防治西瓜枯萎病的生防菌株及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了防治西瓜枯萎病的生防菌株及其應用，其分類命名為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）XGY13-1，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC?NO.8973。將防治西瓜枯萎病的生防菌株單菌落挑至于LB液體培養(yǎng)基，30℃180rpm搖床振蕩培養(yǎng)10h，獲得種子液，將種子液以1%（v/v）的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，于30℃180rpm搖床振蕩培養(yǎng)8-9d，制備得到生防菌劑，稀釋20-100倍后在西瓜種植時浸種處理，或者在移栽時進行灌根處理，對西瓜枯萎病的防效在62.36%。同時，該菌劑還有促生功能。
【專利說明】防治西瓜枯萎病的生防菌株及其應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種防治西瓜枯萎病的生防菌株及其應用，屬于植物保護【技術領域】， 專用于西瓜枯萎病的生物防治。

【背景技術】
[0002] 西瓜枯萎病是由尖抱鎌刀菌西瓜?；虵usarium oxysporum schlechlendahl f. sp. melons (Leach at currence) snyder et Hansen 侵染導致的維管束系統(tǒng)病害，是一種 世界性土傳病害，為西瓜的主要病害之一，自1894年在美國南卡羅來納州首次發(fā)現(xiàn)以來， 目前在世界各個西瓜產(chǎn)區(qū)、在西瓜生長的任何時間都有發(fā)生，嚴重威脅著西瓜的安全生產(chǎn)。
[0003] 西瓜枯萎病自幼苗至成株均可發(fā)生，以座瓜期和瓜膨大后期發(fā)病最重。幼苗受害， 出苗前可造成爛種；出土后發(fā)病，子葉、真葉呈失水狀萎蔫，莖基部變褐收縮呈猝倒狀，拔出 瓜苗可見根部黃褐色腐爛。成株期受害，初期病株下部葉片呈失水狀萎蔫，似水燙狀，莖蔓 基部向上褪綠。最初萎蔫在中午尤為明顯，但早晚可恢復，3-6d后整株葉片枯萎下垂，不能 復原，后期病部呈棕褐色，發(fā)軟，?？v裂，有膠狀物溢出，俗稱吐"紅水"。在潮濕條件下病株 基部布滿白色至粉紅色霉狀物，即病原的分生孢子，剖視莖基部至根部，可見維管束變黃褐 色。病根根系變暗褐色并腐爛，極易拔起，嚴重時瓜秧枯死，但葉片不脫落。
[0004] 溫度高、濕度大是發(fā)生病害的原因之一。病菌在24-32°C和高濕條件下侵染力強， [0005] 發(fā)病快，連陰2d以上、降雨量大及土壤粘重、地勢低洼、排水不良、管理粗放的連 作地塊均有此病發(fā)生。肥料配比不合理是引起發(fā)病的另一個主要原因。底肥不足，氮肥過 量，磷、鉀肥不足，使用未腐熟好的帶病菌的有機肥，地下害蟲危害嚴重等都可以導致西瓜 枯萎病的發(fā)生。西瓜枯萎病發(fā)生輕重與輪作年限直接相關，輪作年限越短，發(fā)病越重；輪作 年限越長，發(fā)病越輕。連作地死株率高，往往造成改種或毀種。
[0006] 鐮刀菌以菌絲和厚垣孢子在土壤或未腐熟的帶菌肥料中越冬，一般分布在0-25 cm 土層內(nèi)，成為翌年發(fā)病的初侵染源，種子也可帶菌。該菌侵染寄主植物根系的溫度為 5-35°C，最適溫度為23-28°C。病菌侵染通過胚根侵染發(fā)芽的種子，通過植株根部自然傷口 或從根毛頂端細胞間侵入，或通過線蟲等侵染傷口及其它機械損傷傳入，最終進入維管束。 菌絲體和分生孢子在植株體內(nèi)分布廣泛，且以下胚軸和子葉節(jié)中的數(shù)量最多，導管周圍的 薄壁細胞中有時也有菌絲存在，但無分生孢子。該菌可使皮層腐爛，子葉和嫩葉褪綠，在胚 軸上出現(xiàn)水浸狀軟腐環(huán)帶，使成株葉片萎蔫，任何生育階段都可發(fā)生枯萎病，西瓜開花期和 結果期最為明顯。
[0007] 在無寄主情況下，病菌仍可在土中存活6年以上，有時甚至超過10年，更有甚者菌 核和厚垣孢子通過家畜消化系統(tǒng)后仍具有生活能力。而在水田中1-2年后基本上失去活 性。土壤含水量為70%的壤土最適于病原菌生存；含水量為40%時，土壤質(zhì)地對病菌存活 率無明顯影響。在病害嚴重的地塊，許多作物如香附子、畔茅、再生稻、花生及番茄等都成為 病原菌的寄生場所；自然重病田連續(xù)3年種植非寄主植物如大蔥、大蒜、辣椒、茄子、玉米及 大豆等均能減少病原菌數(shù)量。
[0008] 目前對西瓜枯萎病的防治主要采用南瓜砧木嫁接的方法，這種方法嚴重影響到西 瓜的口感，降低西瓜品質(zhì)。針對西瓜枯萎病分布廣、危害嚴重、難以防治以及化學農(nóng)藥的種 種弊病和研制化學農(nóng)藥歷時長、花費大的現(xiàn)實，迫切需要開發(fā)并商業(yè)化生產(chǎn)用于防治西瓜 枯萎病的生物農(nóng)藥。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 針對現(xiàn)有技術中沒有對西瓜枯萎病有較高防效的生防制劑的現(xiàn)狀，提供開發(fā)一種 防治西瓜枯萎病的單一生防菌菌株及其應用，該菌劑對這種重要土傳病害的防效可以達到 60%以上。
[0010] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為：
[0011] 一種防治西瓜枯萎病的生防菌株，其分類命名為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)XGY13-l，已于2014年3月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，菌種保藏號 為 CGMCC N0. 8973。
[0012] 所述的防治西瓜枯萎病的生防菌株在防治西瓜枯萎病中的應用。
[0013] 將防治西瓜枯萎病的生防菌株單菌落挑至于LB液體培養(yǎng)基，30°C 180rpm搖 床振蕩培養(yǎng)l〇h，獲得種子液，將種子液以1% (v/v)的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，于 30°C 180rpm搖床振蕩培養(yǎng)8-9d，制備得到生防菌劑，稀釋20?100倍后浸種或者灌根使 用。在西瓜種植前浸種使用至少半小時，或者在移栽時以每畝9升進行灌根處理。
[0014] 所述的生防菌劑中活菌總濃度為1 X 109?1 X 101(lCFU/mL。
[0015] 所述LB液體培養(yǎng)基為：酵母粉5g/L、胰蛋白胨10g/L、氯化鈉10g/L，調(diào) pH7. 0-7. 2。
[0016] 所述的發(fā)酵液為：黃豆粉l〇g/L、玉米粉75g/L、磷酸氫二鉀0. 5g/L、7水硫酸鎂 0. 2g/L、酵母膏：0. 4g/L、氯化鈉 5g/L。
[0017] 有益效果：
[0018] 本發(fā)明是專門針對西瓜枯萎病開發(fā)的生防制劑。本發(fā)明有利于西瓜的無公害生 產(chǎn)，農(nóng)民可以不用或減少其他化學農(nóng)藥的用量，節(jié)省農(nóng)民開支。本發(fā)明可省掉砧木的使用， 改善西瓜風味，提高西瓜品質(zhì)，促進農(nóng)民增收。同時，該菌劑還有促生功能（表2)。
[0019] 溫室實驗表明：該菌制劑能顯著降低西瓜枯萎病的發(fā)生。該菌劑可以稀釋100倍 后在西瓜種植時浸種處理幼苗，或者在移栽時灌根處理。在溫室條件下對于西瓜枯萎病的 防效可以達到62. 36% (表1)。

【具體實施方式】
[0020] 實施例1防治西瓜枯萎病的生防菌株的篩選方法
[0021] 防治西瓜枯萎病的生防菌株，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)XGY13-l，為 2013年在江蘇南京病田土壤中分離得到，篩選過程如下：
[0022] 于2013年5月，在江蘇省南京市溧水區(qū)西瓜枯萎病發(fā)病嚴重的地塊采集樣品。采 用五點采樣法，每點間隔至少l〇m。每點收集三株健康植株的根圍土，帶回實驗室進行分離。
[0023] 稱取根圍土 3g，分別加入到27mL滅菌水中（含滅菌玻璃珠），180rmp搖床振蕩 0· 5h，靜置5min，得到ΚΓ1稀釋液，吸取上清液0· lmL依次稀釋，分別取10_4 -10_6三個梯 度0. lmL涂LB平板，28°C培養(yǎng)48h，選取菌落數(shù)在50300之間的平板，計數(shù)并且挑取所 有菌落，純化，_70°C，40%甘油保存?zhèn)溆谩?br> [0024] 用LB平板活化分離純化的菌株，牙簽挑取處于生長盛期的菌落點于含西瓜枯萎 病原菌的YGPA平板上，每板5點，間距相等，30°C培養(yǎng)48h，觀察并且記錄結果，分別量取頡 頏菌內(nèi)徑以及額頏圈外徑。根據(jù)內(nèi)外徑之差劃分為三個等級1 一3mm, 3一6mm, 6mm以上。培 養(yǎng)基LB :酵母粉5g/L、胰蛋白胨10g/L、氯化鈉10g/L，調(diào)pH7. 0-7. 2。
[0025] 按照平板拮抗活性、蛋白酶活性、幾丁質(zhì)酶活性、纖維素酶活性、葡聚糖酶活性以 及產(chǎn)嗜鐵素活性，采用賦值法，選擇出綜合得分最高較高菌株，通過溫室試驗最終篩選出防 治效果最好的XGY13-1。
[0026] 實施例2菌株鑒定
[0027] 防治西瓜枯萎病的生防菌株，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)XGY13_l為革蘭 氏陽性桿菌，單個細胞0.7?0.8X2?3微米，著色均勻。無莢膜，周生鞭毛，能運動。芽 孢0. 6?0. 9X 1. 0?1. 5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨 大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，在LB液體培養(yǎng)基中生長時，常形成皺醭。需氧 菌?？衫玫鞍踪|(zhì)、多種糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。
[0028] 實施例3 XGY13-1生防菌劑的制備
[0029] LB液體培養(yǎng)基為：酵母粉5g/L、胰蛋白胨10g/L、氯化鈉10g/L，調(diào)pH7. 0-7. 2。
[0030] 發(fā)酵液為：黃豆粉l〇g/L、玉米粉75g/L、磷酸氫二鉀0. 5g/L、7水硫酸鎂0. 2g/L、 酵母膏：0.4g/L、氯化鈉5g/L。
[0031] 將分離出的XGY13-1單菌落挑至于LB液體培養(yǎng)基，30°C 180rpm搖床振蕩培養(yǎng) l〇h，獲得種子液。將種子液以1%的接種量接種于上述發(fā)酵培養(yǎng)基，于30°C 180rpm搖床振 蕩培養(yǎng)8-9d，菌劑成品中活菌總濃度為1 X 109-1 X 101(lCFU/mL。
[0032] 實施例4溫室盆缽試驗檢測XGY13-1生防菌劑對西瓜枯萎病的防效
[0033] 移栽之前，用實施例3制備的生防菌劑XGY13-1 (稀釋至107CFU/mL)浸種處理幼 苗30min ;移栽時采用20mL107CFU/mL菌劑灌根處理，移栽一周后接種107CFU/mL西瓜枯萎 病菌[Fusarium oxysporum schlechlendahl f. sp. melons (Leach at currence) snyder et Hansen],孢子懸液20mL。另外不用生防菌XGY13-1處理，直接接種西瓜枯萎病菌孢子 懸液作為對照處理。每個處理組24株，三次重復。在溫度25?28°C，相對濕度40%，光照 12h/12h條件下，培養(yǎng)4周后調(diào)查病級數(shù)，計算病害嚴重度和防效，結果見表1。
[0034] 按照Kempe和Sequerial983年提出的病害分級標準，病害嚴重度和防效的計算公 式如下：
[0035] DI0,無發(fā)??；
[0036] DI1，< 25%的葉片萎蔫；
[0037] DI2,25 - 50% 的葉片萎蔫；
[0038] DI3,50 - 75% 的葉片萎蔫；
[0039] DI4, 75 - 100% 的葉片萎蔫（Kempe and Sequeria, 1983)。
[0040]
【權利要求】
1. 一種防治西瓜枯萎病的生防菌株，其分類命名為枯草芽孢桿菌 sMii/is) XGY13-1，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏 號為 CGMCC NO. 8973。
2. 權利要求1所述的防治西瓜枯萎病的生防菌株在防治西瓜枯萎病中的應用。
3. 根據(jù)權利要求2所述的防治西瓜枯萎病的生防菌株在防治西瓜枯萎病中的應用，其 特征在于：將防治西瓜枯萎病的生防菌株單菌落挑至于LB液體培養(yǎng)基，30°C 180 rpm搖床 振蕩培養(yǎng)l〇h，獲得種子液，將種子液以1% (v/v)的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，于30°C 180 rpm搖床振蕩培養(yǎng)8-9d，制備得到生防菌劑，稀釋后浸種或者灌根使用。
4. 根據(jù)權利要求3所述的防治西瓜枯萎病的生防菌株在防治西瓜枯萎病中的應用，其 特征在于：所述的生防菌劑中活菌總濃度為1X 10, X 101° CFU/mL。
5. 根據(jù)權利要求3所述的防治西瓜枯萎病的生防菌株在防治西瓜枯萎病中的應用，其 特征在于：所述的發(fā)酵液為：黃豆粉l〇g/L、玉米粉75g/L、磷酸氫二鉀0. 5g/L、7水硫酸鎂 0. 2g/L、酵母膏：0. 4g/L、氯化鈉 5g/L。
6. 根據(jù)權利要求3所述的防治西瓜枯萎病的生防菌株在防治西瓜枯萎病中的應用， 其特征在于：所述LB液體培養(yǎng)基為：酵母粉5g/L、胰蛋白胨10g/L、氯化鈉10g/L，調(diào)pH 7. 0-7. 2。
7. 根據(jù)權利要求3所述的防治西瓜枯萎病的生防菌株在防治西瓜枯萎病中的應用，其 特征在于：所述稀釋倍數(shù)為20-100倍。
【文檔編號】C12N1/20GK104087542SQ201410340374
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月16日 優(yōu)先權日:2014年7月16日
【發(fā)明者】張磊, 晏楓霞, 韓先旭, 盧魏魏 申請人:南京新果園生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司