一種用于解析牦牛瘤胃微生物結(jié)構(gòu)多樣性的dna提取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于解析牦牛瘤胃微生物結(jié)構(gòu)多樣性的DNA提取方法，利用物理、化學(xué)和酶等多種方法配合對細(xì)胞壁進(jìn)行裂解，使之能夠最大限度釋放微生物DNA，特別是對革蘭氏陽性菌有很好的裂解效果；另外，本發(fā)明所用的化學(xué)試劑都是實驗室常備的，容易獲得且價格低廉。使用本發(fā)明得到的高通量測序結(jié)果能夠比較準(zhǔn)確地反映瘤胃中微生物的豐度及多樣性。
【專利說明】一種用于解析牦牛瘤胃微生物結(jié)構(gòu)多樣性的DNA提取方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物實驗技術(shù)，尤其是一種用于評價反芻動物瘤胃微生物群落多樣性 的DNA提取方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 反芻動物瘤胃內(nèi)存在著豐富的微生物菌群，這些微生物菌群能夠通過發(fā)酵，將難 以消化的纖維素轉(zhuǎn)化為可以被小腸吸收的蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類、酸類和脂類等，為反芻動 物提供營養(yǎng)物質(zhì)。另外，這些微生物對機(jī)體的免疫、生長發(fā)育等方面也有著巨大的影響。因 此，它們的分離和鑒定對于研究瘤胃菌群功能具有重要作用。此外，瘤胃微生物作為一個巨 大的基因庫，探索其中具有應(yīng)用價值的基因，可以應(yīng)用于農(nóng)牧業(yè)，醫(yī)療保健，生物化工等方 面，從而更好地為人類服務(wù)。
[0003] 傳統(tǒng)分離瘤胃微生物的方法主要是通過選擇性培養(yǎng)基分離法。由于培養(yǎng)條件 的限制，迄今為止，瘤胃中微生物只有小部分能夠被培養(yǎng)，絕大多數(shù)還不為人所知。近 年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，產(chǎn)生了一些新的微生物研究方法，如：變性梯度凝膠 電泳（Denaturing gradient gelelectrophoresis，DGGE)，末端限制性片段長度多態(tài)性 (Terminal restriction fragment length polymorphisms, T-RFLP)以及高通量測序方法 (high throughput sequencing technology)這些方法突破了微生物分離培養(yǎng)的限制，能 夠用于全面分析自然界的微生物類群及充分挖掘基因資源。然而，對于這些基于核酸技術(shù) 來分析樣本微生物結(jié)構(gòu)的方法，DNA提取的質(zhì)量好壞，會直接影響到微生物群落結(jié)構(gòu)分析結(jié) 果。因此，探索簡便、高效、低成本的DNA提取方法將是研究瘤胃微生物菌落結(jié)構(gòu)研究所面 臨的重要難題。
[0004] 牦牛大多生活在高海拔，低氧，低溫，采食惡劣的環(huán)境中，由于所處的惡劣讓牦牛 消化系統(tǒng)更加高效和穩(wěn)定，保障其生存和繁衍。再加上如今經(jīng)濟(jì)全球化，環(huán)境污染和生物 入侵日漸加重，青藏高原作為地球上不多的未受大規(guī)模污染的地方，不論生態(tài)環(huán)境還是飼 養(yǎng)方法都是出于比較原始的狀態(tài)。牧區(qū)由于畜牧醫(yī)療技術(shù)的相對落后及抗生素等藥物的慎 用，保證了牦牛瘤胃中的大量微生物是處在原始狀態(tài)，未受到人為因素影響的。因此，牦牛 也是研究瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)的最好的模式動物。另外，與規(guī)模舍飼養(yǎng)殖的牛群相比，由于 特殊的采食環(huán)境，牦牛瘤胃內(nèi)往往含有大量的腐殖質(zhì)和泥沙，這些物質(zhì)會對DNA提取產(chǎn)生 影響并增加基因組提取的難度，因此探索一套適合于牦牛瘤胃微生物DNA提取方法具有重 要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 鑒于現(xiàn)有技術(shù)的以上不足，本發(fā)明的目的提供一種更適合的牦牛瘤胃微生物結(jié)構(gòu) 多樣性的DNA提取方法，使之更為準(zhǔn)確地反映瘤胃中微生物的豐度及多樣性。
[0006] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：
[0007] -種用于分析牦牛瘤胃微生物群落多樣性提取方法，包括以下步驟：
[0008] (1)向0. 5-2g牦牛瘤胃樣品中加入10ml4°C樣品洗滌液A，渦旋振蕩lmin4°C離 心機(jī)，1000r/min，離心5min，吸取上清液；再次向含有瘤胃內(nèi)容物的離心管中加入4°C 5ml 洗滌液A，放置于渦旋震蕩儀，振蕩lmin，吸取上清液；再次向含有瘤胃內(nèi)容物的離心管中 加入4°C 5ml洗滌液A，放置于渦旋震蕩儀，振蕩lmin，吸取上清液。所有上清液于4°C， 12000r/min離心lOmin，小心倒掉離心管上層清液，保留離心管底部的微生物和腐殖質(zhì)，泥 土混合物的沉淀層。
[0009] (2)微生物沉淀層里邊加入60ul裂解緩沖液B，加入3ul蛋白酶K，顛倒混勻，放置 于58°C恒溫?fù)u床孵育lh。
[0010] 加入 lOOul NaCl 溶液，加入 80ul CTAB 裂解液 65°C水浴 lOmin。
[0011] 加入〇. lg直徑為〇. 2mm beads,放置于渦旋振蕩儀上進(jìn)行順時針和逆時針渦旋交 替震蕩3min。
[0012] 加入溶菌酶3mg，顛倒混勻，放置于37°C恒溫?fù)u床，孵育lh。
[0013] 加入等體積（氯仿：異戊醇=24:1)，混勻后放于冰上靜置，3min，12000r/min抽提 蛋白質(zhì)。
[0014] 吸取上清液置新滅菌離心管中，加入等體積（苯酚：氯仿：異戊醇= 25:24:1)混 勻于冰上靜置3min。
[0015] 12000r/min抽提蛋白質(zhì)吸取上清液，置于新的滅菌離心管中，再次加入等體積 (氯仿：異戊醇=24:1),混勻后放于冰上靜置5min。
[0016] 12000r/min離心5min,吸取上清液放置于新的離心管中，加入0. 6倍體積異丙醇， 重懸，室溫放置5min。
[0017] 12000r/min 離心 lOmin，加入 1Π 11701%冰乙醇洗漆。
[0018] 12000r/min離心5min，加入50ul無菌水溶解。
[0019] 加入3ul RNA酶，37°C，靜置lh，獲得純度較高的DNA溶液。
[0020] 用分光光度計對DNA溶液濃度和純度進(jìn)行測定，結(jié)果表0D260/0D230 = 1. 93， 0D260/0D280 = 1. 85,均接近標(biāo)準(zhǔn)值（DNA 溶液 0D260/0D230 標(biāo)準(zhǔn)值為 2. 0,0D260/0D280 = 1. 8)，DNA量達(dá)到0. 5ug-2ug (達(dá)到了后續(xù)相關(guān)高通量測序?qū)NA量要求）；以0. 8 %瓊脂糖 凝膠電泳，λ DNA作為對照，檢測所提取DNA片段完整性，電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)所提取的DNA具有 較好的完整性。
[0021] 上述步驟中的洗滌液Α為PBS緩沖液，可以避免滲透壓不同而造成的細(xì)胞裂解。
[0022] 上述步驟中的裂解緩沖液B為TE緩沖液（pH = 7)，可以維持后續(xù)反應(yīng)的最佳理化 條件。
[0023] 上述步驟中的CTAB裂解液濃度為10 %。
[0024] 上述步驟中的蛋白酶K溶液濃度為20mg/ml。
[0025] 上述步驟中的NaCl溶液為5mol/L。
[0026] 本發(fā)明是利用物理、化學(xué)和酶等多種方法對細(xì)胞壁進(jìn)行裂解，從而能夠最大限度 釋放微生物DNA，特別是對革蘭氏陽性菌有很好的裂解效果；另外，本發(fā)明所用的化學(xué)試劑 都是實驗室常備的，容易獲得且價格低廉。使用本發(fā)明得到的高通量測序結(jié)果能夠比較準(zhǔn) 確地反映瘤胃中微生物的豐度及多樣性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1為本發(fā)明提取的牦牛瘤胃微生物基因組DNA電泳圖譜。
[0028] 圖2為不同DNA提取方法得到的牦牛瘤胃微生物群體結(jié)構(gòu)分布圖（在門分類水平 上）。圖中可以看出不同DNA基因組提取方法所得到的微生物結(jié)構(gòu)存在差異。
[0029] 圖3為不同DNA提取方法得到牦牛瘤胃微生物群體結(jié)構(gòu)Heat-map比對圖，為基于 樣品豐度前50的瘤胃細(xì)菌群體的熱圖。Heat-map中，其用顏色深淺來表示所代表數(shù)值大 小，通過顏色直觀變化，可以反映不同DNA提取方法之間微生物群體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)差異.圖中可 以看出本發(fā)明（方法6)提取的瘤胃微生物的基因組能夠較真實全面反映瘤胃內(nèi)部微生物 結(jié)構(gòu)。

【具體實施方式】
[0030] 以下結(jié)合具體實例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0031] Nac 1、Kc 1、Na2HP04、KH2P04、CTAB、堿性飽和酚、氯仿、異戊醇等試劑均為國產(chǎn)分析純 試劑，蛋白酶K，溶菌酶均為進(jìn)口生物純試劑。
[0032] 實施例1 :瘤胃內(nèi)容物采集
[0033] 用滅菌手術(shù)刀，在剛從宰殺牦牛體內(nèi)取出的瘤胃背部打開約10CM的平整外翻切 口。帶一次性滅菌手套，支撐切口，采樣者手戴一次性滅菌手套，持已經(jīng)滅菌50ml離心管， 在未打開的情況下，探入瘤胃中開蓋，充分?jǐn)噭訕悠肥沽鑫竷?nèi)容物能夠充分混勻，裝入離心 管。離心管裝滿后，應(yīng)當(dāng)在瘤胃中立即蓋嚴(yán)，然后取出，迅速投入干冰當(dāng)中凍存，迅速帶回實 驗室于-80°C冰箱中保存。
[0034] 實施例2 :微生物菌體獲得
[0035] 為了保證微生物DNA中沒有過多的動植物細(xì)胞DNA污染，微生物菌體沉淀的獲得 后續(xù)獲得高質(zhì)量微生物DNA的前提。向0. 5-2g牦牛瘤胃樣品中加入10ml4°C樣品洗滌液A， 潤旋振蕩lmin4°C離心機(jī)，1000r/min，離心5min，吸取上清液；再次向含有瘤胃內(nèi)容物的離 心管中加入4°C 5ml洗滌液A，放置于渦旋震蕩儀，振蕩lmin，吸取上清液；再次向含有瘤胃 內(nèi)容物的離心管中加入4°C 5ml洗滌液A，放置于渦旋震蕩儀，振蕩lmin，吸取上清液。所 有上清液于4°C，12000r/min離心lOmin，小心倒掉離心管上層清液，保留離心管底部的微 生物和腐殖質(zhì)，泥土混合物的沉淀層。
[0036] 實施例3 :微生物基因組提取
[0037] 微生物菌體團(tuán)里邊加入60ul裂解緩沖液B，加入3ul蛋白酶K，顛倒混勻，放置于 58°C恒溫?fù)u床孵育lh。
[0038] 加入 lOOul NaCl 溶液，加入 80ul CTAB 裂解液 65°C水浴 lOmin ;
[0039] 加入0. lg直徑為0. 2mm beads,放置于渦旋振蕩儀上進(jìn)行順時針和逆時針渦旋交 替震蕩3min。
[0040] 加入溶菌酶3mg，顛倒混勻，放置于37°C恒溫?fù)u床，孵育lh。
[0041] 加入等體積（氯仿：異戊醇=24:1)，混勻后放于冰上靜置，3min，12000r/min抽提 蛋白質(zhì)。
[0042] 吸取上清液置新滅菌離心管中，加入等體積（苯酚：氯仿：異戊醇= 25:24:1)混 勻于冰上靜置3min。
[0043] 12000r/min抽提蛋白質(zhì)吸取上清液，置于新的滅菌離心管中，再次加入等體積 (氯仿：異戊醇=24:1),混勻后放于冰上靜置5min.
[0044] 12000r/min離心5min，吸取上清液放置于新的離心管中，加入0. 6倍體積異丙醇， 重懸，室溫放置5min.
[0045] 12000r/min 離心 lOmin，加入 lml70%冰乙醇洗滌
[0046] 12000r/min離心5min，加入50ul無菌水溶解，
[0047] 加入3ul RNA酶，37°C，靜置lh，獲得純度較高的DNA溶液。
[0048] 實施例3DNA濃度、純度及完整性檢測
[0049] 采用分度光度計對提取的DNA溶液純度、濃度進(jìn)行檢查。結(jié)果表明：0D260/0D230 =1. 93, 0D260/0D280 = 1. 85,均接近標(biāo)準(zhǔn)值（DNA 溶 0D260/0D230 標(biāo)準(zhǔn)值為 2. 0, 0D260/ 0D280 = 1.8)，DNA量達(dá)到0. 5ug-2ug (達(dá)到了后續(xù)相關(guān)高通量測序?qū)NA量要求）。以 0.8%瓊脂糖凝膠電泳，入〇嫩作為1&^1?^，電壓為15(^，電泳時間為451^11，對提取的0嫩 片段完整性進(jìn)行檢查，如圖1所示，電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)所提取的DNA具有較好的完整性。
[0050] 實施例416rDNA PCR擴(kuò)增及高通量測序分析
[0051] 對實施例2中提取的DNA進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝 膠電泳檢測。16S rDNA 通用引物（338F:5, -ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3' ；806R:5' -GGACTAC HVGGGTWTCTAAT-3'），PCR產(chǎn)物送至深圳華大基因研究院進(jìn)行高通量測序及數(shù)據(jù)分析?；?Illumina MiSeq PE300(Illumina，USA)測序平臺，對瘤胃基因組進(jìn)行16S rR NA高通量測 序。Miseq測序得到的raw reads首先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，同時對序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì) 控和過濾。序列過濾后，將那些具有高度相似性（97%)的序列歸為一個OTU(Operational Taxonomic Unit)，同時，RDP(Ribosomal Database Project)數(shù)據(jù)庫被用于物種分類學(xué)分 析?；谝陨戏诸悓W(xué)信息，ACE豐度指數(shù)及Shannon多樣性指數(shù)被估算出來，具體測序信息 見表1，從表1中可以看出本發(fā)明提取的DNA具有較高的微生物群體多樣性及豐度指數(shù)。
[0052] 表1本發(fā)明提取牦牛瘤胃微生物DNA相關(guān)16S rDNA測序信息
[0053]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于解析牦牛瘤胃微生物結(jié)構(gòu)多樣性的DNA提取方法，包括以下步驟： (1) 向0. 5-2g牦牛瘤胃樣品中加入10ml4°C樣品洗滌液A，渦旋振蕩lmin，4°C離心機(jī)， 1000r/min，離心5min，吸取上清液；再次向含有瘤胃內(nèi)容物的離心管中加入4°C 5ml洗滌 液A，放置于渦旋震蕩儀，振蕩lmin，吸取上清液；再次向含有瘤胃內(nèi)容物的離心管中加入 4°C 5ml洗滌液A，放置于渦旋震蕩儀，振蕩lmin，吸取上清液；所有上清液于4°C，12000r/ min離心lOmin，倒掉離心管上層清液，保留離心管底部的微生物和腐殖質(zhì)，泥土混合物的 沉淀層； (2) 微生物沉淀層里邊加入60ul裂解緩沖液B，加入3ul蛋白酶K，顛倒混勻，放置于 58°C恒溫?fù)u床孵育lh ; 加入lOOul NaCl溶液，加入80ul CTAB裂解液65°C水浴lOmin; 加入0. lg直徑為0. 2mm beads,放置于渦旋振蕩儀上進(jìn)行順時針和逆時針渦旋交替震 蕩 3min ; 加入溶菌酶3mg，顛倒混勻，放置于37°C恒溫?fù)u床，孵育lh ; 加入等體積（氯仿：異戊醇=24:1)，混勻后放于冰上靜置，3min, 12000r/min抽提蛋白 質(zhì)； 吸取上清液置新滅菌離心管中，加入等體積（苯酚：氯仿：異戊醇=25:24:1)混勻于 冰上靜置3min ; 12000r/min抽提蛋白質(zhì)吸取上清液，置于新的滅菌離心管中，再次加入等體積（氯仿： 異戊醇=24:1),混勻后放于冰上靜置5min ; 12000r/min離心5min,吸取上清液放置于新的離心管中，加入0. 6倍體積異丙醇，重 懸，室溫放置5min ; 12000r/min離心lOmin，加入lml70%冰乙醇洗滌； 12000r/min離心5min，加入50ul無菌水溶解； 加入3ul RNA酶，37°C，靜置lh，獲得目標(biāo)純度DNA溶液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于解析牦牛瘤胃微生物結(jié)構(gòu)多樣性的DNA提取方法，其特 征在于，所述洗滌液A為PBS緩沖液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于解析牦牛瘤胃微生物結(jié)構(gòu)多樣性的DNA提取方法，其特 征在于，所述裂解緩沖液B為TE緩沖液（pH = 7)。
【文檔編號】C12Q1/04GK104099323SQ201410341823
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月18日
【發(fā)明者】蘭道亮, 李鍵, 陳亞冰, 湯承, 熊顯榮, 劉洛川 申請人:西南民族大學(xué)