一種區(qū)位選擇性細(xì)菌硝基還原酶基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種突變型細(xì)菌硝基還原酶基因及其應(yīng)用，屬于酶工程領(lǐng)域?；诘鞍踪|(zhì)三維結(jié)構(gòu)及分子對接，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌硝基還原酶NfsB中第124位苯丙氨酸通過與多硝基底物的側(cè)鏈基團相互作用，從而影響底物在活性口袋中的定位。突變體F124W、N71S/F124W、F123A/F124W和N71S/F123A/F124W可催化癌癥治療前藥CB1954專一性生成具有高生物毒性的4-NHOH產(chǎn)物。同時這些突變體較野生型酶相比催化活性提高了7-24倍，以N71S/F123A/F124W表現(xiàn)最為顯著。本發(fā)明所提供的具有專一還原選擇性的硝基還原酶突變體在癌癥及其他疾病治療方面具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種區(qū)位選擇性細(xì)菌硝基還原酶基因及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于酶工程領(lǐng)域，具體涉及一種突變型硝基還原酶的基因，以及含有該基 因的重組酶，及其在硝基區(qū)位選擇性還原中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 硝基還原酶是一類依賴于FMN或FAD的細(xì)胞質(zhì)酶，可利用NAD (Ρ) Η催化硝基基團 還原，經(jīng)亞硝基中間產(chǎn)物最終生成羥氨或氨基產(chǎn)物。硝基基團作為生物醫(yī)藥、抗菌劑和殺蟲 劑中常見的官能基團，它的還原是實現(xiàn)藥物生物治療和體內(nèi)降解代謝的關(guān)鍵步驟，在此過 程中硝基還原酶起到了關(guān)鍵性的作用。其中大腸桿菌硝基還原酶NfsB與癌癥前藥5-(1-氮 丙啶）-2,4_二硝基苯甲酰胺（CB1954)組成的激活治療系統(tǒng)目前已進入臨床III期實驗階 段。NfsB可在體內(nèi)將CB1954轉(zhuǎn)化成為強細(xì)胞毒性的DNA交聯(lián)劑，能夠同時殺死增殖期和休 眠期的癌細(xì)胞。最近完成的I/II期實驗表明，若在癌癥病人體內(nèi)利用復(fù)制缺陷型載體表達 NfsB，隨后注射前藥CB1954可顯著緩解病情。然而體內(nèi)催化效果較差成為抑制其廣泛應(yīng)用 的主要因素，而造成這一結(jié)果的原因之一則是NfsB對CB1954硝基的還原缺乏區(qū)位選擇性。
[0003] 以往研究發(fā)現(xiàn)，CB1954的兩種羥氨產(chǎn)物（2-NH0H和4-NH0H)對癌細(xì)胞的生物毒性 不同，其中4-NH0H產(chǎn)物具有更顯著的生物毒性。而大腸桿菌硝基還原酶Nf sB在催化CB1954 時，等比例生成2-NH0H產(chǎn)物和4-NH0H產(chǎn)物，在一定程度上影響了 NfsB對CB1954的體內(nèi)激 活活性。若能通過對酶分子的改造，使其選擇性生成4-NH0H產(chǎn)物，可能將有利于該系統(tǒng)體 內(nèi)活性的提
[0004] 因此，尋找開發(fā)高效的具有專一還原選擇性的硝基還原酶在癌癥及其他疾病的治 療方面具有顯著的商業(yè)價值和應(yīng)用前景。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為獲得專一區(qū)位選擇性的硝基還原酶，本發(fā)明通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及分子對接模擬分 析，發(fā)現(xiàn)124的氨基酸殘基通過與底物側(cè)鏈基團的相互作用從而影響底物在活性中心的定 位。若將124位的苯丙氨酸（Phe)突變?yōu)樯彼幔═rp)(簡寫為F124W)，可顯著改變酶的區(qū) 域選擇性。與野生型硝基還原酶相比，突變體NfsB-F124W可還原癌癥治療前藥CB1954生成 單一的較高生物毒性的4-NH0H產(chǎn)物。同時對其他可能影響酶催化活性的氨基酸進行了組 合突變，將71位的天冬酰胺（Asn)突變?yōu)榻z氨酸（Ser)(簡寫為N71S)，將123位的苯丙氨 酸（Phe)突變?yōu)楸彼幔ˋla)(簡寫為F123A)，獲得相應(yīng)的組合突變體分別為NfsB-N71S/ F124W、NfsB-F123A/F124W和NfsB-N71S/F123A/F124W，這些突變體在保持專一區(qū)位選擇性 的基礎(chǔ)上均進一步提高了對CB1954的催化活性，其中NfsB-N71S/F123A/F124W表現(xiàn)最為顯 著，還原活性較野生型提高了 24倍。目前硝基還原酶的生理底物和催化機制尚不明確，尤 其是針對于外源的硝基芳香化合物而言，無法確定該底物在酶活性口袋內(nèi)的正確定位，從 而很難確定與側(cè)鏈基團相互作用的關(guān)鍵氨基酸及該氨基酸是如何影響底物在活性口袋內(nèi) 的定位。此外，底物在酶活性口袋內(nèi)定位通常受到多個氨基酸的共同作用，很難確定其中哪 個或哪幾個氨基酸發(fā)揮主要的作用。同時對這些位點的突變具有很高的風(fēng)險性和不確定 性，雖然在一定程度上實現(xiàn)了區(qū)位選擇性的改變，但可能引起酶催化活性的降低甚至喪失。 針對以上問題，本發(fā)明采用分子對接模擬的手段考察了候選氨基酸位點可能的作用，并在 此基礎(chǔ)上進行單點突變，進一步將有益突變位點進行組合突變，考察其對選擇性實現(xiàn)及活 性提高的協(xié)同作用。
[0006] 本發(fā)明具體涉及四種突變型硝基還原酶的基因，以及含有該基因的重組表達載體 和重組表達轉(zhuǎn)化體，其重組酶和該重組酶的制備方法，以及該突變型硝基還原酶或含有該 突變型基因重組表達轉(zhuǎn)化體作為催化劑在藥物激活及代謝、芳香羥氨生物合成和硝基污染 物生物降解等領(lǐng)域中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的一方面在于提供一類區(qū)位選擇性細(xì)菌硝基還原酶基因，分別命名為硝基 還原酶單突變體NfsB-F124W,以及三種組合突變體NfsB-N71S/F124W、NfsB-F123A/F124W 和 NfsB-N71S/F123A/F124W,其核苷酸序列分別如 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:4 所示。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供上述區(qū)位選擇性細(xì)菌硝基還原酶基因所編碼的蛋白質(zhì)， 具有SEQIDN0:5、SEQIDN0:6、SEQIDN0:7、SEQIDN0:8所示的氨基酸序列。
[0009] 本發(fā)明的另一目的是提供含有上述區(qū)位選擇性細(xì)菌硝基還原酶基因之一的重組 表達載體，或其重組表達轉(zhuǎn)化體。以及編碼上述區(qū)位選擇性細(xì)菌硝基還原酶DNA的基因工 程菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
[0010] 本發(fā)明的另一目的是提供一種區(qū)位選擇性細(xì)菌硝基還原酶的制備方法，其步驟包 括：培養(yǎng)上述含有該區(qū)位選擇性細(xì)菌硝基還原酶基因之一的重組表達轉(zhuǎn)化體，分別從培養(yǎng) 物中純化得到相應(yīng)的突變型區(qū)位選擇性細(xì)菌硝基還原酶基因。
[0011] 上文所述的制備方法，其更具體的技術(shù)方案如下：根據(jù)大腸桿菌（Escherichia coli)硝基還原酶NfsB基因 NCBI編碼：NC_000913,設(shè)計定點突變的突變引物，以攜帶硝基 還原酶基因的克隆載體為模板進行定點突變構(gòu)建突變體；以pET-28a(+)或能表達該酶的 載體為表達載體，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)細(xì)胞或能表達該酶的宿主細(xì)胞， 挑選驗證后的陽性單克隆進行發(fā)酵培養(yǎng)。經(jīng)融合表達純化得到突變型硝基還原酶蛋白。
[0012] 本發(fā)明的另一目的是提供上述技術(shù)方案中所述的各個區(qū)位選擇性細(xì)菌硝基還原 酶基因編碼的蛋白或重組表達轉(zhuǎn)化體，或者其各自作為催化劑在催化硝基還原，在藥物激 活劑代謝、芳香羥胺化合物的生物合成以及硝基類環(huán)境污染物生物代謝等領(lǐng)域的應(yīng)用。其 中，組合突變體NfsB-N71S/F123A/F124W可還原癌癥治療前藥CB1954生成單一的較高生 物毒性的4-NH0H產(chǎn)物，其還原活性較野生型提高了 24倍。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1.HPLC分析NfsB野生型及突變體蛋白對癌癥治療前藥CB1954還原的區(qū)域 選擇性。由圖中所示內(nèi)容可知，單突變體NfsB-F124W和組合突變體NfsB-N71S/F124W、 NfsB-F123A/F124W 和 NfsB-N71S/F123A/F124W 均專一性還原 CB1954 的 4 位硝基，生成高生 物毒性的4NH0H產(chǎn)物。此外，在相同反應(yīng)條件、反應(yīng)時間內(nèi)突變體可實現(xiàn)CB1954的完全轉(zhuǎn) 化，而野生型催化的反應(yīng)混合物中仍有底物CB1954剩余。這些突變體在具有4位硝基專一 選擇性之外，對CB1954的催化活性較野生型也均有顯著的提高。因此，突變體NfsB-F124W、 NfsB-N71S/F124W、NfsB-F123A/F124W 和 NfsB-N71S/F123A/F124W 可替代野生型蛋白應(yīng)用 于CB1954前藥激活系統(tǒng)中，有利于提高該系統(tǒng)在體內(nèi)對CB1954的催化活性。

【具體實施方式】
[0014] 下述非限定性實施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以 任何方式限制本發(fā)明。
[0015] 本發(fā)明中設(shè)計使用的重疊延伸PCR引物序列：
[0016] nfsB-WT-F ：5, ~GGAATTCCATATGGATATCATTTCTGTCGCCTTAAAG~3, ；SEQ ID NO:9 ；
[0017] nfsB-WT-R ：5, ~GGAATTCTTACACTTCGGTTAAGGTGATGTT~3, ；SEQ ID NO:10 ；
[0018] nfsB-N71S-F ：5, -ATGTGTTCAGCGAACGTAAAATGCTTGATG-3, ；SEQ ID NO:11 ；
[0019] nfsB-N71S-R :5' -ATTTTACGTTCGCTGAACACATAATTACCGGCAG-3' SEQ ID N0:12 ;
[0020] nfsB-F124W-F :5' -TCGCAAGTTCTGGGCTGATATGCACCGTAAAGATC-3' ；SEQ ID N0:13 ;
[0021] nfsB-F124W-R :5' -TATCAGCCCAGAACTTGCGACCTTTATCGTTCG-3' ；SEQ ID N0:14 ;
[0022] nfsB-F123A/F124W-F :5' -TCGCAAGGCCTGGGCTGATATGCACCGTAAAGATC-3' ；SEQ ID NO:15 ；
[0023] nfsB-F123A/F124W-R :5' -TATCAGCCCAGGCCTTGCGACCTTTATCGTTCG-3' ；SEQ ID NO:16 ；
[0024] 實施例 1 突變型硝基還原酶 F124W、N71S/F124W、F123A/F124W 和 N71S/F123A/ F124W的基因獲取及表達載體構(gòu)建
[0025] 1.野生型nfsB基因的克隆與克隆載體構(gòu)建
[0026] 根據(jù)NCBI提供的E. coli K12菌株（Invitrogen)中nfsB基因序列，設(shè)計引物 (nfsB-WT-F ：5, ~GGAATTCCATATGGATATCATTTCTGTCGCCTTAAAG~3,, nfsB-ffT-R ：5, -GGAATT ￡TTACACTTCGGTTAAGGTGATGTT-3'），其中下劃線部分表示酶切位點對應(yīng)的基因序列。利用 提取的E. coli K12基因組DNA為模版，進行PCR擴增。取10μ1 PCR反應(yīng)產(chǎn)物跑瓊脂糖 凝膠電泳驗證，電泳條帶約650bp與nfsB基因大小一致。使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 3.0切膠回收上述電泳目的條帶，然后用EcoR I/Nde I雙酶切處理 回收產(chǎn)物，使用 TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver. 3.0 將其純化，之后使用 DNA Ligation Kit Ver. 3.0中的連接酶，將純化后得到的目的產(chǎn)物與經(jīng)EcoR I/Nde I雙酶切處 理的pET28a(+)空載體連接后，熱激轉(zhuǎn)化至E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，涂布平板，37°C過 夜培養(yǎng)。挑選陽性菌落過夜37°C培養(yǎng)后提取質(zhì)粒并送TaKaRa測序確認(rèn)與nfsB基因 （Gene ID:945778)序列一致，驗證基因克隆成功，并將其命名為野生型nfsB基因，并將其對應(yīng)的 陽性菌落和重組質(zhì)粒分別命名為克隆菌E. coli DH5 a -nfsB-WT和質(zhì)粒pET28a-nfsB-WT。
[0027] 2.突變型NfsB_F124W的基因獲取及表達載體構(gòu)建
[0028] 過夜培養(yǎng)E. coli DH5a-nfsB-WT克隆菌，提取pET28a-nfsB_WT重組質(zhì)粒，以此為 模板構(gòu)建突變體載體pET28a-nfsB-F124W。
[0029] 首先以質(zhì)粒 pET28a-nfsB-WT 為模板，使用引物 nfsB-WT-F 和 nfsB-F124W-R :5'-T ATCAGCCCAGAACTTGCGACCTTTATCGTTCG-3'進行一次 PCR 反應(yīng)，命名為 nfsB_F124W_l。同 樣以質(zhì)粒 pET28a-nfsB-WT 為模板，使用引物 nfsB-WT-R 和 nfsB-F124W-F :5' -TCGCAAGT TCTGGGCTGATATGCACCGTAAAGATC-3' 進行二次 PCR 反應(yīng)，命名為 nfsB_F124W_2。其中引物 nfsB-F124W-F和nfsB-F124W-R中下劃線標(biāo)記的為124位氨基酸突變位點對應(yīng)的基因序列。 使用 TaKaRa MiniBest Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 3.0,對于兩次 PCR 產(chǎn)物切 膠回收純化。以回收產(chǎn)物nfsB-F124W-l和nfsB-F124W-2作為模板，使用引物nfsB-WT-F 和 nfsB-WT-R 進行第三次重疊延伸 PCR，PCR 產(chǎn)物使用 TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver. 3.0回收純化，獲得突變體基因，其命名為nfsB-F124W基因，其序列信息為SEQ ID N0:1。
[0030] 將獲得的突變體基因 SEQ ID NO: 1和pET28a(+)空載使用Nde I /EcoR I分別進 行雙酶切，使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 3.0切膠回收上述電泳目 的條帶，之后使用DNA Ligation Kit Ver. 3.0中的連接酶，將純化后得到的目的產(chǎn)物與經(jīng) EcoR I/Nde I雙酶切處理的pET28a(+)載體連接后，熱激轉(zhuǎn)化至E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞 中，涂布平板，37°C過夜培養(yǎng)。挑選陽性菌落過夜37°C培養(yǎng)后提取質(zhì)粒并送TaKaRa測序確 認(rèn)與SEQ ID NO: 1序列一致，驗證表達載體構(gòu)建成功，并將其對應(yīng)的陽性菌落和重組質(zhì)粒命 名為克隆菌 E. coli DH5a -nfsB-F124W 和質(zhì)粒 pET28a-nfsB-F124W。
[0031] 3.突變型NfsB-N71S/F124W的基因獲取及表達載體構(gòu)建
[0032] 過夜培養(yǎng) E. coli DH5 a -nfsB_F124W 克隆菌，提取 pET28a-nfsB_F124W 重組質(zhì)粒， 以此為模板構(gòu)建突變體載體pET28a-nfsB-N71S/F124W。
[0033] 首先以質(zhì)粒 pET28a-nfsB-F124W 為模板，使用引物 nfsB-WT-F 和 nfsB-N71S-R : 5' -ATTTTACGTTCGCTGAACACATAATTACCGGCAG-3' 進行一次 PCR 反應(yīng)，命名為 nfsB_N71S/ F124W-1。同樣以質(zhì)粒 pET28a-nfsB-F124W 為模板，使用引物 nfsB-WT-R和 nfsB-N71S-F :5' -ATGTGTTCAGCGAACGTAAAATGCTTGATG-3 '進行二次 PCR 反應(yīng)，命名為 nf sB_N71S/F124W_2。其 中引物nfsB-N71S-F和nfsB-N71S-R中下劃線標(biāo)記的為71位氨基酸突變位點對應(yīng)的基因 序列。使用 TaKaRa MiniBest Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 3.0,對于兩次PCR產(chǎn) 物切膠回收純化。以回收產(chǎn)物nf sB-N71S/F124W-1和nf sB-N71S/F124W-2作為模板，使用引 物nfsB-WT-F和nfsB-WT-R進行第三次重疊延伸PCR，PCR產(chǎn)物使用TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver. 3. 0回收純化，獲得突變體基因，其命名為nfsB-N71S/F124W基因，其 序列信息為SEQ ID N0:2。
[0034] 將獲得的突變體基因 SEQ ID NO: 2和pET28a(+)空載使用Nde I /EcoR I分別進 行雙酶切，使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 3.0切膠回收上述電泳目 的條帶，之后使用DNA Ligation Kit Ver. 3.0中的連接酶，將純化后得到的目的產(chǎn)物與經(jīng) EcoR I/Nde I雙酶切處理的pET28a(+)載體連接后，熱激轉(zhuǎn)化至E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞 中，涂布平板，37°C過夜培養(yǎng)。挑選陽性菌落過夜37°C培養(yǎng)后提取質(zhì)粒并送TaKaRa測序確 認(rèn)與SEQ ID N0:2序列一致，驗證表達載體構(gòu)建成功，并將其對應(yīng)的陽性菌落和重組質(zhì)粒命 名為克隆菌 E. coli DH5 a -nfsB-N71S/F124W 和質(zhì)粒 pET28a-nfsB-N71S/F124W。
[0035] 4.突變型NfsB-F123A/F124W的基因獲取及表達載體構(gòu)建
[0036] 過夜培養(yǎng) E. coli DH5 a -nfsB_F124W 克隆菌，提取 pET28a-nfsB_F124W 重組質(zhì)粒， 以此為模板構(gòu)建突變體載體pET28a-nfsB-F123A/F124W。
[0037] 首先以質(zhì)粒 pET28a-nfsB-F124W 為模板，使用引物 nfsB-WT-F 和 nfsB-F123A/ F124W-R ：5, -TATCAGCCCAGGCCTTGCGACCTTTATCGTTCG-3' 進行一次 PCR 反應(yīng)，命名為 nfsB-F123A/F124W-l。同樣以質(zhì)粒 pET28a-nfsB-F124W 為模板，使用引物 nfsB-WT-R 和 nfsB-F123A/F124ff-F ：5, -TCGCAAGGCCTGGGCTGATATGCACCGTAAAGATC-3' 進行二次 PCR 反 應(yīng)，命名為 nfsB-F123A/F124W-2。其中引物 nfsB-F123A/F124W-F 和 nfsB-F123A/F124W-R 中下劃線標(biāo)記的為123和124位氨基酸突變位點對應(yīng)的基因序列。使用TaKaRa MiniBest Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 3.0,對于兩次PCR產(chǎn)物切膠回收純化。以回收產(chǎn)物 nfsB-F123A/F124W-l 和 nfsB-F123A/F124W-2 作為模板，使用引物 nfsB-WT-F 和 nfsB-WT-R 進行第三次重疊延伸 PCR，PCR 產(chǎn)物使用 TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver. 3.0 回收純化，獲得突變體基因，其命名為nfsB-F123A/F124W基因，其序列信息為SEQ ID N0:3。
[0038] 將獲得的突變體基因 SEQ ID N0:3和pET28a(+)空載使用Nde I /EcoR I分別 進行雙酶切，使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 3.0切膠回收上述電泳 目的條帶，之后使用DNA Ligation Kit Ver. 3. 0中的連接酶，將純化后得到的目的產(chǎn)物與 經(jīng)EcoR I/Nde I雙酶切處理的pET28a(+)載體連接后，熱激轉(zhuǎn)化至E. coli DH5a感受態(tài) 細(xì)胞中，涂布平板，37°C過夜培養(yǎng)。挑選陽性菌落過夜37°C培養(yǎng)后提取質(zhì)粒并送TaKaRa測 序確認(rèn)與SEQ ID N0:3序列一致，驗證表達載體構(gòu)建成功，并將其對應(yīng)的陽性菌落和重組質(zhì) 粒命名為克隆菌 E. coli DH5 a -nfsB-F123A/F124W 和質(zhì)粒 pET28a-nfsB-F123A/F124W。
[0039] 5.突變型NfsB-N71S/F123A/F124W的基因獲取及表達載體構(gòu)建
[0040] 過夜培養(yǎng) E. coli DH5 a -nfsB-F123A/F124W 克隆菌，提取 pET28a-nfsB-F123A/ F124W重組質(zhì)粒，以此為模板構(gòu)建突變體載體pET28a-nfsB-N71S/F123A/F124W。
[0041] 首先以質(zhì)粒pET28a-nfsB-F123A/F124W為模板，使用引物nfsB-WT-F和 nfsB-N71S-R ：5, ~ATTTTACGTTCGCTGAACACATAATTACCGGCAG~3,進行一次 PCR 反應(yīng)，命名 為 nfsB-N71S/F123A/F124W-l。同樣以質(zhì)粒 pET28a-nfsB-F123A/F124W 為模板，使用引物 nfsB-WT-R 和 nfsB-N71S-F :5' -ATGTGTTCAGCGAACGTAAAATGCTTGATG-3' 講行二次 PCR 反應(yīng)， 命名為 nfsB-N71S/F123A/F124W-2。其中引物 nfsB-N71S-F 和 nfsB-N71S-R 中下劃線標(biāo) 記的為71位氨基酸突變位點對應(yīng)的基因序列。使用TaKaRa MiniBest Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 3. 0,對于兩次PCR產(chǎn)物切膠回收純化。以回收產(chǎn)物nfsB-N71S/F123A/ F124W-1 和 nfsB-N71S/F123A/F124W-2 作為模板，使用引物 nfsB-WT-F 和 nfsB-WT-R 進行第 三次重疊延伸 PCR，PCR產(chǎn)物使用 TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver. 3.0 回收純 化，獲得突變體基因，其命名為nfsB-N71S/F123A/F124W基因，其序列信息為SEQ ID N0:4。
[0042] 將獲得的突變體基因 SEQ ID NO:4和pET28a(+)空載使用Nde I /EcoR I分別進 行雙酶切，使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 3.0切膠回收上述電泳目 的條帶，之后使用DNA Ligation Kit Ver. 3.0中的連接酶，將純化后得到的目的產(chǎn)物與經(jīng) EcoR I/Nde I雙酶切處理的pET28a(+)載體連接后，熱激轉(zhuǎn)化至E. coli DH5a感受態(tài)細(xì) 胞中，涂布平板，37°C過夜培養(yǎng)。挑選陽性菌落過夜37°C培養(yǎng)后提取質(zhì)粒并送TaKaRa測序 確認(rèn)與SEQ ID N0:4序列一致，驗證表達載體構(gòu)建成功，并將其對應(yīng)的陽性菌落和重組質(zhì)粒 命名為克隆菌 E. coli DH5 a -nfsB-N71S/F123A/F124W 和質(zhì)粒 pET28a-nfsB-N71S/F123A/ F124W。
[0043] 實施例2.細(xì)菌硝基還原酶突變體的表達純化
[0044] 1.硝基還原酶突變體的誘導(dǎo)表達
[0045] 將重組質(zhì)粒 pET28a-nfsB-F 124W、pET28a-nfsB-N71S/F124W、pET28a-nfsB-F 123A/ F124W 和 pET28a-nfsB-N71S/F123A/F124W 分別熱激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 E. coli BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞（Invitrogen)中，涂布平板，37°C過夜培養(yǎng)。挑取陽性克隆，分別命名為表 達菌 E.coli BL21(DE3)-nfsB-F124W、E.coli BL21(DE3)-nfsB-N71S/F124W、E.coli BL21 (DE3)-nfsB-F123A/F124W和 E. coli BL21 (DE3)-nfsB-N71S/F123A/F124W，再分別接種 于LB液體培養(yǎng)基中（含50 μ g/ml Kana)，37°C振蕩過夜。將種子培養(yǎng)液以1 %接種量轉(zhuǎn)接 至100ml LB擴大培養(yǎng)基中（含50 μ g/ml Kana)，37°C搖床培養(yǎng)至0D6QQ在0· 4-0. 6。加入 終濃度為〇. 5mM IPTG于30°C下誘導(dǎo)表達6h。培養(yǎng)結(jié)束后，發(fā)酵液于5000r/min離心lOmin 收集菌體。
[0046] 2.硝基還原酶突變體的純化
[0047] 收集菌體用20mM磷酸鹽緩沖液（pH7. 4,含有500mM NaCl)進行重懸，利用高壓勻 楽破碎儀在低溫下進行破碎，12000r/min離心5min收集上清。
[0048] 樣品分離純化均使用AKTA purifier蛋白質(zhì)快速層析系統(tǒng)（GE Healthcare)完成， 采用 GE Healthcare FF HisTrap 層析柱（即 Ni 柱）。首先用緩沖液 A(20mM NaH2P04,0. 5M NaCl，pH7.4)平衡Ni柱，將破碎后收集的蛋白上清樣品以lml/min的流速通過Ni柱，使目 的蛋白結(jié)合于Ni柱。待紫外基線平穩(wěn)后，使用緩沖液B(elution buffer:20mM NaH2P04， 0. 5M NaCl，250mM咪唑，pH7. 4)洗脫，洗脫梯度依次為20mM，100mM，250mM咪唑，每個洗脫梯 度洗脫體積為20個柱體積。分管收集每個梯度洗脫的流出液，對每管樣品分別進行蛋白質(zhì) 含量、活力以及SDS-PAGE分析。
[0049] 3.硝基還原酶突變體的SDS-PAGE電泳分析及Western-Blotting驗證
[0050] 利用SDS-PAGE電泳分析突變型硝基還原酶的分子量及其純度，對照Marker選用 低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白。待電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色3小時以上，用脫色液（以乙 醇：醋酸：水的體積比為1 :2 :17配制而成）震蕩脫色，觀察電泳結(jié)果。
[0051] 電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)在分子量27kDa左右有一條明顯的誘導(dǎo)條帶。同時誘導(dǎo)條帶對應(yīng)蛋 白在250mM咪唑洗脫組分得到富集，初步判斷該蛋白為突變體蛋白。突變體NfsB-F124W、 NfsB-N71S/F124W、NfsB-F123A/F124W 和 NfsB-N71S/F123A/F124W 序列信息依次為 SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7 和 SEQ ID N0:8。
[0052] 針對轉(zhuǎn)膜儀，采用半干法轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜緩沖液為48mM Tris，39mM甘氨酸，20%甲醇， 0. 037% SDS，具體步驟如下：
[0053] 將SDS聚丙烯酰胺凝膠取下，置于轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡，剪裁一塊大小相同的PVDF 膜，將其放置于1〇〇%甲醇中激活l〇s，然后將膜用去離子水清洗掉膜上殘余的甲醇，置于 轉(zhuǎn)膜緩沖液中；按濾紙-PVDF膜-凝膠-濾紙，自下而上順序組裝，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜；將轉(zhuǎn)膜儀組裝 完畢，設(shè)置恒壓18V，轉(zhuǎn)膜2個小時；
[0054] 封閉：將轉(zhuǎn)完的PVDF膜浸泡在含有5 %的脫脂奶粉的TBST緩沖液中（20mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.05%的 Tween20)中封閉 lh;
[0055] -抗包被：將封閉好的PVDF膜浸泡于含一抗TBST包被液中（含anti-His antibody, 1:3000, Invitrogen, 3%脫脂奶粉）1小時；用TBST緩沖液每隔lOmin洗漆一次， 洗6次，去除非特異性結(jié)合抗體；
[0056] 二抗包被：將上步中的PVDF膜浸泡在含有山羊抗鼠 IgG/辣根酶標(biāo)記抗體和3% 的脫脂奶粉的的TBST緩沖液中，振蕩1小時；用TBST緩沖液每隔lOmin洗滌一次，洗6次，， 去除非特異性結(jié)合的二抗；
[0057] 用TBST緩沖液每隔lOmin洗滌一次，洗6次，加入發(fā)色底物反應(yīng)3-5min，曝光，顯 影，定影。
[0058] Western-Blotting結(jié)果顯示IPTG誘導(dǎo)組分中分子量27kDa處蛋白條帶為目的蛋 白條帶，且該蛋白經(jīng)Ni柱分離純化后于250mM咪唑下中得到富集分離，純度達95%以上。
[0059] 實施例3.細(xì)菌硝基還原酶突變體的活性測定
[0060] 將250mM咪唑洗脫下來的重組蛋白，按照摩爾濃度比蛋白：FMN = 1 :10的比例混 勻，放置4°C冰箱中孵育2個小時。孵育結(jié)束后，將重組蛋白脫鹽至20mM Tris-HCl緩沖液 (PH7.0)中，以進行后續(xù)蛋白活性檢測等實驗。
[0061] 1. HPLC分析突變體對CB1954還原的區(qū)位選擇性
[0062] 用高效液相色譜（HPLC)安捷倫1200分析突變體NfsB-F124W、NfsB-N71S/ F124W、NfsB-F123A/F124W 和 NfsB-N71S/F123A/F124W 對底物 CB1954 還原的區(qū)位選擇性。 HPLC酶催化反應(yīng)體系中含有：0. ImM CB1954,0. 2mM NADH，200nM突變體酶，反應(yīng)緩沖液為 20mMTris-HCl pH7. 0,室溫反應(yīng)5-15分鐘。由于CB1954及其反應(yīng)產(chǎn)物加熱不穩(wěn)定，所以用 等體積乙酸乙酯萃取終止反應(yīng)，12000Xg離心lOmin。取上層乙酸乙酯相用于HPLC分析。 圖1為HPLC分析NfsB野生型及突變體蛋白對癌癥治療前藥CB1954還原的區(qū)域選擇性。
[0063] HPLC分析柱選用C18反相疏水層析柱，粒徑5 μ m，4. 6mmX 250mm，流動相組成為 甲醇和水體系，流速為〇.8ml/min，進樣體積為10 μ 1，用紫外檢測器檢測。洗脫梯度為 20% -60%甲醇線性洗脫30min，檢測波長為262nm，柱溫20°C。兩種羥氨產(chǎn)物保留時間分 力ij 為：1?4-冊。11 - 6. 6rnin，R2-nhcih - 13. 7rnin。
[0064] F124W、N71S/F124W、F123A/F124W 及 N71S/F123A/F124W 突變體均可催化癌癥治療 前藥CB1954還原生成單一的較高生物毒性的4-NH0H產(chǎn)物。
[0065] 2.硝基還原酶突變體的動力學(xué)測定
[0066] 所有的動力學(xué)常數(shù)都是用全波長掃描突光酶標(biāo)儀（Varioskan?，Thermo Fisher Scientific)用連續(xù)測點的方法于37°C恒溫檢測。硝基還原酶動力學(xué)檢測體系：總體積 200yl，20mM Tris-HCl(pH7. 0)的緩沖液中含有60μΜ NADH，一系列不同濃度的待測底物 和適量的酶。隨反應(yīng)進行，通過檢測340nm下NADH的消耗量，進而計算底物消耗反應(yīng)速率。 每還原lmol硝基基團，需要消耗2mol的NADH分子。所有的動力學(xué)實驗至少重復(fù)3次，數(shù) 據(jù)用非線性擬合軟件Origins. 5處理得出數(shù)據(jù)以及誤差范圍。
[0067] 表1.野生型及突變體NfsB蛋白對底物CB1954的動力學(xué)常數(shù)。
[0068]

【權(quán)利要求】
1. 一類區(qū)位選擇性細(xì)菌硝基還原酶基因，其核苷酸序列為SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、 SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4 中的一種。
2. 如權(quán)利要求1所述的區(qū)位選擇性細(xì)菌硝基還原酶基因所編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序 列為 SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8 中的一種。
3. 一種包含如權(quán)利要求1所述基因之一的重組表達載體。
4. 一種包含如權(quán)利要求3所述的重組表達載體之一的重組表達轉(zhuǎn)化體。
5. -種重組區(qū)位選擇性細(xì)菌硝基還原酶的制備方法，其特征在于：培養(yǎng)權(quán)利要求4所 述重組表達轉(zhuǎn)化體之一的菌株，從菌株的培養(yǎng)物中純化得到突變型區(qū)位選擇性細(xì)菌硝基還 原酶的蛋白。
6. 如權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)或如權(quán)利要求4所述的重組表達轉(zhuǎn)化體作為催化劑在催 化硝基還原，在藥物激活劑代謝、芳香羥胺化合物的生物合成以及硝基類環(huán)境污染物生物 代謝領(lǐng)域的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/63GK104099351SQ201410336949
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月15日
【發(fā)明者】楊君, 白敬, 劉培瑜, 姜熙, 楊青 申請人:大連理工大學(xué)