粘質(zhì)沙雷氏菌NlM280及作為殺蟲劑的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種粘質(zhì)沙雷氏菌NlM280及作為殺蟲劑的應(yīng)用，粘質(zhì)沙雷氏菌NlM280發(fā)酵培養(yǎng)獲得的菌懸液或菌懸液離心后的上清液可應(yīng)用于褐飛虱或二化螟的防治；對(duì)褐飛虱采用注射和飼喂該菌菌懸液或發(fā)酵上清液的結(jié)果表明，其菌懸液注射對(duì)褐飛虱的致死率2天可達(dá)100％，飼喂菌懸液3天致死率為79.8％；該菌株發(fā)酵液的上清液在55℃以下處理均不影響其致病效果，注射發(fā)酵上清液致死率2天時(shí)可達(dá)97.2％，飼喂發(fā)酵上清液效果滯后，6天時(shí)致死率達(dá)84.2％。菌懸液和發(fā)酵上清液噴施水稻后飼喂二化螟，對(duì)二化螟的致死率4天時(shí)可達(dá)80.0％以上。
【專利說明】粘質(zhì)沙雷氏菌NIM280及作為殺蟲劑的應(yīng)用 (一）

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株對(duì)水稻害蟲（褐飛虱和二化螟）具有致病作用的新菌株-粘質(zhì)沙 雷氏菌以及該菌在褐飛虱和二化螟防治方面的應(yīng)用。 (二）

【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是我國(guó)主要糧食作物之一，它是超過一半世界人口的主糧。因此在糧食安全 生產(chǎn)中占有極其重要的地位。然而，水稻也是受蟲害侵襲最為嚴(yán)重的糧食作物之一。全國(guó) 稻區(qū)病蟲害常年發(fā)生面積在1億公頃次以上，每年可造成稻谷損失約60萬噸。因此，有效 地控制水稻害蟲對(duì)水稻增產(chǎn)具有重要意義。
[0003] 褐飛風(fēng)（Nilaparvata 1 μ gens Still ) (Brown planthopper)屬于同翅目飛風(fēng)科， 是我國(guó)和許多亞洲國(guó)家當(dāng)前水稻上的首要害蟲，可以直接取食或?qū)⒉【筒《緜鹘o水稻， 從而給糧食生產(chǎn)帶來巨大損失。褐飛虱具有遠(yuǎn)距離遷飛的能力和很強(qiáng)的適應(yīng)性。目前，控 制褐飛虱致害性的首要方法是化學(xué)殺蟲劑如吡蟲啉、噻嗪酮、仲丁威及異丙威，但隨著吡蟲 啉大范圍高頻次的使用，稻飛虱對(duì)其抗藥性快速提高，各地反映其對(duì)稻飛虱的效果大不如 前。其次是培育抗性水稻品種，但由于褐飛虱的強(qiáng)適應(yīng)性，化學(xué)農(nóng)藥容易導(dǎo)致產(chǎn)生抗藥性種 群和飛虱的再猖獗，抗性水稻的培育和種植雖對(duì)環(huán)境友好但也由于能克服寄主抗性的新褐 飛虱致害性種群出現(xiàn)，導(dǎo)致其危害越來越嚴(yán)重。
[0004] 二化螟（Chilo s μ ppressalis Walker)屬鱗翅目，螟蛾科，是我國(guó)水稻上危害最 為嚴(yán)重的常發(fā)性害蟲之一，在分蘗期受害造成枯鞘、枯心苗，在穗期受害造成蟲傷株和白 穗，一般年份減產(chǎn)3%?5%，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)在3成以上造成的經(jīng)濟(jì)損失約為115億元，已成為 取代稻飛虱和棉鈴蟲，影響我國(guó)國(guó)計(jì)民生的頭號(hào)害蟲（盛承發(fā)等，2003)。二化螟除危害水 稻外，還能危害茭白、玉米、高粱、甘蔗、油菜、蠶豆、麥類以及蘆華、稗、李氏禾等雜草。目前 我國(guó)防治水稻二化螟的主要藥劑為沙蠶毒素類的殺蟲單，殺蟲雙，三唑磷以及進(jìn)口農(nóng)藥氟 蟲晴，銳勁特等化學(xué)農(nóng)藥。純生物農(nóng)藥也得到了逐步推廣。但由于化學(xué)農(nóng)藥長(zhǎng)期大量使用， 二化螟對(duì)其抗藥性逐漸增高，其中對(duì)沙蠶毒素類已增長(zhǎng)了 67倍，已不能單獨(dú)控制二化螟為 害（汪明根等，2004)。進(jìn)口農(nóng)藥氟蟲晴對(duì)二化螟防效較好但存在著防治成本高，對(duì)水生動(dòng) 物不安全等缺點(diǎn)。因此，開發(fā)選用新型高效農(nóng)藥新品種有效防治二化螟顯得十分迫切。
[0005] 通過化學(xué)殺蟲劑控制水稻害蟲，不僅生產(chǎn)成本高，且對(duì)生態(tài)平衡造成破壞，對(duì)人、 畜健康危害嚴(yán)重，農(nóng)藥殘留對(duì)人類生存環(huán)境造成長(zhǎng)期影響，害蟲也產(chǎn)生了抗藥性。因此挖 掘有益微生物資源，開發(fā)新型微生物殺蟲劑將成為農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)的主體。目前主要的微生物殺 蟲劑包括有細(xì)菌殺蟲劑、病毒殺蟲劑和真菌殺蟲劑。細(xì)菌殺蟲劑其作用機(jī)制是胃毒作用， 昆蟲攝入病原細(xì)菌制劑后，通過腸細(xì)胞吸收，進(jìn)入體腔和血液，使之得敗血癥導(dǎo)致全身中毒 死亡。目前篩選的殺蟲細(xì)菌大約有100多種，其中被開發(fā)成產(chǎn)品投入實(shí)際應(yīng)用的主要有4 種，即蘇云金芽孢桿菌（Bacill μ s th μ ringiensis, Bt)、日本金龜子芽孢桿菌（Bacill μ s popilliae)、球形芽抱桿菌（Bacillus sphaeric μ s Meyer and Neide)和緩病芽抱桿菌 (Bacillus Lentimorb μ s)。其中蘇云金芽孢桿菌是商業(yè)開發(fā)最成功的殺蟲劑）。這些殺 蟲劑在生產(chǎn)實(shí)踐中均不同程度的存在局限性如殺蟲譜窄、穩(wěn)定性差，易產(chǎn)生抗藥性等。因此 急需挖掘微生物資源，尋找新的殺蟲譜廣，性能穩(wěn)定的微生物殺蟲劑，并通過基因工程等手 段對(duì)其進(jìn)行有目的的改進(jìn)，從而能更好地發(fā)揮生物防治的綜合效益。
[0006] 粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens)屬于腸桿菌科，革蘭氏陰性菌桿狀菌?？?產(chǎn)生紅色或紫色色素。是一類普遍存在于自然界的浮生小桿菌，可從土壤、水，牛奶、面 包中分離出來，室內(nèi)飼養(yǎng)的昆蟲易于感染該菌。目前已報(bào)道從健康的，死的昆蟲都可分 離出粘質(zhì)沙雷氏菌，該菌可侵染昆蟲6個(gè)目（直翅目，鞘翅目，膜翅目，鱗翅目和雙翅目 等）之多，是室內(nèi)飼養(yǎng)昆蟲最易感染的一種病原菌之一。小量的消化道感染通常不會(huì)造 成昆蟲發(fā)病，但一旦進(jìn)入血淋巴在1-3天之內(nèi)大量繁殖即可造成昆蟲死亡（Sikorowski， 2001)。該菌引起昆蟲致死率受到昆蟲的種類、昆蟲發(fā)育的齡期以及其他環(huán)境因素等的影 響（Steinhaysl958)。粘質(zhì)沙雷氏菌殺蟲的機(jī)制包括其分泌的蛋白酶、脂酶、幾丁質(zhì)酶以 及依賴于脂多糖和鞭毛誘導(dǎo)的寄主免疫細(xì)胞的程序性死亡等（Lysenko, 1976 ;Kaska，et all976;Hines et al，1988;Givskov et all997;Ishii et al，2012)。目前尚無從水稻害 蟲中分離出粘質(zhì)沙雷氏菌以及對(duì)水稻害蟲褐飛虱和二化螟具有致病作用的病原性細(xì)菌資 源的分離和致病機(jī)制的研究報(bào)道。 (三）
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明目的是從水稻褐飛虱中分離出致病細(xì)菌，研究其致病性，為細(xì)菌殺蟲劑的 研究開發(fā)提供了新的菌株來源。
[0008] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0009] 本發(fā)明提供一株新菌株一粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens)N1M280,保藏于 中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 9131，保藏日期為 2014年5月8日，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究 所，郵編100101。
[0010] 本發(fā)明還提供一種所述粘質(zhì)沙雷氏菌N1M280作為殺蟲劑的應(yīng)用。
[0011] 進(jìn)一步，所述粘質(zhì)沙雷氏菌N1M280以發(fā)酵培養(yǎng)獲得的菌懸液或菌懸液離心后的 上清液作為殺蟲劑，優(yōu)選菌體密度為lXl〇8CFU/mL的菌懸液。
[0012] 進(jìn)一步，所述粘質(zhì)沙雷氏菌N1M280作為褐飛虱或二化螟殺蟲劑的應(yīng)用。
[0013] 更進(jìn)一步，粘質(zhì)沙雷氏菌N1M280菌懸液按如下步驟制備：
[0014] (1)斜面培養(yǎng)：將粘質(zhì)沙雷氏菌N1M280接種至LB固體培養(yǎng)基上，28°C恒溫24h，獲 得斜面菌體；LB固體培養(yǎng)基終濃度組成：NaC110g/L、酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L、15g/L 瓊脂，pH7. 2,溶劑為水；
[0015] ⑵種子培養(yǎng)：從斜面菌體挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，28°C恒溫，200rpm振 蕩培養(yǎng)24h，獲得種子液；LB液體培養(yǎng)基終濃度組成：NaC110g/L、酵母提取物5g/L、蛋白胨 10g/L，pH7. 2,溶劑為水；
[0016] (3)發(fā)酵培養(yǎng)：取種子液以體積濃度1 %的接種量接種于LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大 培養(yǎng)，28°C恒溫，200rpm振蕩培養(yǎng)至0D600值為1. 0,獲得發(fā)酵培養(yǎng)液，將發(fā)酵培養(yǎng)液用LB 液體培養(yǎng)基調(diào)整菌體密度制成菌懸液（優(yōu)選菌體密度為lXl〇8CFU/mL)。將菌懸液4°C， 12000rpm離心10min，去菌體，取上清液即為胞外代謝物的發(fā)酵上清液。
[0017] 利用所述菌懸液或發(fā)酵上清液注射3-4齡褐飛虱，2天致死率達(dá)97%以上，利用含 該菌懸液的全純?nèi)斯わ暳巷曃?-4齡褐飛虱，3天死亡率達(dá)79%以上，用含發(fā)酵上清液的全 純?nèi)斯わ暳巷曃?-4齡褐飛虱，6天死亡率達(dá)84%以上。用噴施過菌懸液或發(fā)酵上清液的 水稻葉片飼喂二化螟，4天死亡率達(dá)80%以上。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明提供一株新菌株--粘質(zhì) 沙雷氏菌N1M280,該菌株發(fā)酵培養(yǎng)獲得的菌懸液或菌懸液離心后的上清液可應(yīng)用于褐飛 虱或二化螟的防治；對(duì)褐飛虱采用注射和飼喂該菌菌懸液或發(fā)酵上清液的結(jié)果表明，其菌 懸液注射對(duì)褐飛虱的致死率2天可達(dá)100%，飼喂菌懸液3天致死率為79. 8%。該菌株發(fā) 酵液的上清液在55°C以下處理均不影響其致病效果，注射發(fā)酵上清液致死率2天時(shí)可達(dá) 97. 2 %，飼喂發(fā)酵上清液效果滯后，6天時(shí)致死率達(dá)84. 2 %。菌懸液和發(fā)酵上清液噴施水稻 后飼喂二化螟，對(duì)二化螟的致死率4天時(shí)可達(dá)80. 0%以上。該菌株的分離開拓了抗蟲微生 物資源，為進(jìn)一步抗蟲物質(zhì)的分離鑒定提供了材料，在生產(chǎn)實(shí)踐中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。 (四）

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1為菌株N1M280在LB平板上的生長(zhǎng)情況。
[0020] 圖2為菌株N1M280的16S rDNA序列PCR擴(kuò)增電泳圖，泳道1-5分別為挑取的5 個(gè)單菌落16S rDNA擴(kuò)增的結(jié)果，泳道Μ為Marker 100bp DNA ladder。
[0021] 圖3為菌株N1M280與其他腸桿菌科細(xì)菌16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0022] 圖4為褐飛風(fēng)微量注射位置示意圖（箭頭所示）。
[0023] 圖5為實(shí)施例3中褐飛虱感染粘質(zhì)沙雷氏菌菌株N1M280 (注射菌懸液）后的發(fā)病 癥狀。其中A為超景深顯微鏡放大100倍的照片，B為普通照相機(jī)拍攝。
[0024] 圖6為注射和飼喂N1M280菌懸液（1 X 108CFU/mL)對(duì)褐飛虱致病性柱形圖。
[0025] 圖7為N1M280發(fā)酵上清液不同溫度處理后注射褐飛虱，褐飛虱發(fā)病率柱形圖，CK 為對(duì)照。
[0026] 圖8為注射和飼喂菌株N1M280發(fā)酵液上清液對(duì)褐飛虱致病性柱形圖。
[0027] 圖9為N1M280菌懸液和發(fā)酵上清液對(duì)二化螟的致病性柱形圖，CK為對(duì)照。 (五）

【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0029] 實(shí)施例1、菌株N1M280的篩選、鑒定和保存
[0030] (1)菌株的篩選
[0031] 將中國(guó)水稻研究所富陽實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)的褐飛風(fēng)種群Mudgo的褐飛風(fēng)自然發(fā)病蟲 體（蟲體體色全紅）用體積濃度75%的乙醇水溶液表面消毒5min后，研磨蟲體成粉末， 然后用無菌水進(jìn)行梯度稀釋（具體稀釋梯度為10倍，100倍，1000倍），取1000倍稀釋度 的稀釋液涂板于LB固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)12h，獲得單菌落，挑取紅色單菌落記為菌株 N1M280。
[0032] (2)菌株的鑒定
[0033] 菌株的生理生化特征為：
[0034] 將菌株N1M280涂板于LB固體培養(yǎng)基上，28°C恒溫24h活化，菌株N1M280平板生 長(zhǎng)見圖1。菌株的菌落基本上是凸起，中心不透明，邊緣不規(guī)則，大小為1?2. 5_，均產(chǎn)生 紅色色素。LB固體培養(yǎng)基上37°C?43°C培養(yǎng)，菌株為白色。
[0035] 挑取5個(gè)單菌落N1M280分別接種于3mL的LB液體培養(yǎng)基中，28°C、200rpm培養(yǎng) 12h，取培養(yǎng)0D600值為1. 0左右的新鮮菌液，lOOOrpm離心lOmin，收集濕菌體。按褐飛虱基 因組的提取方法分別提取濕菌體基因組DNA并進(jìn)行16S rRNA的PCR擴(kuò)增（參考：王渭霞， 羅舉，賴?guó)P香，傅強(qiáng).水稻褐飛虱內(nèi)生共生細(xì)菌Arsenophonys的鑒定和系統(tǒng)分析.昆 蟲學(xué)報(bào)，2010,647-654)。？〇?反應(yīng)條件：941：變性41^11，然后進(jìn)入下列循環(huán) ：941：308、 55°C 30s、72°C 30s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢 測(cè)，得到一條1500bp左右的特異性片段（圖2)，測(cè)定該片段序列（PCR產(chǎn)物由上海英俊公 司測(cè)序），結(jié)果表明，測(cè)得菌株N1M280的16S rDNA為1053bp。將測(cè)得的16s rDNA全序 列（SEQ ID Ν0· 1 所不）提交 GenBank(www. ncbi. N1M. nlh. gov)，應(yīng)用其中的 BLAST 軟件和 DNAMAN軟件進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)，菌株N1M280測(cè)得的16S rDNA序列與粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens strain RJT)16s rDNA序列相似性達(dá)99. 0%。因此初步鑒定菌株N1M280為 粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens)。Genbank登陸號(hào)為⑶124498。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示菌 株N1M280與腸桿菌科的粘質(zhì)沙雷氏菌聚類為同一類（圖3)。結(jié)合菌株N1M280的生理生 化特征及16s rDNA序列分析，將菌株N1M280鑒定為粘質(zhì)沙雷氏菌，命名為粘質(zhì)沙雷氏菌 (Serratia marcescens)NlM280〇
[0036] (3)菌株的保藏
[0037] 菌株保藏：將粘質(zhì)沙雷氏菌N1M280接種至LB液體培養(yǎng)基中，28°C、200rpm培養(yǎng) 12h，取菌懸液與質(zhì)量濃度50%的甘油水溶液等體積混合后，-80°C保存。
[0038] LB固體培養(yǎng)基終濃度組成：NaC110g/L、酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L、15g/L瓊 月旨，pH7. 2,溶劑為水。
[0039] LB液體培養(yǎng)基終濃度組成：NaC110g/L、酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L，pH7. 2,溶 劑為水。
[0040] 實(shí)施例2、菌懸液的制備
[0041] (1)斜面培養(yǎng)
[0042] 將粘質(zhì)沙雷氏菌N1M280接種至LB固體培養(yǎng)基上，28°C恒溫24h，獲得斜面菌體。
[0043] (2)種子培養(yǎng)：從斜面菌體挑取單菌落接種于3mL LB液體培養(yǎng)基，28°C恒溫， 200rpm振蕩培養(yǎng)24h，獲得種子液。
[0044] (3)發(fā)酵培養(yǎng)：取500 μ L種子液接種于50mL LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，28°C恒 溫，200rpm振蕩培養(yǎng)8h，測(cè)定菌體0D600值到1. 0時(shí)，獲得發(fā)酵培養(yǎng)液，將發(fā)酵培養(yǎng)液用LB 培養(yǎng)基調(diào)整菌體密度為1 X 108CFU/mL，制成菌懸液。
[0045] 實(shí)施例3 :粘質(zhì)沙雷氏菌N1M280的菌懸液對(duì)褐飛虱的致病性
[0046] (1)、注射法檢測(cè)菌株的致病力：
[0047] 選取3-4齡褐飛風(fēng)若蟲，利用eppendorf顯微注射儀（型號(hào)TransferMan NK2,廠 家上海艾本德公司），每個(gè)褐飛虱注射〇. 1 μ L實(shí)施例2方法制備的菌懸液，注射位置為褐飛 虱胸部中足基部柔軟的地方，見圖4,以注射LB液體培養(yǎng)基為對(duì)照，注射后褐飛虱接種于分 蘗盛期的水稻品種（Taichung Nativel)TNl上，每個(gè)水稻單株用籠罩罩住，每個(gè)籠罩接50 頭注射后的褐飛虱。三次重復(fù)。將籠罩放置于帶水的大水盆中，控制室內(nèi)溫度在25±1°C， 濕度80%左右。24h內(nèi)剔除因注射操作造成的死蟲，記錄活蟲數(shù)，48h統(tǒng)計(jì)褐飛虱死亡率。 褐飛虱病蟲癥狀（褐飛虱通體發(fā)紅）見圖5所示，死亡率見圖6所示。結(jié)果表明菌懸液注 射褐飛虱2天死亡率達(dá)100 %。
[0048] (2)、飼喂法檢測(cè)菌株對(duì)褐飛虱的致病力：
[0049] 選取3-4齡褐飛虱若蟲，在褐飛虱全純?nèi)斯わ暳希ǔ煞忠姳?，參見：Fu Q，Zhang Z T, Hu C, Lai F X, Sun Z X. A Chemically defined diet enables continous rearing of the brown planthopper, Nilaparvata lugens. (Homoptera ：Delphacidae). Appl Entomol Zool，2001，36(1) :111-116)中加入終濃度為IX 108Cf μ/ml的菌懸液（實(shí)施例2方法制 備）。用15cmX 2. 5cm的雙通管作為人工飼養(yǎng)褐飛風(fēng)的器皿。60. 0 μ L人工飼料放在兩端 均有開口的雙通管中，一端用兩層封口膜封口（靠近飼料），另一端用尼龍網(wǎng)封口，在將測(cè) 試的50頭褐飛虱放入后用尼龍網(wǎng)封口。雙通管用潮濕的毛巾包裹起來保濕，有飼料的一頭 對(duì)著光源。飼養(yǎng)環(huán)境條件27. 0±0. 5°C，90. 0%濕度，12-14小時(shí)的光照。24h換飼料一次， 并統(tǒng)計(jì)活蟲數(shù)。結(jié)果見圖6,表明飼喂3天死亡率達(dá)到79. 8%。
[0050] 表1全純?nèi)斯わ暳铣煞?br> [0051]
[0052]

【權(quán)利要求】
1. 粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens)NlM280,保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委 員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 9131，保藏日期為2014年5月8日，保藏地址 為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。
2. -種權(quán)利要求1所述粘質(zhì)沙雷氏菌N1M280作為殺蟲劑的應(yīng)用。
3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述粘質(zhì)沙雷氏菌N1M280以發(fā)酵培養(yǎng)獲得的 菌懸液或菌懸液離心后的上清液作為殺蟲劑。
4. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述菌懸液菌體密度為1 X 108CFU/mL。
5. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述粘質(zhì)沙雷氏菌N1M280作為褐飛虱或二化 螟殺蟲劑的應(yīng)用。
6. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于粘質(zhì)沙雷氏菌N1M280菌懸液按如下步驟制 備： (1) 斜面培養(yǎng)：將粘質(zhì)沙雷氏菌N1M280接種至LB固體培養(yǎng)基上，28°C恒溫24h，獲得斜 面菌體；LB固體培養(yǎng)基終濃度組成：NaC110g/L、酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L、15g/L瓊 月旨，pH7. 2,溶劑為水； (2) 種子培養(yǎng)：從斜面菌體挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，28°C恒溫，200rpm振蕩培 養(yǎng)24h，獲得種子液；LB液體培養(yǎng)基終濃度組成：NaC110g/L、酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/ L，pH7. 2,溶劑為水； ⑶發(fā)酵培養(yǎng)：取種子液以體積濃度1 %的接種量接種于LB液體培養(yǎng)基中，28 °C恒溫， 200rpm振蕩培養(yǎng)至0D600值為1. 0,獲得發(fā)酵培養(yǎng)液，將發(fā)酵培養(yǎng)液用LB液體培養(yǎng)基調(diào)整 菌體密度制成菌懸液。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK104109649SQ201410344394
【公開日】2014年10月22日 申請(qǐng)日期:2014年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月18日
【發(fā)明者】王渭霞, 李凱龍, 陳洋, 賴?guó)P香, 傅強(qiáng) 申請(qǐng)人:中國(guó)水稻研究所