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      細菌16SrDNA500片段基因測序及dblast數據庫分析方法

      文檔序號:482401閱讀:667來源:國知局
      細菌16SrDNA500片段基因測序及dblast數據庫分析方法
      【專利摘要】一種細菌16SrDNA500片段基因測序及dblast數據庫分析方法,包括以下步驟:步驟1:細菌DNA樣本提取,步驟2:細菌16S?rDNA500片段基因擴增,步驟3:純化PCR產物,步驟4:循環(huán)測序反應,步驟5:純化測序反應產物,步驟6:制備毛細管電泳樣品并電泳,和7.1基因測試質量分析接受標準。本發(fā)明具有方法便利,批量處理,數據準確,穩(wěn)定性高的優(yōu)點。
      【專利說明】細菌1 6SrDNA500片段基因測序及db I ast數據庫分析方法

      【技術領域】
      [0001] 本發(fā)明涉及一種數據庫分析方法,具體涉及一種細菌16SrDNA500片段基因測序 及dblast數據庫分析方法。

      【背景技術】
      [0002] 檢測環(huán)境中的細菌,以及細菌的多樣性,做DGGE,去做高通量測序,測它幾萬幾 十萬條。
      [0003] DGGE在用來分析菌群結構簡單的環(huán)境樣品時有著非常明顯的優(yōu)勢,比如傳統(tǒng)發(fā)酵 食品,再比如青貯飼料菌群變化。
      [0004] DGGE的缺點非常明顯的,尤其在用來分析復雜環(huán)境樣品的時候。特別是一個非常 復雜的環(huán)境,微生物的種類成百上千種。而DGGE的分辨率非常低,往往能分開30個條帶。


      【發(fā)明內容】

      [0005] 本發(fā)明的目的在于,提供一種細菌16SrDNA500片段基因測序及dblast數據庫分 析方法,以克服現有技術所存在的上述缺點和不足。
      [0006] 本發(fā)明所需要解決的技術問題,可以通過以下技術方案來實現:
      [0007] -種細菌16SrDNA500片段基因測序及dblast數據庫分析方法,其特征在于,包括 以下步驟:
      [0008] 步驟1 :細菌DNA樣本提取
      [0009] DNA 提取試劑盒:PrepMan? Ultra Sample Preparation Reagent
      [0010] 1. 1預加熱:打開恒溫混勻儀,設置溫度為99°C ;
      [0011] 1. 2在試管上標記樣品名稱,向每個試管中各加入PrepMan Ultra樣品制備試劑 100μ 1 ;
      [0012] 1. 3從長有菌落的瓊脂培養(yǎng)基上挑取單一克隆到上一步加入的樣品制備試劑中, 制成懸液;
      [0013] 1. 4每個試管充分混懸振蕩10到30秒;
      [0014] 1. 5樣品置99°C加熱10分鐘,然后冷卻到室溫;
      [0015] 1. 6樣品置微型離心管中,以12000rpm的轉速離心2分鐘;
      [0016] 1.7立即轉移上層液50 μ 1到新的已標記的微型離心管中;
      [0017] 1. 8吸取無核酸酶水495 μ 1到微型離心管;
      [0018] 1. 9從第7步所制備溶液轉移5 μ 1到495 μ 1的水中,獲得1:100的DNA樣品溶 液;
      [0019] 1. 10渦旋離心管,以混合溶液,1:100的溶液可保存于4°C (1個月)或-20°c ( - 年);
      [0020] 步驟2 :細菌16S rDNA500片段基因擴增
      [0021] 16S rDNA500 基因擴增試劑盒:ABFast MicroSeq? 50016S rDNA PCRKit
      [0022] 2. 1將試劑盒中的三管試劑置室溫下解凍;
      [0023] 2. 2試劑使用前溫和地混懸5秒,分別吸取15 μ 1的PCR Master Mix試劑到96孔 快速PCR板或PCR管上;需加試劑的孔數量或管數為所有樣品數量加上陽性和陰性對照的 總數
      [0024] 2. 3取步驟一制得的1:100的樣品DNA15 μ 1,轉移到樣品孔或管中;
      [0025] 2. 4吸取15 μ 1的陽性和陰性對照至相對應的孔或管中;
      [0026] 2. 5將粘膜覆蓋在96孔板上并封嚴,或蓋緊管蓋;
      [0027] 2. 6打開PCR儀,按試劑盒指導設置PCR儀的熱循環(huán)參數;
      [0028] 熱循環(huán)參數:初始階段:95°C維持10秒鐘;
      [0029] 循環(huán)階段:95°C融解變性0秒;64°C退火15秒;
      [0030] 循環(huán)數30個;
      [0031] 最終擴增階段:72 °C維持1分鐘;
      [0032] 結束階段:降至4°C保溫;
      [0033] 設置反應體積為30 μ 1 ;
      [0034] 2. 7放置96孔板或管到PCR儀,并運行PCR程序;
      [0035] 完成后,PCR產物可存儲于-15?-25°C,需要時取用,PCR產物在-20°C可保持穩(wěn) 定狀態(tài)至少6個月而不降解;
      [0036] 步驟3 :純化PCR產物
      [0037] PCR產物純化試劑盒:AxyPrep PCR清潔試劑盒
      [0038] 3. 1使用前,取Buffer W2concentrate濃縮物,按試劑瓶上指定的體積加入無水 乙醇,使用前注意檢查Buffer PCR-A是否出現沉淀,如有沉淀,用65°C溫浴加熱至沉淀完 全溶解并冷卻至室溫后使用;
      [0039] 3. 2向步驟二獲得的PCR產物中,加入3倍體積的Buffer PCR-A(若不足100 μ 1, 補足至100 μ 1),混勻后轉移至DNA制備管,將DNA制備管置于2ml離心管(試劑盒提供) 中,以12000g離心1分鐘,棄濾液;
      [0040] 3. 3將制備管放回2ml離心管中,加700 μ 1的Buffer W2,以12000g離心1分鐘, 棄濾液;
      [0041] 3. 4將制備管放回2ml離心管中,加400μ 1的Buffer W2,以12000g離心1分鐘, 棄濾液;
      [0042] 3. 5將制備管置于潔凈的1. 5ml離心管(試劑盒提供)中,在制備管的膜中央加 25?30 μ 1的Eluent或去離子水,室溫靜置1分鐘,以12000g離心1分鐘洗脫收集DNA ;
      [0043] 步驟4 :循環(huán)測序反應
      [0044] 測序試劑盒:ABMicroSeqk Full Genel6S rDNA Sequencing Kit
      [0045] 4. 1使用前,取出試劑盒中各管試劑在室溫下解凍后,置冰浴中;
      [0046] 4. 2試劑使用前,溫和地混懸5秒,分別吸取13 μ 1的PCR Master Mixl的正向測 序反應試劑和反向測序反應試劑到96孔快速PCR板或PCR管上,PCR Master Mix2和3同 法操作,對于每個樣品,一共為6孔或管;
      [0047] 4. 3向上一步加好PCR Master Mix的各管中加入步驟三所獲得的純化產物7 μ 1 ;
      [0048] 4. 4吸取相應的陽性對照和陰性對照7 μ 1按樣品孔同法操作;
      [0049] 4. 5將粘膜覆蓋在96孔板上并封嚴,或蓋緊管蓋;
      [0050] 4. 6打開PCR儀,按試劑盒指導設置PCR儀的熱循環(huán)參數;
      [0051] 熱循環(huán)參數:初始階段:96°C維持1分鐘;
      [0052] 循環(huán)階段:96°C融解變性10秒;50°C退火5秒;60°C擴增1分15秒;
      [0053] 循環(huán)數25個;
      [0054] 結束階段:降至4°C保溫;
      [0055] 設置反應體積為20 μ 1 ;
      [0056] 4. 7測序反應完成后,測序反應中過量染料和底物需要清除;
      [0057] 步驟5:純化測序反應產物
      [0058] 測序反應產物純化試劑盒:QIANGEN DyeEx? 2. OSpin Kit
      [0059] 5. 1溫和混懸過濾柱內的樹脂,去掉過濾柱的蓋子,將其放置到DyeEx試劑盒提供 的收集管中;
      [0060] 5. 2以3000rpm的轉速離心3分鐘,樹脂凝膠形成斜面,將形成斜面的柱子轉移到 到一個新的微型離心管中;
      [0061] 5. 3緩慢地將每份測序反應產物直接加入斜面柱的凝膠斜面表面中心部位,注意 不要觸碰到凝膠表面;
      [0062] 5. 4以每分鐘3000轉離心3分鐘;
      [0063] 5. 5丟棄斜面柱,洗出液中含有純化后的DNA ;
      [0064] 步驟6 :制備毛細管電泳樣品并電泳
      [0065] 6. 1移取10微升Hi-Di甲酰胺到96孔測序板,按排好的順序轉移10微升純化后 的DNA樣品到含有Hi-Di甲酰胺的孔中;
      [0066] 6. 2運行電泳;
      [0067] 步驟7 :使用測序儀產生并分析細菌序列,從商業(yè)數據庫dblast中比對序列,生成 報告
      [0068] 核酸測序儀:Applied Biosystems3130Genetic Analyzer
      [0069] 7· 1基因測試質量分析接受標準:
      [0070] 對于16S rDNA500 -致性序列長度<400bp ;
      [0071] 基線,過濾和裝配顯示綠方框;
      [0072] 樣本分值大于等于35 ;
      [0073] 7. 2將生成的.fsta文件倒入數據庫進行序列比對,最后生成報告;
      [0074] 7. 3 數據庫網:--Η :http://serverl. diagnostic-blast, com/ :
      [0075] 7. 4對于種水平鑒定要大于等于99. 00 % ;
      [0076] 7. 5屬水平鑒定大于等于97. 00 %小于99. 00 %。
      [0077] 本發(fā)明的有益效果:
      [0078] 本發(fā)明具有方法便利,批量處理,數據準確,穩(wěn)定性高的優(yōu)點。

      【具體實施方式】
      [0079] 以下結合具體實施例,對本發(fā)明作進步說明。應理解,以下實施例僅用于說明本發(fā) 明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
      [0080] 實施例1
      [0081] 細菌16SrDNA500片段基因測序及dblast數據庫分析流程
      [0082] 步驟一:細菌DNA樣本提取
      [0083] (DNA 提取試劑盒:PrepManκ) Ultra Sample Preparation Reagent)
      [0084] 1、預加熱:打開恒溫混勻儀,設置溫度為99°C ;
      [0085] 2、在試管上標記樣品名稱,向每個試管中各加入PrepMan Ultra樣品制備試劑 100μ 1 ;
      [0086] 3、從長有菌落的瓊脂培養(yǎng)基上挑取單一克隆到上一步加入的樣品制備試劑中,制 成懸液;
      [0087] 4、每個試管充分混懸振蕩10到30秒;
      [0088] 5、樣品置99°C加熱10分鐘,然后冷卻到室溫;
      [0089] 6、樣品置微型離心管中,以12000rpm的轉速離心2分鐘;
      [0090] 7、立即轉移上層液50 μ 1到新的已標記的微型離心管中;
      [0091] 8、吸取無核酸酶水495 μ 1到微型離心管;
      [0092] 9、從第7步所制備溶液轉移5 μ 1到495 μ 1的水中,獲得1:100的DNA樣品溶液;
      [0093] 10、渦旋離心管,以混合溶液。1:100的溶液可保存于4°C (1個月)或_20°C ( - 年);
      [0094] 步驟二:細菌16S rDNA500片段基因擴增
      [0095] (16S rDNA500 基因擴增試劑盒:ABFast MicroSeq? 50016S rDNA PCRKit)
      [0096] 1、將試劑盒中的三管試劑置室溫下解凍;
      [0097] 2、試劑使用前溫和地混懸5秒,分別吸取15 μ 1的PCR Master Mix試劑到96孔 快速PCR板或PCR管上;(需加試劑的孔數量或管數為所有樣品數量加上陽性和陰性對照 的總數。)
      [0098] 3、取步驟一制得的1:100的樣品DNA15 μ 1,轉移到樣品孔或管中;
      [0099] 4、吸取15 μ 1的陽性和陰性對照至相對應的孔或管中;
      [0100] 5、將粘膜覆蓋在96孔板上并封嚴,或蓋緊管蓋;
      [0101] 6、打開PCR儀,按試劑盒指導設置PCR儀的熱循環(huán)參數。
      [0102] 熱循環(huán)參數:初始階段:95°C維持10秒鐘;
      [0103] 循環(huán)階段:95°C融解變性0秒;64°C退火15秒;
      [0104] 循環(huán)數30個;
      [0105] 最終擴增階段:72 °C維持1分鐘;
      [0106] 結束階段:降至4°C保溫;
      [0107] 設置反應體積為30 μ 1
      [0108] 7、放置96孔板或管到PCR儀,并運行PCR程序;
      [0109] 完成后,PCR產物可存儲于-15?-25°C,需要時取用。PCR產物在-20°C可保持穩(wěn) 定狀態(tài)至少6個月而不降解;
      [0110] 步驟三:純化PCR產物
      [0111] (PCR產物純化試劑盒:AxyPr印PCR清潔試劑盒)
      [0112] 1、使用前,取Buffer W2concentrate濃縮物,按試劑瓶上指定的體積加入無水乙 醇。使用前注意檢查Buffer PCR-A是否出現沉淀,如有沉淀,用65°C溫浴加熱至沉淀完全 溶解并冷卻至室溫后使用;
      [0113] 2、向步驟二獲得的PCR產物中,加入3倍體積的Buffer PCR-A(若不足100 μ 1, 補足至100 μ 1),混勻后轉移至DNA制備管,將DNA制備管置于2ml離心管(試劑盒提供) 中,以12000g離心1分鐘,棄濾液;
      [0114] 3、將制備管放回2ml離心管中,加700μ 1的Buffer W2,以12000g離心1分鐘,棄 濾液;
      [0115] 4、將制備管放回21111離心管中,加40(^1的81^€6112,以1200(^離心1分鐘,棄 濾液;
      [0116] 5、將制備管置于潔凈的1.5ml離心管(試劑盒提供)中,在制備管的膜中央加 25?30 μ 1的Eluent或去離子水,室溫靜置1分鐘。以12000g離心1分鐘洗脫收集DNA ;
      [0117] 步驟四:循環(huán)測序反應
      [0118] (測序試劑盒:ABMicr〇SeqK'Full Genel6S rDNA Sequencing Kit)
      [0119] 1、使用前,取出試劑盒中各管試劑在室溫下解凍后,置冰浴中;
      [0120] 2、試劑使用前,溫和地混懸5秒,分別吸取13 μ 1的PCR Master Mixl的正向測序 反應試劑和反向測序反應試劑到96孔快速PCR板或PCR管上,PCR Master Mix2和3同法 操作,對于每個樣品,一共為6孔或管;
      [0121] 3、向上一步加好PCR Master Mix的各管中加入步驟三所獲得的純化產物7 μ 1 ;
      [0122] 4、吸取相應的陽性對照和陰性對照7 μ 1按樣品孔同法操作;
      [0123] 5、將粘膜覆蓋在96孔板上并封嚴,或蓋緊管蓋;
      [0124] 6、打開PCR儀,按試劑盒指導設置PCR儀的熱循環(huán)參數;
      [0125] 熱循環(huán)參數:初始階段:96°C維持1分鐘;
      [0126] 循環(huán)階段:96°C融解變性10秒;50°C退火5秒;60°C擴增1分15秒;
      [0127] 循環(huán)數25個;
      [0128] 結束階段:降至4°C保溫;
      [0129] 設置反應體積為20 μ 1
      [0130] 7、測序反應完成后,測序反應中過量染料和底物需要清除;
      [0131] 步驟五:純化測序反應產物
      [0132] (測序反應產物純化試劑盒:QIANGEN DyeEx? 2. OSpin Kit)
      [0133] 1、溫和混懸過濾柱內的樹脂,去掉過濾柱的蓋子,將其放置到DyeEx試劑盒提供 的收集管中;
      [0134] 2、以3000rpm的轉速離心3分鐘,樹脂凝膠形成斜面,將形成斜面的柱子轉移到到 一個新的微型離心管中;
      [0135] 3、緩慢地將每份測序反應產物直接加入斜面柱的凝膠斜面表面中心部位,注意不 要觸碰到凝膠表面;
      【權利要求】
      1. 一種細菌16SrDNA500片段基因測序及dblast數據庫分析方法,其特征在于,包括以 下步驟: 步驟1 :細菌DNA樣本提取, 步驟2 :細菌16S rDNA500片段基因擴增, 步驟3 :純化PCR產物, 步驟4 :循環(huán)測序反應, 步驟5 :純化測序反應產物, 步驟6 :制備毛細管電泳樣品并電泳,和 7. 1基因測試質量分析接受標準。
      2. 根據權利要求1所述的方法,其特征在于:步驟1中,提取試劑盒為PrepMan? Ultra Sample Preparation Reagent,進一步包括以下步驟: 1. 1預加熱:打開恒溫混勻儀,設置溫度為99°c ; 1.2在試管上標記樣品名稱,向每個試管中各加入PrepMan Ultra樣品制備試劑 100μ 1 ; 1. 3從長有菌落的瓊脂培養(yǎng)基上挑取單一克隆到上一步加入的樣品制備試劑中,制成 懸液; 1. 4每個試管充分混懸振蕩10到30秒; 1. 5樣品置99°C加熱10分鐘,然后冷卻到室溫; 1. 6樣品置微型離心管中,以12000rpm的轉速離心2分鐘; 1. 7立即轉移上層液50 μ 1到新的已標記的微型離心管中; 1. 8吸取無核酸酶水495 μ 1到微型離心管; 1. 9從第7步所制備溶液轉移5 μ 1到495 μ 1的水中,獲得1:100的DNA樣品溶液; 1. 10渦旋離心管,以混合溶液,1:100的溶液可保存于4°C,期限為1個月,或-20°C,期 限為一年。
      3. 根據權利要求1所述的方法,其特征在于:步驟2中,16S rDNA500基因擴增試劑盒: ABFast MicroSeq? 50016S rDNA PCRKit,進一步包括以下步驟: 2. 1將試劑盒中的三管試劑置室溫下解凍; 2. 2試劑使用前溫和地混懸5秒,分別吸取15 μ 1的PCR Master Mix試劑到96孔快速 PCR板或PCR管上;需加試劑的孔數量或管數為所有樣品數量加上陽性和陰性對照的總數 2. 3取步驟一制得的1:100的樣品DNA15 μ 1,轉移到樣品孔或管中; 2. 4吸取15 μ 1的陽性和陰性對照至相對應的孔或管中; 2. 5將粘膜覆蓋在96孔板上并封嚴,或蓋緊管蓋; 2. 6打開PCR儀,按試劑盒指導設置PCR儀的熱循環(huán)參數; 熱循環(huán)參數:初始階段:95°C維持10秒鐘; 循環(huán)階段:95°C融解變性0秒;64°C退火15秒; 循環(huán)數30個; 最終擴增階段:72°C維持1分鐘; 結束階段:降至4°C保溫; 設置反應體積為30 μ 1 ; 2. 7放置96孔板或管到PCR儀,并運行PCR程序; 完成后,PCR產物可存儲于-15?-25°C,需要時取用,PCR產物在-20°C可保持穩(wěn)定狀 態(tài)至少6個月而不降解。
      4. 根據權利要求1所述的方法,其特征在于:步驟3中,PCR產物純化試劑盒:AxyPrep PCR清潔試劑盒,進一步包括以下步驟: 3. 1使用前,取Buffer W2concentrate濃縮物,按試劑瓶上指定的體積加入無水乙醇, 使用前注意檢查Buffer PCR-A是否出現沉淀,如有沉淀,用65°C溫浴加熱至沉淀完全溶解 并冷卻至室溫后使用; 3. 2向步驟二獲得的PCR產物中,加入3倍體積的Buffer PCR-A(若不足100 μ 1,補足 至100 μ 1),混勻后轉移至DNA制備管,將DNA制備管置于2ml離心管(試劑盒提供)中,以 12000g離心1分鐘,棄濾液; 3. 3將制備管放回2ml離心管中,加700 μ 1的Buffer W2,以12000g離心1分鐘,棄濾 液; 3. 4將制備管放回2ml離心管中,加400 μ 1的Buffer W2,以12000g離心1分鐘,棄濾 液; 3. 5將制備管置于潔凈的1. 5ml離心管(試劑盒提供)中,在制備管的膜中央加25? 30 μ 1的Eluent或去離子水,室溫靜置1分鐘,以12000g離心1分鐘洗脫收集DNA。
      5. 根據權利要求1所述的方法,其特征在于:步驟4中,測序試劑盒:ABMicroSeq? Full Genel6S rDNA Sequencing Kit,進一步包括以下步驟: 4. 1使用前,取出試劑盒中各管試劑在室溫下解凍后,置冰浴中; 4. 2試劑使用前,溫和地混懸5秒,分別吸取13μ 1的PCR Master Mixl的正向測序反 應試劑和反向測序反應試劑到96孔快速PCR板或PCR管上,PCR Master Mix2和3同法操 作,對于每個樣品,一共為6孔或管; 4. 3向上一步加好PCR Master Mix的各管中加入步驟三所獲得的純化產物7μ 1 ; 4. 4吸取相應的陽性對照和陰性對照7 μ 1按樣品孔同法操作; 4. 5將粘膜覆蓋在96孔板上并封嚴,或蓋緊管蓋; 4. 6打開PCR儀,按試劑盒指導設置PCR儀的熱循環(huán)參數; 熱循環(huán)參數:初始階段:96°C維持1分鐘; 循環(huán)階段:96°C融解變性10秒;50°C退火5秒;60°C擴增1分15秒; 循環(huán)數25個; 結束階段:降至4°C保溫; 設置反應體積為20 μ 1 ; 4. 7測序反應完成后,測序反應中過量染料和底物需要清除。
      6. 根據權利要求1所述的方法,其特征在于:步驟5中,測序反應產物純化試劑盒: QIANGENDyeEx? 2. OSpin Kit,進一步包括以下步驟: 5. 1溫和混懸過濾柱內的樹脂,去掉過濾柱的蓋子,將其放置到DyeEx試劑盒提供的收 集管中; 5. 2以3000rpm的轉速離心3分鐘,樹脂凝膠形成斜面,將形成斜面的柱子轉移到到一 個新的微型離心管中; 5. 3緩慢地將每份測序反應產物直接加入斜面柱的凝膠斜面表面中心部位,注意不要 觸碰到凝膠表面; 5. 4以每分鐘3000轉離心3分鐘; 5. 5丟棄斜面柱,洗出液中含有純化后的DNA。
      7. 根據權利要求1所述的方法,其特征在于:步驟6,進一步包括以下步驟: 6. 1移取10微升Hi-Di甲酰胺到96孔測序板,按排好的順序轉移10微升純化后的DNA 樣品到含有Hi-Di甲酰胺的孔中; 6. 2運行電泳。
      8. 根據權利要求1所述的方法,其特征在于:步驟7中,核酸測序儀:Applied Biosystems3130Genetic Analyzer,進一步包括以下步驟: 7. 1基因測試質量分析接受標準: 對于16S rDNA500 -致性序列長度<400bp ; 基線,過濾和裝配顯示綠方框; 樣本分值大于等于35 ; 7. 2將生成的.fsta文件倒入數據庫進行序列比對,最后生成報告; 7· 3 數據庫網址:http://serverl. diagnostic-blast, com/ ; 7. 4對于種水平鑒定要大于等于99. 00% ; 7. 5屬水平鑒定大于等于97. 00%小于99. 00%。
      【文檔編號】C12Q1/04GK104099420SQ201410342600
      【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月18日 優(yōu)先權日:2014年7月18日
      【發(fā)明者】馬衛(wèi)東, 張錦文, 吳國平 申請人:上海羅氏制藥有限公司
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