一種檢測活體酵母細胞upr水平的雙熒光素酶監(jiān)測質粒及其構建和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測活體酵母細胞UPR水平的雙熒光素酶監(jiān)測質粒及其構建和應用，質粒為pUST-08質粒，利用基因克隆技術，依次將Gal10p、Rluc-Hac1p、Hac1i、Fluc克隆到質粒YCplac33中，組成Gal10p-Rluc-Hac1p-Fluc-Hac1i?UPR檢測雙熒光素酶報告元件。該系統(tǒng)可用于檢測活體酵母細胞UPR水平。本發(fā)明檢測周期短、靈敏度高、實驗操作簡便、成本低。
【專利說明】—種檢測活體酵母細胞UPR水平的雙熒光素酶監(jiān)測質粒及其構建和應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于用于細胞UPR檢測質粒及其構建和應用領域，特別涉及一種檢測活體酵母細胞UPR水平的雙熒光素酶監(jiān)測質粒及其構建和應用。

【背景技術】
[0002]當大量未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質網(wǎng)上過度積累時，在真核生物酵母乃至高等哺乳動物細胞中都廣泛存在一種內(nèi)質網(wǎng)脅迫應激機制，其中最顯著的就是未折疊蛋白響應(UPR)，UPR通過激發(fā)IREl在內(nèi)的多種調節(jié)因子，并利用IREl的核酸內(nèi)切酶活性識別并剪切HAC13’末端的內(nèi)含子序列，使Hacli喪失對HACl翻譯抑制作用提高HACl的表達水平，進而提高下游蛋白折疊相關的分子伴侶的表達，以此降低未折疊蛋白在內(nèi)質網(wǎng)上的過度積累應對內(nèi)質網(wǎng)脅迫。
[0003]內(nèi)質網(wǎng)脅迫及未折疊蛋白響應與重組蛋白的異源表達產(chǎn)率密切相關(appliedmicrob1logy and b1technology46, 365,1996)，也與人類的神經(jīng)性病變、心血管疾病、糖尿病等多種疾病有直接的對應關系(Science Translat1nal Medicine5,138, 2013 ；Nature Reviews Drug Discoveryl2, 703, 2013),針對UPR進行的檢測和研究是探索相關工業(yè)和醫(yī)療蛋白質生產(chǎn)、疾病發(fā)病機制的重要技術手段(Methods Enzymol.490,31,2011),同時也是相關疾病治療及診斷的重要突破口(Science Translat1nal Medicine5,138,2013)。
[0004]利用信使HACl選擇性剪接對UPR的響應機制(celll07，103，2001)，將HACl啟動子及內(nèi)含子移植到表達質粒中研究UPR產(chǎn)生后IREl對質粒HACl的調控機制。證實了 HACl在表達質粒中同樣具有靈敏的UPR響應調控機制。
[0005]現(xiàn)有檢測UPR水平的方法主要有(I) RT-PCR或northern-blot檢測HACl表達水平及HACl內(nèi)含子剪接率；(2)利用未折疊蛋白響應元件UPRE來檢測UPR水平；(3)利用免疫共沉淀(IP)分析UPR相關蛋白的表達量來檢測UPR水平；(4)通過生化指標，如Ca2+含量等，來檢測細胞UPR水平。但都存在無法克服的缺點，如:
[0006]1.RT-PCR或Northern-blot實驗周期長、靈敏度低；
[0007]2.檢測UPRE或IP時難以避免蛋白折置受抑制后對標記蛋白折置的干擾；
[0008]3.現(xiàn)有的Ca2+等離子測定精度不高，且實驗成本高、實驗周期長；
[0009]4.需要借助內(nèi)參進行定量，無法對活體細胞進行高通量檢測；


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種檢測活體酵母細胞UPR水平的雙熒光素酶監(jiān)測質粒及其構建和應用，該發(fā)明檢測周期短、靈敏度高、實驗操作簡便、成本低。
[0011]本發(fā)明的一種檢測活體酵母細胞UPR水平的雙熒光素酶監(jiān)測質粒，所述質粒為pUST-08質粒；具體為GallOp-Rluc-Haclp-Fluc-Hacli UPR雙熒光素酶報告元件，其核酸序列如SEQ ID NO: 13所示。
[0012]本發(fā)明的一種監(jiān)測活體酵母細胞UPR水平的雙熒光素酶監(jiān)測質粒的構建，包括:
[0013](I)設計用于GallOp、Rluc-Haclp、Hacl1、Fluc片段PCR擴增的上下游引物；
[0014](2)利用PCR技術，以含Gal 1p序列的質粒YEP51-1 ipinl、含Rluc和Fluc序列的質粒PJD375和含Hacli序列的酵母基因組作為擴增模板，擴增GallOp、Rluc-Haclp、Hacl1、Fluc序列；
[0015](3)利用基因克隆技術，依次將GallOp、Rluc-Haclp、Hacl1、Fluc克隆到質粒YCplac33中，組成Gal1p-Rluc-Haclp-Fluc-HacIi UPR雙熒光素酶報告元件，即為pUST-08 質粒。
[0016]所述步驟(1)中GallOp、Rluc-Haclp、Hacl1、Fluc片段PCR擴增的上下游引物為:
[0017]GallOp - F:ACGCCAAGCTTGATCAAAAATCATCGCTTCG ;如 SEQ ID NO:1 所示
[0018]GallOp - R:GCTCTAGACTCGACTCAAAAATTCTTAC ;如 SEQ ID NO:2 所示
[0019]Rluc - Haclp - F:GCTCTAGAGTCCACCAATGACTTCGAAA ;如 SEQ ID NO:3 所示
[0020]Rluc - Haclp - R:CGGGATCCTAGGTGGGGGAGGAGGAGGTTCGACATTTGTTCATTTTTGAG ；如SEQ ID NO:4 所示
[0021]Hacl1-F:GGGGTAC CTATAGCGGGAAACAGTCTAC ;如 SEQ ID NO:5 所示
[0022]Hacl1-R:CCACCAACAGCGATAATAAC ;如 SEQ ID NO:6 所示
[0023]Fluc - F:TCAAAAATGAACAAATGTCG ;如 SEQ ID NO:7 所示
[0024]Fluc - R:GGGGTACCATGACTCGAGCACGTGTTAC? 如 SEQ ID NO:8 所示
[0025]所述PUST-08是一種能夠在大腸桿菌及釀酒酵母中穩(wěn)定復制表達的低拷貝穿梭型重組質粒。所述pUST-08能夠通過其雙熒光素酶報告元件中的HACl內(nèi)含子序列響應UPR，調控其上游的Fluc報告基因的表達。
[0026]所述pUST-08能夠通過其雙熒光素酶報告元件中的GallO啟動子，控制雙熒光素酶報告元件的轉錄的開啟與關閉，提高UPR監(jiān)測的操作性。
[0027]所述雙熒光素酶報告元件中的Rluc可作為UPR檢測時螢火蟲熒光素酶報告基因Fluc的內(nèi)對照，消除單一報告基因在UPR檢測過程中，因內(nèi)質網(wǎng)脅迫后的蛋白折疊效率改變，對單一熒光素酶活性造成的干擾。
[0028]本發(fā)明的一種檢測活體酵母細胞UPR水平的雙熒光素酶監(jiān)測質粒的應用，包括:
[0029](I)將pUST-08轉入釀酒酵母BY4741a中，于SC-URA培養(yǎng)基中篩選；
[0030](2)將上述攜帶有pUST-08的酵母BY4741a進行復蘇，次日進行活化，離心，洗滌，配制酵母菌懸液；
[0031](3)取上述酵母菌懸液，并分成兩等份，分別轉移到培養(yǎng)板中，靜置誘導，然后向一份中加入D-突光素鉀檸檬酸鈉溶液,另一份加入腔腸素溶液，避光晃動20-30s,然后在Imin內(nèi)檢測熒光素酶熒光值。
[0032]所述步驟⑵中活化為0.60D_的初始菌濃活化4hr。
[0033]所述步驟⑵中洗滌為用無菌水懸洗。
[0034]所述步驟⑵配制酵母菌懸液為:用2%葡萄糖為碳源的SC_URA、2%半乳糖作為碳源的SC-URA或2%半乳糖作為碳源并添加藥物的SC-URA懸起來，即得。
[0035]所述藥物衣霉素Tm和/或二硫蘇糖醇DTT ;優(yōu)選濃度為0.5mg/ml或2mg/ml的衣霉素(Tm)，0.1mM或0.5mM的二硫蘇糖醇(DTT)。
[0036]所述步驟(3)中靜置誘導為30°C靜置誘導3hr。
[0037]所述步驟(3)中D-熒光素鉀檸檬酸鈉溶液的濃度為ImM，腔腸素溶液的濃度為20 μ M ；D-熒光素鉀檸檬酸鈉溶液或腔腸素溶液于酵母菌懸液的體積比為1:1。
[0038]本發(fā)明設計并構建一種能夠檢測活體細胞內(nèi)UPR的質粒及利用該質粒檢測不同UPR激活劑處理后活體細胞中的UPR水平。更具體的說，將HACl啟動子5’UTR序列Haclp、HACl內(nèi)含子Hacli及其3’UTR序列完整移植到低拷貝穿梭質粒YCplac33中，借助HACl在UPR激活后的特殊剪接機制，利用該質粒搭載的雙熒光素酶報告基因，監(jiān)測活體細胞內(nèi)UPR的情況。
[0039]內(nèi)質網(wǎng)脅迫及未折疊蛋白響應與重組蛋白的異源表達產(chǎn)率，以及人類的神經(jīng)性病變、心血管疾病、糖尿病等多種疾病密切相關，以HACl剪切為基礎的UPR檢測技術是研究蛋白藥物生產(chǎn)、相關疾病的發(fā)病機制及藥物篩選的重要技術手段。但現(xiàn)有檢測技術存在操作繁瑣、靈敏度低等缺陷，難以滿足相關疾病研究及藥物篩選的高靈敏度、高通量的要求。依照本發(fā)明構建的UPR監(jiān)測質粒能夠方便、快捷、高通量的監(jiān)測活體細胞的UPR情況。
[0040]有益.效果
[0041](I)檢測周期短:利用pUST-08質粒對酵母UPR水平進行檢測周期短，僅需要3h的誘導、處理時間及Imin的檢測時間即可完成對酵母UPR水平的檢測，而傳統(tǒng)RT-PCR檢測方法，則需要3h的藥物處理、5h的總RNA提取、2h的cDNA合成、3h的PCR檢測、30min的凝膠電泳檢測。本檢測系統(tǒng)可以大大縮短檢測周期；
[0042](2)靈敏度高:傳統(tǒng)RT-PCR法檢測HACl剪切率，僅能檢測高濃度UPR誘導劑的UPR水平，對于低濃度UPR誘導劑的UPR水平則難以檢測。而本檢測系統(tǒng)，在檢測低濃度的UPR誘導劑，如0.5 μ g/mL的衣霉素(Tm)、0.1mM的二硫蘇糖醇(DTT)，依然可以檢測出UPR水平；
[0043](3)實驗操作簡便、成本低:常規(guī)RT-PCR操作繁瑣、成本高昂，RT-PCR檢測主要包括總RNA的提取，cDNA的合成，PCR檢測，凝膠電泳檢測等內(nèi)容，總RNA提取及cDNA的合成需要使用價格較為昂貴的試劑盒。而本檢測系統(tǒng)，僅需要將待測樣品放置在30°C恒溫箱中靜置3h，加入熒光底物，直接可以通過多功能熒光酶標儀進行檢測，相比較傳統(tǒng)RT-PCR檢測法，本法操作更為簡便、成本更低；
[0044](4)不需要額外設置內(nèi)參:對比與UPRE-LacZ通過檢測淀粉酶活性的辦法，往往需要額外設置內(nèi)參，且使用檢測精確度不高。而UPR檢測質粒中GallOp啟動子和Rluc海腎熒光素酶基因的加入，為本檢測系統(tǒng)提供了檢測所需的本底和內(nèi)參。檢測過程中，將不進行半乳糖誘導的熒光值作為本底，將RLU作為內(nèi)參，可以方便的通過減去本底，對比RLU熒光強度計算出實際的FLU表達水平；
[0045] (5)本檢測系統(tǒng)具有傳統(tǒng)RT-PCR、Northern-blot、UPRE_Lacz不具備的優(yōu)勢，如周期短、靈敏度高、操作簡便、不需要額外設置內(nèi)參等特點，此外本檢測系統(tǒng)還可以利用多功能酶標儀進行聞通量檢測，本檢測系統(tǒng)在細胞內(nèi)質網(wǎng)脅迫、UPR應激等相關疾病及基礎研究中具有良好的應用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0046]圖1為UPR檢測質粒pUST-08的工作原理圖；
[0047]圖2為UPR檢測質粒pUST-08的構建示意圖；
[0048]圖3為常規(guī)RT-PCR技術檢測野生型酵母在0.5 μ g/mL的衣霉素、2 μ g/mL的衣霉素、0.1mM DTT,0.5mM DTT 處理后 HAClmRNA 的剪接率，圖中 HAClu 為 unspliced HACl,即代表未發(fā)生剪接的HACl ;圖中HACls為spliced HACl，即代表剪接后的HACl ；ACT1為內(nèi)參；
圖4為hac I Λ、ire I Λ衣霉素、DTT敏感度測試，SC+Tm為SC培養(yǎng)基中額外添加0.5 μ g/mL的衣霉素，SC+DTT為SC培養(yǎng)基中額外添加0.5mM DTT ；
[0049]圖5為通過多功能熒光酶標儀檢測到pUST-08質粒在野生型與HACl缺陷型酵母中誘導表達后產(chǎn)生的相對Fluc/Rluc熒光強度比值；
[0050]圖6為通過多功能熒光酶標儀檢測到pUST-09質粒在野生型酵母中誘導表達后產(chǎn)生的相對Fluc/Rluc熒光強度比值；
[0051]圖7為通過多功能熒光酶標儀檢測到pUST-08質粒在IREl缺陷型酵母中誘導表達后產(chǎn)生的相對Fluc/Rluc熒光強度比值。

【具體實施方式】
[0052]下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
[0053]實施例1
[0054]UPR檢測質粒pUST-08的構建
[0055]利用常規(guī)基因克隆技術依次將可操縱啟動子GallOp、熒光素酶報告基因Rluc、HACl啟動子5’ UTR序列Haclp、HACl內(nèi)含子Hacli及其3’ UTR序列、熒光素酶報告基因Fluc克隆到酵母低拷貝穿梭型質粒YCplac33中(如圖2所示)。
[0056]1、設計引物
[0057]GallOp - F:ACGCCAAGCTTGATCAAAAATCATCGCTTCG ；
[0058]GallOp - R:GCTCTAGACTCGACTCAAAAATTCTTAC ；
[0059]Rluc - Haclp - F:GCTCTAGAGTCCACCAATGACTTCGAAA ；
[0060]Rluc - Haclp - R:CGGGATCCTAGGTGGGGGAGGAGGAGGTTCGACATTTGTTCATTTTTGAG ；
[0061]Hacl1- F:GGGGTACCTATAGCGGGAAACAGTCTAC ；
[0062]Hacl1-R:CCACCAACAGCGATAATAAC ；
[0063]Fluc - F:TCAAAAATGAACAAATGTCG ；
[0064]Fluc - R:GGGGTACCATGACTCGAGCACGTGTTAC。
[0065]2、以質粒 YEP51-LIPIN1 為模板、GallOp - F 和 GallOp - R 作為擴增引物(GallOp - F:ACGCCAAGCTTGATCAAAAATCATCGCTTCG ；GallOp - R:GCTCTAGACTCGACTCAAAAATTCTTAC ；)，使用常規(guī)PCR體系反應程序進行PCR擴增，PCR擴增條件為:95°C預熱3min ；35個循環(huán)，每個循環(huán)包括:94°C變性20秒，55°C退火30s，72°C延伸
2.5min ;最后72°C延伸lOmin。獲得GallOp的PCR產(chǎn)物，再將PCR產(chǎn)物進行純化回收。
[0066]3、將純化后的Gal 1p的PCR產(chǎn)物及YCplac33進行Hindi 11,XbaI雙酶切，酶切產(chǎn)物進一步進行純化回收。
[0067]4、將純化后的酶切產(chǎn)物GallOp及YCplac33經(jīng)T4連接酶的作用下進行連接，轉入大腸桿菌DH5 α后，經(jīng)含氨芐青霉素篩LB平板篩選后獲得正確質粒，所獲質粒為YCplac33-Gall0p。
[0068]5、以質粒PJD375為模板、Rluc - Haclp - F和Rluc - Haclp _ R作為擴增引物(Rluc - Haclp - F:GCTCTAGAGTCCACCAATGACTTCGAAA ；Rluc - Haclp - R:CGGGATCCTAGGTGGGGGAGGAGGAGGTTCGACATTTGTTCATTTTTGAG)，使用常規(guī)PCR體系反應程序進行PCR擴增，PCR擴增條件為:95°C預熱3min ;35個循環(huán)，每個循環(huán)包括:94°C變性20秒，55°C退火30s，72°C延伸Imin ;最后72°C延伸lOmin，獲得Rluc-Haclp的PCR產(chǎn)物，再將PCR產(chǎn)物進行純化回收。
[0069]6、將純化后的 Rluc-Haclp 的 PCR 產(chǎn)物及 YCplac33_Gall0p 進行 Xba1、BamHI 雙酶切，酶切產(chǎn)物進一步進行純化回收。
[0070]7、將純化后的酶切產(chǎn)物Rluc-Haclp及YCplac33_經(jīng)T4連接酶的作用下進行連接，轉入大腸桿菌DH5 α后，經(jīng)含氨芐青霉素篩LB平板篩選后獲得正確質粒，所獲質粒為YCplac33_Gal1p-Rluc-HacIp。
[0071]8、以質粒PJD375為模板、Hacl1- F和Hacli _ R作為擴增引物(Hacl1- F:GGGGTACCTATAGCGGGAAACAGTCTAC ；Hacli _ R:CCACCAACAGCGATAATAAC ；)，使用常規(guī) PCR 體系反應程序進行PCR擴增，PCR擴增條件為:95°C預熱3min ;35個循環(huán)，每個循環(huán)包括:94°C變性20秒，55°C退火30s，72。。延伸30s ;最后72°C延伸lOmin，獲得Hacli的PCR產(chǎn)物，再將PCR產(chǎn)物進行純化回收。
[0072]9、將純化后的 Hacli 的 PCR 產(chǎn)物及 YCplac33-Gall0p-Rluc_Haclp 進行 ΚρηΙ、EcoRI雙酶切，酶切產(chǎn)物進一步進行純化回收。
[0073]10、將純化后的酶切產(chǎn)物Hacli及YCplac33-Gall0p-Rluc_Haclp經(jīng)T4連接酶的作用下進行連接，轉入大腸桿菌DH5 α后，經(jīng)含氨芐青霉素篩LB平板篩選后獲得正確質粒，所獲質粒為 YCplac33-Gal 1p-Rluc-HacIp-HacIi。
[0074]11、以質粒PJD375為模板、Fluc - F和Fluc _ R作為擴增引物(Flue - F:TCAAAAATGAACAAATGTCG ；Fluc - R:GGGGTACCATGACTCGAGCACGTGTTAC)，使用常規(guī) PCR 體系反應程序進行PCR擴增，PCR擴增條件為:95°C預熱3min ;35個循環(huán)，每個循環(huán)包括:94°C變性20秒，55°C退火30s, 72°C延伸lmin30s ;最后72°C延伸1min,獲得Fluc的PCR產(chǎn)物，再將PCR產(chǎn)物進行純化回收。
[0075]12、將純化后的 Fluc 的 PCR 產(chǎn)物及 YCplac33-Gall0p-Rluc_Haclp-Hacli 進行BamH1.Kpnl雙酶切，酶切產(chǎn)物進一步進行純化回收。
[0076]13、將純化后的酶切產(chǎn)物 Hacli 及 YCplac33-Gall0p-Rluc_Haclp-Hacli 經(jīng) T4 連接酶的作用下進行連接，轉入大腸桿菌DH5 α后，經(jīng)含氨芐青霉素篩LB平板篩選后獲得正確質粒，所獲質粒 YCp Iac33-Gal 1p-Rluc-Hac lp-Fluc-Hac I i，并命名為 pUST-08。
[0077]14、對所構建的pUST-08質粒送測序公司進行測序，測序結果與釀酒酵母基因文庫(SOT)中的HACl序列、YEP51-LIPIN1質粒、PJD375質粒序列分別進行比對，證明所構建的質粒序列完全正確。
[0078]實施例2
[0079]利用UPR常規(guī)檢測技術RT-PCR來檢測HAClmRNA的選擇性剪接規(guī)律
[0080]利用常規(guī)RT-PCR技術檢測野生型酵母在0.5 μ g/mL的衣霉素、2 μ g/mL的衣霉素、
0.1mM DTT,0.5mM DTT 處理后 HAClmRNA 的剪接率
[0081]1、優(yōu)選地使用引物
[0082]ACT1-F:GCTTTGTTCCATCCTTCTG，如 SEQ ID NO: 9 所示；
[0083]ACT 1-R: GAAACACTTGTGGTGAACGjn SEQ ID NO: 10 所示；
[0084]HAC1-F:AGGAAAAGGAACAGCGAAGGjn SEQ ID NO: 11 所示；
[0085]HAC1-R:GAATTCAAACCTGACTGCGC，如 SEQ ID NO: 12 所示。
[0086]2、按照常規(guī)RT-PCR技術檢測HACl剪接率其步驟為:(I)將野生型酵母BY4741a克隆，挑入3mL SC-URA液體培養(yǎng)基中作為種子菌，30°C，180rpm，過夜培養(yǎng)；(2)次日，將上述種子菌分別轉接到新鮮6mL SC-URA液體培養(yǎng)基，保證初始菌濃在0.40D_左右，30°C，180rpm，額外添加0.5 μ g/mL的衣霉素、2 μ g/mL的衣霉素、0.1mM DTT,0.5mM DTT進行處理3h，同時以不添加任何藥物的組作為對照組，同樣步驟處理3h ； (3)按照takara公司的酵母總RNA提取試劑盒(yeast RNAiso kit, code:D300)的步驟提取野生型酵母總RNA ; (4)按照 takara 公司的 cDNA 合成試劑盒(PrimeScript?IIlst Strand cDNA Synthesis Kit,6210A)操作方法合成cDNA ； (5)按照常規(guī)PCR技術對HACl進行PCR檢測，通過凝膠電泳及凝膠成像儀進行光密度分析，并根據(jù)分析結果計算不同藥物處理后酵母HACl的剪接率。
[0087]3、結果，采集各處理組的樣品(n = 2)進行HACl剪接率分析，不進行藥物處理的對照組HACl剪接率7.5 %，0.5 μ g/mL衣霉素處理的酵母HACl剪接率為8.9 %，2 μ g/mL衣霉素處理的酵母HACl剪接率為24.9%，0.1mM的DTT處理的酵母HACl剪接率為9.1%，
0.5mM的DTT處理的酵母HACl剪接率為11.5%。對各組的酵母HACl剪接率進行顯著性方差分析，設定α為0.05，發(fā)現(xiàn)僅2 μ g/mL衣霉素處理后的酵母HACl剪接率與對照組的HACl剪接率有顯著性差異(如附圖3所示)。
[0088]實施例3
[0089]had Δ、irel Δ為UPR超敏感菌株的證實
[0090]IREl介導的HAClmRNA剪切激活是UPR的重要途徑之一，合成的HACl能夠通過激活下游UPR相關基因的表達提聞內(nèi)質網(wǎng)蛋白折置能力，以緩解內(nèi)質網(wǎng)脅迫。HACl或IREl的缺陷將導致細胞應對環(huán)境脅迫下的IRE1/HAC1為的內(nèi)質網(wǎng)脅迫解救機制失效，加劇細胞內(nèi)的未折疊蛋白在內(nèi)質網(wǎng)上的積累。為了證實該論點，對HACl和IREl缺失突變體進行UPR誘導藥物的敏感性試驗。
[0091]1、將待測菌株(BY4741a，hacl Λ、irel Λ)挑入3mL SC液體培養(yǎng)基中作為種子菌，30°C，180rpm，過夜培養(yǎng)。
[0092] 2、取約I X 17的酵母細胞(0D_~I)，10倍比進行梯度稀釋后(稀釋5個梯度)，每個濃度梯度取5ul稀釋后的菌液，滴在含有待測藥物(0.5 μ g/mL的衣霉素、0.5mM DTT)的SC固體培養(yǎng)基中，以不含的待測藥物的SC固體培養(yǎng)基作為對照，30°C培養(yǎng)2~5d后觀察。
[0093]3、通過藥物敏感性試驗，可以發(fā)現(xiàn)HACl和IREl的缺陷菌株表現(xiàn)出對UPR誘導藥物高度敏感(如圖4所示)，證實了 haclA、irelA為UPR超敏感菌株。
[0094]實施例4
[0095]pUST-08質粒檢測UPR可靠性、靈敏度的證實為了驗證所構建的pUST_08UPR檢測質粒的可靠性，將所構建的pUST-08質粒分別轉入野生型和HACl缺陷型酵母中，檢測衣霉素、DTT等藥物處理后UPR水平。利用藥物、濃度及菌株間的藥物敏感度不同所產(chǎn)生的UPR水平差異，來檢測本檢測系統(tǒng)的可靠性，并對比實施例2的RT-PCR結果，進一步論證本檢測系統(tǒng)的靈敏度。
[0096]1、利用常規(guī)酵母電轉化方法，將構建好的pUST-08分別轉入野生型和HACl缺陷型釀酒酵母BY4741a中，經(jīng)SC-URA平板篩選后獲得陽性克隆。
[0097]2、將上述攜帶有pUST-08質粒的BY4741a陽性克隆，挑入3mL SC-URA液體培養(yǎng)基中作為種子菌，300C，180rpm,過夜培養(yǎng)。
[0098]3、次日，將上述種子菌分別轉接到新鮮6mL SC-URA液體培養(yǎng)基，保證初始菌濃在0.60D_左右，30°C，180rpm，培養(yǎng)約4hr后菌濃達到1.40D6(I(I，從中各取ImL分成1、2、3、4、5、6共6組轉移到1.5mL EP管中，6000g/min，3min收集。收集后各組菌沉淀用ImL的無菌水懸洗一次，以同樣轉速離心收集后，組I用ImL等體積的2%葡萄糖為碳源的SC-URA懸起來、組2用等體積的2%半乳糖作為碳源的SC-URA懸起來、組3~6分別等體積的2%半乳糖作為碳源并額外添加不同藥物(0.5 μ g/mL的衣霉素、2 μ g/mL的衣霉素、0.1mM DTT>0.5mM DTT)的 SC-URA 中懸起來。
[0099]4、各組設立2~4個平行各200 μ L，每個平行等分成兩份各100 μ L轉移到黑色96孔培養(yǎng)板中，封蓋后30°C恒溫靜置3hr。
[0100]5、避光條件下，向其中一份中加入100 μ L的熒光蟲熒光底物ImM D-1uciferin檸檬酸溶液(ImM D-luciferin0.1M檸檬酸鈉，PH = 5.0溶劑)，向另一份加入100 μ L的腔腸素溶液(ImM腔腸素0.1M檸檬酸鈉，PH = 5.0溶劑)，立即避光輕輕晃動30s，使底物與熒光素酶充分混勻。
[0101]6、立即在Imin內(nèi)根據(jù)常規(guī)多功能酶標儀檢測規(guī)程各樣品的熒光值，檢測模式為luminescence模式,檢測類型為endpoint,積分時間Is,其他均為系統(tǒng)默認值。
7、實驗過程中以同樣攜帶pUST-08的hacl缺陷菌株作為對照，按本實施例步驟中的2~6步的方法對攜帶有pUST-08質粒的hacl缺陷菌株進行相同的操作及檢測。
[0102]8、在野生型酵母進行的檢測中，對比0.5 μ g/mL的衣霉素、2 μ g/mL的衣霉素、
0.1mM DTT,0.5mM DTT處理后的Fluc/Rluc比值，發(fā)現(xiàn)野生型酵母經(jīng)不同濃度不同藥物處理后，F(xiàn)luc/Rluc比值與不進行處理的對照有顯著差異，且其比值與藥物種類、處理濃度相對應(如附圖5所示);通過與實施例2的結果進行對比，發(fā)現(xiàn)本檢測系統(tǒng)且能檢測出常規(guī)RT-PCR技術難以檢測的低濃度的衣霉素和DTT所引起的UPR，證實該檢測系統(tǒng)較常規(guī)UPR檢測技術靈敏度更高；在1^(31突變菌株的檢測中，進行相同藥物及濃度的處理后，所檢測到的UPR水平較野生型要高。但對于2 μ g/mL的衣霉素處理后UPR水平，兩者無明顯差異(如附圖5所示)?；谏鲜鼋Y果，可以證實pUST-08質粒檢測UPR可靠性高、靈敏度高。
[0103]實施例5
[0104]pUST-08質粒中的Haclintron剪接調節(jié)機制的證實
[0105]為了驗證pUST-08質粒中的Haclintron剪接調節(jié)機制與內(nèi)源Haclintron調節(jié)機制的一致性，分別針對Haclintron轉錄后調控及IREl介導的Haclintron剪接進行了驗證。
[0106]1、在構建好的pUST-08基礎上，在Fluc-Hacli序列中插入甘油CYCl終止序列CYClt,即 Fluc-CYClt-Hacli，將該質粒命名為 pUST-09 (PUST-09 型 Gal 10p-Rluc-Haclp-Fluc-CYCIt-HacIi UPR檢測雙熒光素酶報告元件，其核酸序列如SEQ ID NO: 14所示)。通過在Fluc下游引入CYCl終止序列，阻礙質粒中Hacli的轉錄,使質粒中的Hacli喪失翻譯調控功能，以此驗證pUST-08質粒中Haclintron對Fluc的調控作用。
[0107]2、按照實施例1的方法，在pUST-08中的Fluc-Hacli序列中插入甘油CYCl終止序列CYClt，將純化后的pUST-08及PJD375進行BamH1、KpnI雙酶切，酶切后進行凝膠電泳，將pUST-08酶切所得的約8.0kbp的pUST-08載體及PJD375酶切后所得的約1.9kbp的Fluc-CYClt片段進行割膠回收并純化。
[0108]3、將純化后的酶切產(chǎn)物pUST-08載體及Fluc-CYClt經(jīng)T4連接酶的作用下進行連接，轉入大腸桿菌DH5 α后，經(jīng)含氨芐青霉素篩LB平板篩選，后經(jīng)菌落PCR驗證獲得正確質粒，所獲質粒即為pUST-09。
[0109]4、按照實施例4的方法，將質粒pUST-09轉入野生型釀酒酵母中，經(jīng)SC-URA平板篩選后獲得陽性克隆。
[0110]5、按照實施例4的方法，利用pUST-09質粒檢測衣霉素、DTT處理后野生型酵母的UPR水平。結果發(fā)現(xiàn)攜帶pUST-09的野生型酵母在不同濃度不同藥物處理后，F(xiàn)luc/Rluc比值與不進行處理的對照同樣沒有顯著差異(如附圖6所示)，pUST-08中Haclintron的正常轉錄是保證pUST-08具有UPR檢測功能的重要前提。
[0111]6、按照實施例4的方法，將質粒pUST-08轉入IREl缺陷型酵母中，經(jīng)SC-URA平板篩選后獲得陽性克隆。
[0112]7、按照實施例4 的方法，利用pUST-08質粒檢測衣霉素、DTT處理后IREl缺陷型酵母的UPR水平。結果發(fā)現(xiàn)攜帶pUST-08的IREl缺陷型酵母在不同濃度不同藥物處理后，F(xiàn)luc/Rluc比值與不進行處理的對照同樣沒有顯著差異(如附圖7所示)，pUST-08中Haclintron剪接機制與內(nèi)源Haclintron —樣，是依賴于IREl的剪接調節(jié)機制。
[0113]8、基于本實例中第5條和第7條的結果，證實了 pUST-08質粒中的Haclintron剪接調節(jié)機制與內(nèi)源Haclintron調節(jié)機制是一致的。
【權利要求】
1.一種檢測活體酵母細胞UPR水平的雙熒光素酶監(jiān)測質粒，其特征在于:所述質粒為pUST-08質粒；具體為GallOp-Rluc-Haclp-Fluc-Hacli UPR檢測雙熒光素酶報告元件，其核酸序列如SEQ ID NO: 13所示。
2.一種如權利要求1所述的檢測活體酵母細胞UPR水平的雙熒光素酶監(jiān)測質粒的構建，包括: (1)設計用于GallOp、Rluc-Haclp、Hacl1、Fluc片段PCR擴增的上下游引物； (2)利用PCR技術，以含Gal1p序列的質粒YEP51-1 ipinl、含Rluc和Fluc序列的質粒PJD375和含HACi序列的酵母基因組作為擴增模板，擴增GallOp、Rluc-Haclp、Hacl1、Fluc序列； (3)利用基因克隆技術，依次將GallOp、Rluc-Haclp、Hacl1、Fluc克隆到質粒YCplac33中，組成GallOp-Rluc-Haclp-Fluc-Hacli UPR雙熒光素酶報告元件，即為pUST_08質粒。
3.根據(jù)權利要求2所述的一種檢測活體酵母細胞UPR水平的雙熒光素酶監(jiān)測質粒的構建，其特征在于:所述步驟(1)中GallOp、Rluc-Haclp、Hacl1、Fluc片段PCR擴增的上下游引物為:
GallOp - F:ACGCCAAGCTTGATCAAAAATCATCGCTTCG ；
GallOp - R:GCTCTAGACTCGACTCAAAAATTCTTAC ；
Rluc - Haclp - F :GCTCTAGAGTCCACCAATGACTTCGAAA ；
Rluc - Haclp _ R:CGGGATCCTAGGTGGGGGAGGAGGAGGTTCGACATTTGTTCATTTTTGAG ；
Hacl1- F:GGGGTACCTATAGCGGGAAACAGTCTAC ；
Hacl1-R:CCACCAACAGCGATAATAAC ；
Fluc - F:TCAAAAATGAACAAATGTCG ；
Fluc - R:GGGGTACCATGACTCGAGCACGTGTTAC。
4.一種如權利要求1所述的檢測活體酵母細胞UPR水平的雙熒光素酶監(jiān)測質粒的應用，包括: (1)將pUST-08轉入釀酒酵母BY4741a中，于SC-URA培養(yǎng)基中篩選； (2)將上述攜帶有pUST-08的酵母BY4741a進行復蘇，次日進行活化，離心，洗滌，配制酵母菌懸液； (3)取上述酵母菌懸液，并分成兩等份，分別轉移到培養(yǎng)板中，靜置誘導，然后向一份中加入D-熒光素鉀檸檬酸鈉溶液,另一份加入腔腸素溶液,避光晃動20-30s,然后在Imin內(nèi)檢測熒光素酶熒光值。
5.根據(jù)權利要求4所述的一種檢測活體酵母細胞UPR水平的雙熒光素酶監(jiān)測質粒的應用，其特征在于:所述步驟(2)中活化為0.60D_的初始菌濃活化4hr。
6.根據(jù)權利要求4所述的一種檢測活體酵母細胞UPR水平的雙熒光素酶監(jiān)測質粒的應用，其特征在于:所述步驟(2)中洗滌為用無菌水懸洗。
7.根據(jù)權利要求4所述的一種檢測活體酵母細胞UPR水平的雙熒光素酶監(jiān)測質粒的應用，其特征在于:所述步驟(2)配制酵母菌懸液為:用2%葡萄糖為碳源的SC-URA、2%半乳糖作為碳源的SC-URA或2%半乳糖作為碳源并添加藥物的SC-URA懸起來，即得。
8.根據(jù)權利要求7所述的一種檢測活體酵母細胞UPR水平的雙熒光素酶監(jiān)測質粒的應用，其特征在于:所述藥物為衣霉素Tm和/或二硫蘇糖醇DTT。
9.根據(jù)權利要求4所述的一種檢測活體酵母細胞UPR水平的雙熒光素酶監(jiān)測質粒的應用，其特征在于:所述步驟(3)中靜置誘導為30°C靜置誘導3hr。
10.根據(jù)權利要求4所述的一種檢測活體酵母細胞UPR水平的雙熒光素酶監(jiān)測質粒的應用，其特征在于:所述步驟(3)中D-熒光素鉀檸檬酸鈉溶液的濃度為ImM，腔腸素溶液的濃度為20 μ M ；D-熒光 素鉀檸檬酸鈉溶液或腔腸素溶液于酵母菌懸液的體積比為1:1。
【文檔編號】C12Q1/68GK104164443SQ201410333939
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年7月14日 優(yōu)先權日:2014年7月14日
【發(fā)明者】黃志偉, 房志家, 匡鑫, 杜秀秀, 劉偉偉, 肖君華 申請人:東華大學