂含有Cys的營養(yǎng)瓊脂平板，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。將陽性轉(zhuǎn)化子接種于1. 2L M9缺陷表達培養(yǎng)基（在M9培養(yǎng)基中加入100μ g/ml氨芐青霉素、50μ g/ml卡那霉素、 50μ g/ml Cys和除了 Cys之外的19種氨基酸各100μ g/ml)中至0D600為0. 1，培養(yǎng)至 0D600約為0. 3-1，加入終濃度0. 1-lmM的IPTG，lOmin后加入終濃度10μ g/ml的氯霉 素。加入氯霉素五分鐘后培養(yǎng)液離心，低溫6000rpm離心5分鐘，用冰浴的生理鹽溶液洗兩 次，每次用1. 2L，然后用生產(chǎn)培養(yǎng)基（在M9培養(yǎng)基中加入除了 Cys之外的19種氨基酸各 50-400 μ g/ml)重懸，并向培養(yǎng)基中補充終濃度400 μ g的利福平和600 μ M SeCys。繼續(xù)培 養(yǎng)2-12h，使GPX1以可溶性形式表達在菌體的周質(zhì)腔里。收集菌體（6000rpm，10min)并用等 體積的bufferT(50mMTrisbuffer，pH7·5，含lmMEDTA)洗漆兩次。用BufferT重懸菌體 沉淀，加入終濃度ImM的PMSF (苯甲基磺酰氟），超聲破碎菌體，4°C，12000rpm離心30min， 收集上清。按說明書處理GSH親合柱，應(yīng)用緩沖液（50mmol/L Tris，pH7. 5)平衡，將上清 液加入GSH親合柱上，用平衡緩沖液洗脫雜蛋白，用10mm〇l/L GSH洗脫目的蛋白。將洗脫 液透析并凍干，即得人源GPX1。其GPX活力為2865U/ μ mol，達到天然GPX的數(shù)量級水平。
[0056] 營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌BL21 (DE3) Cys來源于題目為"Structure of the Cathelicidin Motif of Protegrin_3Precursor: Structural Insights into the Activation Mechanism of an Antimicrobial Protein，'的文章，2002年發(fā)表在 Structure 第10卷，1363 - 1370頁。該菌種的獲取可以由文章作者或August Bock教授贈予。
[0057] 實施例2 :用SPP系統(tǒng)和營養(yǎng)缺陷型原核表達系統(tǒng)聯(lián)合制備基因工程人GPX1
[0058] 在保持氨基酸序列不變的前提下，根據(jù)基因文庫中公開的GPX1的基因（參見 NCBI，NM_000581. 2)序列直接合成其編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子（ATG)和 Nde I酶切位點，3'端含有終止密碼子和Hind III酶切位點，GPX1基因的第49號SeCys 的編碼序列TGA替換為Cys的密碼子（TGC)，GPX1基因中其它所有Cys的密碼子替換為Ser 的密碼子，且基因全長不含有ACA序列。用限制性內(nèi)切酶Nde I和Hind III雙酶切后，連 接到同樣酶切的pCold III(TAKARA，Cat. #3369)載體上。
[0059] 用裝有GPX1基因的載體（pCold III-GPX1)轉(zhuǎn)化營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌BL21 (DE3) Cys，涂含有Cys的營養(yǎng)瓊脂平板，篩選陽性菌株。再將表達核酸內(nèi)切酶MazF的質(zhì)粒 pMazF(TAKARA，Cat. #3369)轉(zhuǎn)化到該陽性菌株中。將菌液均勻涂布在含100yg/mL Amp、 25 μ g/mL Kana和25 μ g/mL的M9-CAA固體培養(yǎng)基中篩選陽性轉(zhuǎn)化子。將陽性轉(zhuǎn)化子接種 于1. 2L M9缺陷表達培養(yǎng)基（在M9培養(yǎng)基中加入100 μ g/ml氨芐青霉素、50 μ g/ml卡那霉 素、50 μ g/ml Cys和除了 Cys之外的19種氨基酸各100 μ g/ml)中至0D600為0.5。將菌 液置于_20°C冰箱中5min，使菌液迅速冷卻，之后將菌液置于15°C中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)45min。 15°C 5000rpm離心5min，棄上清。0· 9% NaCl重懸菌體沉淀，15°C 5000rpm離心5min，棄上 清，重復該步驟。然后用生產(chǎn)培養(yǎng)基（在M9培養(yǎng)基中加入除了 Cys之外的19種氨基酸各 50-400 μ g/ml)重懸菌體，加入終濃度為lmmol/L IPTG和終濃度為200 μ g/mL SeCys，15°C 振蕩培養(yǎng)16_48h，使GPX1以可溶性形式表達在菌體的周質(zhì)腔里，而MazF能通過識別并切 斷單鏈RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白質(zhì)的表達。收集菌體（6000rpm，10min)并用等體 積的bufferT(50mMTrisbuffer，pH7·5，含lmMEDTA)洗漆兩次。用BufferT重懸菌體沉 淀，加入終濃度ImM的PMSF (苯甲基磺酰氟），超聲破碎菌體，4°C，12000rpm離心30min，收 集上清。按說明書處理GSH親合柱，應(yīng)用緩沖液（50mmol/L Tris，pH7. 5)平衡，將上清液 加入GSH親合柱上，用平衡緩沖液洗脫雜蛋白，用10mm〇l/L GSH洗脫目的蛋白。將洗脫液 透析并凍干，即得人GPX1。其GPX活力為3305U/ μ mol，達到天然GPX的數(shù)量級水平。
[0060] 本實施例使用的SPP低溫表達系統(tǒng)能利用MazF蛋白酶特異性識別并切割含有ACA 序列的mRNA的特性，使菌體只能合成編碼基因中無 ACA序列的蛋白質(zhì)，因此新合成的蛋白 主要是外源重組蛋白，從而提高產(chǎn)率和Cys向SeCys的轉(zhuǎn)化率。
[0061] 實施例3 :用真核表達系統(tǒng)一步轉(zhuǎn)染制備基因工程人GPX4
[0062] 1.人GPX4表達載體的構(gòu)建：用mRNA小量提取試劑盒（Sigma, Cat#MRN-10)從 Η印G-2(DSMZ#ACC180)肝癌細胞中提取 mRNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶（AMV RT，Promega，Cat#M5101)和 oligo(dT)存在下，通過RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)）將其轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA。在保持氨 基酸序列不變的前提下，根據(jù)基因文庫中公開的人GPX4(NCBI，NM_002085. 3)的基因序列 設(shè)計引物擴增GPX4的編碼基因，確?；虻?'端含有起始密碼子（ATG)和EcoRI酶切位 點，3'端引物選在GPX4mRNA的多聚寡核苷酸A前一個堿基后插入Notl酶切位點，確保在 GPX4終止密碼子下游含有硒代半胱氨酸插入序列（從GPX4的終止密碼子到多聚寡核苷酸 A之前的全部堿基序列）。用EcoRI/Notl酶切位點將GPX4基因連同硒代半胱氨酸插入序 列連接到同樣酶切的哺乳類細胞表達載體pSecTag2A(Invitrogen公司）上；同理在保持氨 基酸序列不變的前提下，根據(jù)基因文庫中人硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2(SBP2，NCBI， NM_024077. 3)C端的512個氨基酸（343-854aa)的基因序列設(shè)計引物擴增其編碼基因，確保 基因的5'端含有起始密碼子（ATG)和Xbal酶切位點，3'端含有終止密碼子和EcoRI酶切 位點。用多克隆位點將SBP2的C端（343-854aa)基因組裝到同樣酶切的胞內(nèi)型哺乳類細 胞表達載體 pcDNA3. 1/myc-His A(Invitrogen 公司）上。
[0063] 2.人GPX4陽性細胞株的篩選：當細胞生長到IX 106/ml的密度時，用含有SBP2和 GPX4基因的表達載體在Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen，按說明書使用）介導 下共轉(zhuǎn)染293F細胞（Invitrogen，R79007)，轉(zhuǎn)染后72小時將細胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中開始貼壁培 養(yǎng)，貼壁培養(yǎng)48 (通常2-50)小時后換含有G418和Zeocin的培養(yǎng)液，篩選具有兩種抗性即 同時穩(wěn)定表達SBP2和GPX1兩種外源蛋白的陽性細胞克隆，期間G418和Zeocin濃度分別 從800-200 μ g/ml和400-100 μ g/ml逐步遞減，每次分別減200 μ g/ml和100 μ g/ml，每個 濃度使用5天，2-3天換一次培養(yǎng)液，篩選培養(yǎng)20天后將陽性細胞克隆用96、48、24、12和6 孔培養(yǎng)板逐級放大培養(yǎng)。用抗GPX4抗體和ELISA技術(shù)檢測GPX4蛋白的表達量，挑選靶蛋 白表達量高的細胞株用于擴培養(yǎng)和凍存。
[0064] 3.人GPX4的表達與純化：在大容量含有1-10 μ Μ亞硒酸鈉的293F表達培養(yǎng)基中 擴培養(yǎng)2中篩選獲得的同時穩(wěn)定表達SBP2和GPX4兩種外源蛋白的細胞株。在SBP2、SECIS 和293細胞中其它蛋白因子的共同參與下，GPX4以可溶性形式表達并分泌于培養(yǎng)基中，每 48小時收集一次培養(yǎng)液。培養(yǎng)液經(jīng)lOKDa分子量超濾膜濃縮20倍后，用GSH親和層析柱純 化GPX4,收集含有GPX4的洗脫液，透析除去小分子物質(zhì)，凍干即得人GPX4。其GPX活力為 3050U/ μ mol，達到天然GPX的數(shù)量級水平。
[0065] 實施例4 :用真核表達系統(tǒng)分步轉(zhuǎn)染制備基因工程人GPX4
[0066] 1.人GPX4表達載體的構(gòu)建：用mRNA小量提取試劑盒（Sigma, Cat#MRN-10)從 Η印G-2(DSMZ#ACC180)肝癌細胞中提取 mRNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶（AMV RT，Promega，Cat#M5101)和 oligo(dT)存在下，通過RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)）將其轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA。在保持氨 基酸序列不變的前提下，根據(jù)基因文庫中公開的人GPX4(NCBI，NM_002085. 3)的基因序列 設(shè)計引物擴增GPX4的編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子（ATG)和EcoRI酶切位 點，3'端引物選在GPX4mRNA的多聚寡核苷酸A前一個堿基后插入Notl酶切位點，確保在 GPX4終止密碼子下游含有硒代半胱氨酸插入序列（從GPX4的終止密碼子到多聚寡核苷酸 A之前的全部堿基序列）。用EcoRI/Notl酶切位點將GPX4基因連同硒代半胱氨酸插入序 列連接到同樣酶切的哺乳類細胞表達載體pSecTag2A(Invitrogen公司）上；同理在保持氨 基酸序列不變的前提下，根據(jù)基因文庫中人硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2(SBP2，NCBI， NM_024077. 3)C端的512個氨基酸（343-854aa)的基因序列設(shè)計引物擴增其編碼基因，確保 基因的5'端含有起始密碼子（ATG)和Xbal酶切位點，3'端含有終止密碼子和EcoRI酶切 位點。用多克隆位點將SBP2的C端（343-854aa)基因組裝到同樣酶切的胞內(nèi)型哺乳類細 胞表達載體 pcDNA3. 1/myc-His A(Invitrogen 公司）上。
[0067] 2.人GPX4陽性細胞株的篩選：當細胞生長到lX106/ml的密度時，用含有SBP2基 因的表達載體在Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen，按說明書使用）介導下轉(zhuǎn)染 293F細胞（Invitrogen，R79007)，轉(zhuǎn)染后72小時將細胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中開始貼壁培養(yǎng)，貼壁 培養(yǎng)48 (通常2-50)小時后換含有G418的培養(yǎng)液，篩選具有G418抗性即穩(wěn)定表達SBP2的 陽性細胞克隆，期間G418濃度從800 μ g/ml逐步遞減到200 μ g/ml，每次減200 μ g/ml，每 個濃度使用5天，2-3天換一次培養(yǎng)液，篩選培養(yǎng)20天后將陽性細胞克隆用96、48、24、12 和6孔培養(yǎng)板逐級放大培養(yǎng)。再用含有GPX4基因的表達載體在lipofectamine2000轉(zhuǎn)染 試劑（Invitrogen，按說明書使用）介導下轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達SBP2的293F細胞（Invitrogen， R79007)，轉(zhuǎn)染后72小時將細胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中開始貼壁培養(yǎng)，貼壁培養(yǎng)48 (通常2-50)小時 后換含有G418和Zeocin的培養(yǎng)液篩選具有兩種抗性即同時穩(wěn)定表達SBP2和GPX1兩種外 源蛋白的陽性細胞克隆，期間G418濃度維持在200 μ g/ml，Zeocin濃度從400 μ g/ml逐步 遞減到100 μ g/ml，每次減100 μ g/ml，每個濃度使用5天，2-3天換一次培養(yǎng)液，篩選培養(yǎng) 20天后將具有兩種抗性的陽性細胞克隆用96、48、24、12和6孔培養(yǎng)板逐級放大培養(yǎng)。用 抗GPX4抗體和ELISA技術(shù)檢測GPX4蛋白的表達量，挑選靶蛋白表達量高的細胞株用于擴 培養(yǎng)和凍存。
[0068] 上述方法也可以先轉(zhuǎn)染GPX4基因，后轉(zhuǎn)染SBP2基因。
[0069] 3.人GPX4的表達與純化：在大容量含有1-10 μ Μ亞硒酸鈉的293F表達培養(yǎng)基中 擴培養(yǎng)2中篩選獲得的同時穩(wěn)定表達SBP2和GPX4兩種外源蛋白的細胞株。在SBP2、SECIS 和293F細胞中其它蛋白因子的共同參與下，GPX4以可溶性形式表達并分泌于培養(yǎng)基中，每
【權(quán)利要求】
1. 一種用真核分泌表達系統(tǒng)制備重組谷胱甘肽過氧化物酶的方法，是用哺乳類細胞制 備重組GPX，其特征在于，具體過程是， 1) 表達載體的構(gòu)建： 在保持氨基酸序列不變的前提下，根據(jù)基因文庫中GPX基因序列設(shè)計引物擴增或直 接合成GPX的編碼基因，確保GPX基因的5'端含有起始密碼子和期望的酶切位點，3'端 在終止密碼子下游引入硒代半胱氨酸插入序列和期望的酶切位點；用多克隆位點將GPX 基因連同硒代半胱氨酸插入序列組裝到分泌型哺乳類細胞表達載體上；在保持氨基酸序 列不變的前提下，根據(jù)基因文庫中硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2C端的512個氨基酸 (343-854aa)的基因序列設(shè)計引物擴增或直接合成其編碼基因，確保基因的5'端含有起 始密碼子和期望的酶切位點，3'端含有終止密碼子和期望的酶切位點，用多克隆位點將硒 代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2基因組裝到胞內(nèi)型哺乳類細胞表達載體上；所述的多克隆 位點，是載體上固有的由多個核酸限制性內(nèi)切酶識別的堿基組成的DNA序列； 2) 陽性細胞株的篩選： 用含有硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2和GPX基因的載體在轉(zhuǎn)染試劑的介導下共轉(zhuǎn) 染哺乳類細胞，用兩個載體上的抗性基因通過抗生素濃度從高到低逐級遞減法篩選兼具兩 種抗性的陽性細胞克隆，再用多孔培養(yǎng)板逐級放大培養(yǎng)陽性克隆，最終獲得同時穩(wěn)定表達 硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2和GPX兩種外源蛋白的陽性細胞株；檢測GPX蛋白的表 達量并篩選靶蛋白表達量高的細胞株； 3) 靶蛋白的表達與純化： 在搖瓶中將同時表達兩種外源蛋白的細胞株放大培養(yǎng)，在含有亞硒酸鈉的培養(yǎng)基里用 哺乳類細胞表達重組GPX，酶蛋白以可溶性形式分泌到培養(yǎng)基里，用谷胱甘肽親和層析純化 重組GPX，透析凍干后即得酶蛋白純品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用真核分泌表達系統(tǒng)制備重組谷胱甘肽過氧化物酶的方法， 其特征在于，所述的檢測GPX蛋白的表達量，是用每種靶蛋白的抗體和ELISA或GPX活力測 定技術(shù)進行檢測。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程法制備重組谷胱甘肽過氧化物酶GPX，其特征在于， 所述的用谷胱甘肽親和層析純化重組GPX，是用pH7. 5,50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脫雜蛋 白，用含10mmol/L谷胱甘肽的緩沖液洗脫目的蛋白。
4. 一種用真核分泌表達系統(tǒng)制備重組谷胱甘肽過氧化物酶的方法，是分步用含有硒代 半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2基因的載體和含有GPX基因的載體轉(zhuǎn)染同一哺乳類細胞，具 體過程是， 1)表達載體的構(gòu)建： 在保持氨基酸序列不變的前提下，根據(jù)基因文庫中GPX的基因序列設(shè)計引物擴增或 直接合成GPX的編碼基因，確?；虻?'端含有起始密碼子和期望的酶切位點，3'端在 終止密碼子下游引入硒代半胱氨酸插入序列和期望的酶切位點；用多克隆位點將GPX基 因連同硒代半胱氨酸插入序列組裝到分泌型哺乳類細胞表達載體上；在保持氨基酸序列 不變的前提下，根據(jù)基因文庫中硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2C端的512個氨基酸 (343-854aa)的基因序列設(shè)計引物擴增或直接合成其編碼基因，確保基因的5'端含有起 始密碼子和期望的酶切位點，3'端含有終止密碼子和期望的酶切位點，用多克隆位點將硒 代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2基因組裝到胞內(nèi)型哺乳類細胞表達載體上；所述的多克隆 位點，是載體上固有的由多個核酸限制性內(nèi)切酶識別的堿基組成的DNA序列； 2) 陽性細胞株的篩選： 先用含有硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2基因的載體轉(zhuǎn)染哺乳類細胞，通過該載體 上的抗性基因篩選穩(wěn)定表達硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2的細胞株。再用含有GPX基 因的載體轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2的細胞株，用兩個載體上的抗性 基因篩選同時穩(wěn)定表達硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2和GPX兩種外源蛋白的細胞株； 檢測GPX蛋白的表達量并篩選靶蛋白表達量高的細胞株； 3) 靶蛋白的表達與純化： 在搖瓶中將同時表達兩種外源蛋白的細胞株放大培養(yǎng)，在含有亞硒酸鈉的培養(yǎng)基里用 哺乳類細胞表達重組GPX，酶蛋白以可溶性形式分泌到培養(yǎng)基里；用谷胱甘肽親和層析純 化重組GPX，透析凍干后即得酶蛋白純品。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因工程法制備重組谷胱甘肽過氧化物酶GPX，其特征是，在 陽性細胞株的篩選中，所述的陽性細胞株的篩選，先轉(zhuǎn)染GPX4基因，后轉(zhuǎn)染硒代半胱氨酸 插入序列結(jié)合蛋白2基因，再用兩個載體上的抗性基因篩選同時穩(wěn)定表達蛋白2和GPX兩 種外源蛋白的細胞株；所述的檢測GPX蛋白的表達量，是用每種靶蛋白的抗體和ELISA或 GPX活力測定技術(shù)進行檢測。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因工程法制備重組谷胱甘肽過氧化物酶GPX，其特征是，所 述的用谷胱甘肽親和層析純化重組GPX，是用pH7. 5,50mm〇l/LTris-Cl平衡并洗脫雜蛋白， 用含10mm〇l/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白。
【文檔編號】C12N9/08GK104059894SQ201410331142
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2013年4月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月24日
【發(fā)明者】宋健, 魏景艷, 邢瑞慶 申請人:吉林大學