一種檢測肺癌熱點(diǎn)突變基因的組合物及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測肺癌熱點(diǎn)突變基因的組合物，所述組合物包含SEQ?NO：1至SEQ?NO：53的引物序列，還包括SEQ?NO：54至SEQ?NO：63的block序列。本發(fā)明對(duì)肺癌相關(guān)突變的檢測方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、受污染小、操作簡單快速、安全性等優(yōu)點(diǎn)，檢測結(jié)果具有較好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，尤其適合從血漿等體液中檢測肺癌驅(qū)動(dòng)基因的熱點(diǎn)突變，可以實(shí)時(shí)、無創(chuàng)地對(duì)肺癌患者進(jìn)行診斷，復(fù)發(fā)監(jiān)控和療效評(píng)估，具有重要的價(jià)值。
【專利說明】一種檢測肺癌熱點(diǎn)突變基因的組合物及其使用方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因檢測領(lǐng)域，特別是涉及檢測肺癌驅(qū)動(dòng)基因熱點(diǎn)突變的組合物。

【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌是一類高發(fā)病率、高死亡率的惡性腫瘤。近10年來，我國肺癌的發(fā)病率與死 亡率快速增長。肺癌的發(fā)病部位有所不同，根據(jù)各型肺癌的分化程度和形態(tài)特征，目前將肺 癌分為兩大類，即小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，后者包括鱗癌、腺癌和大細(xì)胞癌。
[0003] 研究發(fā)現(xiàn)，肺癌的發(fā)生與EGFR、KRAS、PIK3CA熱點(diǎn)基因的突變有很大的關(guān)系。
[0004] EGFR基因表達(dá)于正常上皮細(xì)胞表面，而在一些腫瘤細(xì)胞中常過表達(dá)，EGFR的過表 達(dá)和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵潤、預(yù)后差有關(guān)。EGFR下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要有兩條：一條是 Ras/Raf/MEK/ERK-MAPK通路，而另一條是PI3K/Akt/mT0R通路。當(dāng)信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞核后，弓丨 起核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄水平的增加，使細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化。EGFR信號(hào)傳導(dǎo)的異常是導(dǎo)致多種腫瘤發(fā)生 的原因。
[0005] K-ras基因位于12號(hào)染色體短臂上，35kb，屬于Ras基因家族的一員。在Ras基 因中，K-Ras對(duì)人類癌癥影響最大，它好像分子開關(guān)：當(dāng)正常時(shí)能控制調(diào)控細(xì)胞生長的路 徑；發(fā)生異常時(shí)，則導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)生長，并阻止細(xì)胞自我毀滅。它參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞，當(dāng) K-ras基因突變時(shí)，該基因永久活化，不能產(chǎn)生正常的ras蛋白，使細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)紊亂， 細(xì)胞增殖失控而癌變。
[0006] PIK3CA基因編碼I類磷脂酰肌醇-3-激酶的plio催化亞單位，正常情況下在肺、 乳腺、胃腸和卵巢等器官中均有表達(dá)，具有調(diào)控體細(xì)胞增殖、分化、存活等許多重要功能。研 究發(fā)現(xiàn)PIK3CA基因產(chǎn)生突變與肺癌等多種癌癥發(fā)病存在相關(guān)性，4%的肺癌患者體內(nèi)基因 PIK3CA存在突變。
[0007] 目前檢測基因突變的方法主要有以下幾種：
[0008] (1)直接測序法。直接測序法是運(yùn)用探針進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序和 TA克隆并再次測序以最終確定突變的堿基位置。該方法比較繁瑣、耗時(shí)長，而且由于自身的 限制導(dǎo)致其靈敏度不高，只能對(duì)含量大于20 %的基因突變進(jìn)行檢測。因此，此法不適合在臨 床中的應(yīng)用與大量的臨床樣本分析。
[0009] (2)變性高效液相色譜法（DHPLC)。該方法的原理是基于發(fā)生錯(cuò)配的雜合雙鏈DNA 與完全匹配的純合雙鏈DNA解鏈特征的差異將他們分離開。通過洗脫峰的不同判斷有無突 變存在。DHPLC可檢測出含有單個(gè)檢測的突變、插入或者缺失的異源雙鏈片段。該法對(duì)已知 和未知的突變位點(diǎn)均可以檢測，敏感性在5%左右，但檢測過程中需要打開反應(yīng)管，容易造 成污染，而且陽性結(jié)果不能確認(rèn)其具體未知，最終還需測序確認(rèn)。
[0010] (3)高分辨率熔解曲線（HRM)。高分辨率熔解曲線是基于核酸的物理性質(zhì)，通過飽 和染料結(jié)合于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，監(jiān)控產(chǎn)物熔解曲線的變化分析基因突變。檢測敏感性在5%左 右，對(duì)于陽性結(jié)果并不能確定其具體位置，最終還需要通過測序加以確認(rèn)。
[0011] (4)探針擴(kuò)增阻滯突變法（ARMS)。利用PCR引物的3'端末位堿基必須與其模 板DNA互補(bǔ)才能有效擴(kuò)增的原理，設(shè)計(jì)針對(duì)突變位點(diǎn)的特異性PCR擴(kuò)增引物，在嚴(yán)格的條件 下，只有在引物3'堿基與模板配對(duì)時(shí)PCR擴(kuò)增反應(yīng)才能正常進(jìn)行，從而檢測出突變。通過 設(shè)計(jì)兩個(gè)5'端引物，一個(gè)與正常DNA互補(bǔ)，一個(gè)與突變DNA互補(bǔ)，對(duì)于純和性突變，分別加 入兩種引物及3'端引物進(jìn)行兩個(gè)平行的PCR，結(jié)合有與突變DNA完全互補(bǔ)的引物才可以延 伸并得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，該檢測方法的靈敏度在1 %左右。
[0012] (5)等位基因特異的Taqman聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（CAST-PCR)。CAST-PCR法采用優(yōu)化 TaqMan探針，通過一段特異設(shè)計(jì)的MGB探針來阻止引物與野生型DNA結(jié)合，選擇性的優(yōu)先擴(kuò) 增突變型DNA，該檢測方法的靈敏度在1?0. 1 %左右。
[0013] 但這些技術(shù)的靈敏度都不高，檢測的特異性差，誤診率高，不能滿足對(duì)肺癌檢測的 需求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明的目的是提供一種肺癌熱點(diǎn)基因無創(chuàng)檢測的組合物，該組合物及其使用方 法特異性強(qiáng)且靈敏度高。
[0015] 為達(dá)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種檢測肺癌熱點(diǎn)突變基因的組合物，所述 組合物包含SEQ N0:1至SEQ N0:53的引物序列，還包括SEQ N0:54至SEQ N0:63的block 序列。
[0016] 其中，所述組合物在用于PCR擴(kuò)增時(shí)的反應(yīng)體系為：1?10XPCR緩沖液、0. 1? ImM dNTPs、0.1 ?luM 正向引物、0.1 ?ΙμΜ反向引物、0.1 ?2μΜ block、0.05?2ng/ μ L 模版 DNA、Eva Green 染料 0· 5 ?2 μ L、0. 01 ?0· 10U/ μ 1 TaqDNA 聚合酶、1 ?5mM 氯 化鎂。
[0017] 其中，所述block序列為PCR擴(kuò)增反應(yīng)中所用，是一段與野生型DNA序列完全匹配 的可偏向性擴(kuò)增突變DNA序列的突變型特異性引物。
[0018] 其中，所述模板DNA濃度可以低至0. 1?lng/ μ L。
[0019] 其中，所述肺癌熱點(diǎn)基因?yàn)镋GFR、KRAS、PIK3CA基因野生型和EGFR、KRAS、PIK3CA 基因突變型。
[0020] 其中，所述 EGFR、KRAS、PIK3CA 基因包含 G719A、G719S、G719C、E746_A750del (1)、 E746_A750del(2)、L747_P753>S、E746_T751>I、E746_T751del、E746_T751>A、E746_S752>A、 E746_S752>V、E746_S752>D、L747_A750>P、L747_T751>Q、L747_E749del、L747_T751del、 L747_S752del、L747_A750>P、L747_P753>Q、L747_T751>S、L747_T751del、L747_T751>P、 T790M、S768I、H773_V774insH、D770_N771insG、V769_D770insASV、L858R、L861Q、G12R、 G12S、G12C、G12A、G12D、G12V、G13D、E542K、E545K、E545D、H1047L、H1047R、H1047。
[0021] 本發(fā)明還提供了一種檢測肺癌熱點(diǎn)突變基因的組合物的使用方法，所述使用方法 的步驟為：
[0022] 第一步：將待測樣品、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品和無模版對(duì)照進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)， 其中所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)以待測DNA為模板，設(shè)計(jì)針對(duì)目的基因突變位點(diǎn)的特異性引物，同時(shí) 加入LNA鎖核酸修飾，通過對(duì)待測DNA樣品中的目的基因進(jìn)行偏向性PCR擴(kuò)增反應(yīng)；
[0023] 第二步：根據(jù)儀器檢測結(jié)果中Ct值和MeltCure的判讀，判斷所述待測樣品中目的 基因的突變情況。
[0024] 其中，通過PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果中擴(kuò)增曲線和熔解曲線主峰來鑒別DNA特定突變。
[0025] 所述根據(jù)Ct值和MeltCure的判讀來判斷待測樣品中目的基因的突變情況，其具 體步驟為：
[0026] 1).運(yùn)行CT值的計(jì)算，無模板對(duì)照應(yīng)無特異擴(kuò)增，或僅引物二聚體導(dǎo)致的熒光信 號(hào)增強(qiáng)；當(dāng)Ct值> 45. 0時(shí)，表明無模板對(duì)照有微弱的擴(kuò)增，對(duì)試驗(yàn)的影響極微，可以繼續(xù)分 析試驗(yàn)情況；
[0027] 2.)運(yùn)行內(nèi)控，一般Ct值〈40.0,可以繼續(xù)分析，如果Ct值彡40.0,則說明樣品 DNA降解嚴(yán)重，不適合試驗(yàn)需要；
[0028] 3).運(yùn)行陽性質(zhì)控品，陽性質(zhì)控的Ct值〈45. 0,熔解曲線最高峰的Tm值在相應(yīng)突 變的范圍內(nèi)，說明試驗(yàn)體系正常，可以繼續(xù)分析試驗(yàn)結(jié)果；
[0029] 4).符合上述條件，運(yùn)行Tm calling程序，通過烙解曲線分析和Ct值，判讀樣本 是否存在突變：運(yùn)行Tm calling程序，若樣本熔解曲線最高峰的Tm值在相應(yīng)突變的范圍 內(nèi)，并且Ct〈45,表明擴(kuò)增區(qū)段發(fā)生突變；若樣本存在以下三種情況之一，則判斷為陰性：a， 無擴(kuò)增；b，有擴(kuò)增，Ct > 45 ;c，有擴(kuò)增，Ct〈45,但是運(yùn)行Tm calling程序，烙解曲線最高峰 的Tm值不在相應(yīng)突變的范圍內(nèi)；
[0030] 5).如果不符合上述第1、3項(xiàng)要求，應(yīng)重做本次實(shí)驗(yàn)；不符合第2項(xiàng)要求，建議重 新從樣本中提取DNA，再次檢測。
[0031] 其中，所述待測DNA樣品為人類基因組DNA，所述陽性質(zhì)控品為含有EGFR、KRAS、 PIK3CA基因突變的混合質(zhì)?；蛘呒兒腺|(zhì)粒，所述陰性質(zhì)控品為不含有EGFR、KRAS、PIK3CA 基因突變的混合質(zhì)?；蛘呒兒腺|(zhì)粒。
[0032] 其中，所述待測DNA為人類正常DNA、細(xì)胞DNA、腫瘤組織基因組DNA、外周血細(xì)胞 DNA、外周血血清或血漿DNA、體液DNA或排泄物細(xì)胞DNA。
[0033] 其中，所述肺癌熱點(diǎn)基因?yàn)镋GFR、KRAS、PIK3CA基因野生型和EGFR、KRAS、PIK3CA 基因突變型。
[0034] 其中，所述 EGFR、KRAS、PIK3CA 基因包含 G719A、G719S、G719C、E746_A750del (1)、 E746_A750del(2)、L747_P753>S、E746_T751>I、E746_T751del、E746_T751>A、E746_S752>A、 E746_S752>V、E746_S752>D、L747_A750>P、L747_T751>Q、L747_E749del、L747_T751del、 L747_S752del、L747_A750>P、L747_P753>Q、L747_T751>S、L747_T751del、L747_T751>P、 T790M、S768I、H773_V774insH、D770_N771insG、V769_D770insASV、L858R、L861Q、G12R、 G12S、G12C、G12A、G12D、G12V、G13D、E542K、E545K、E545D、H1047L、H1047R、H1047。
[0035] 其中，所述樣品的DNA濃度可以低至0. 1?lng/μ L。
[0036] 其中，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的具體過程分為2個(gè)階段：
[0037] (1)擴(kuò)增反應(yīng)，92?97°C預(yù)變性5?15分鐘，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增階段，92?97°C 變性10?20s，50?65°C退火10?30s，70?75°C延伸10?35s，并進(jìn)行35?55個(gè)循 環(huán)；
[0038] (2)做熔解曲線，92?97°C預(yù)變性0· 2?5分鐘，20?55°C退火0· 2?5分鐘， 60?97°C采集熒光，每秒采集熒光10?30次。
[0039] 本發(fā)明所用引物序列如表1和表2所示。
[0040] 表1 EGFR、KRAS、PIK3CA熱點(diǎn)基因檢測引物序列

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測肺癌熱點(diǎn)突變基因的組合物，其特征在于，所述組合物包含SEQ NO :1至 SEQ NO :53的引物序列，還包括SEQ NO :54至SEQ NO :63的block序列。
2. 如權(quán)利要求1所述的檢測肺癌熱點(diǎn)突變基因的組合物，其特征在于，所述組合物在 用于PCR擴(kuò)增時(shí)的反應(yīng)體系為：1?10XPCR緩沖液、0. 1?ImM dNTPs、0. 1?luM正向引 物、0·l?lμM反向引物、0·l?2μMblock、0·05?2ng/μL模版DNA、EvaGreen染料 0· 5 ?2 μ L、0. 01 ?0· 10U/ μ 1 TaqDNA 聚合酶、1 ?5mM 氯化鎂。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的檢測肺癌熱點(diǎn)突變基因的組合物，其特征在于，所述block 序列為PCR擴(kuò)增反應(yīng)中所用，是一段與野生型DNA序列完全匹配的可偏向性擴(kuò)增突變DNA 序列的突變型特異性引物。
4. 如權(quán)利要求1?3所述的檢測肺癌熱點(diǎn)突變基因的組合物的使用方法，其特征在于， 所述使用方法的步驟為： 第一步：將待測樣品、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品和無模版對(duì)照進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；其中， 所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)以待測DNA為模板，設(shè)計(jì)針對(duì)目的基因突變位點(diǎn)的特異性引物，同時(shí)加入 LNA鎖核酸修飾，通過對(duì)待測DNA樣品中的目的基因進(jìn)行偏向性PCR擴(kuò)增反應(yīng)； 第二步：根據(jù)儀器檢測結(jié)果中Ct值和MeltCure的判讀，判斷所述待測樣品中目的基因 的突變情況。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測肺癌熱點(diǎn)突變基因的組合物的使用方法，其特征在于， 通過PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果中擴(kuò)增曲線和熔解曲線主峰來鑒別DNA特定突變。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測肺癌熱點(diǎn)突變基因的組合物的使用方法，其特征在于， 所述根據(jù)Ct值和MeltCure的判讀來判斷待測樣品中目的基因的突變情況，其具體步驟 為： 1).運(yùn)行CT值的計(jì)算，無模板對(duì)照應(yīng)無特異擴(kuò)增，或僅引物二聚體導(dǎo)致的熒光信號(hào)增 強(qiáng)；當(dāng)ct值>45.0時(shí)，表明無模板對(duì)照有微弱的擴(kuò)增，對(duì)試驗(yàn)的影響極微，可以繼續(xù)分析試 驗(yàn)情況；
2.)運(yùn)行內(nèi)控，一般Ct值< 40. 0,可以繼續(xù)分析，如果Ct值彡40. 0,則說明樣品DNA降 解嚴(yán)重，不適合試驗(yàn)需要； 3) .運(yùn)行陽性質(zhì)控品，陽性質(zhì)控的Ct值< 45. 0,熔解曲線最高峰的Tm值在相應(yīng)突變的 范圍內(nèi)，說明試驗(yàn)體系正常，可以繼續(xù)分析試驗(yàn)結(jié)果； 4) .符合上述條件，運(yùn)行Tm calling程序，通過熔解曲線分析和Ct值，判讀樣本是否 存在突變：運(yùn)行Tm calling程序，若樣本熔解曲線最高峰的Tm值在相應(yīng)突變的范圍內(nèi)，并 且Ct < 45,表明擴(kuò)增區(qū)段發(fā)生突變；若樣本存在以下三種情況之一，則判斷為陰性：a，無擴(kuò) 增；b，有擴(kuò)增，Ct > 45 ;c，有擴(kuò)增，Ct < 45,但是運(yùn)行Tm calling程序，熔解曲線最高峰的 Tm值不在相應(yīng)突變的范圍內(nèi)； 5) .如果不符合上述第1、3項(xiàng)要求，應(yīng)重做本次實(shí)驗(yàn)；不符合第2項(xiàng)要求，建議重新從 樣本中提取DNA，再次檢測。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測肺癌熱點(diǎn)突變基因的組合物的使用方法，其特征在于， 所述待測DNA樣品為人類基因組DNA，所述陽性質(zhì)控品為含有EGFR、KRAS、PIK3CA基因突變 的混合質(zhì)?；蛘呒兒腺|(zhì)粒，所述陰性質(zhì)控品為不含有EGFR、KRAS、PIK3CA基因突變的混合 質(zhì)?；蛘呒兒腺|(zhì)粒。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測肺癌熱點(diǎn)突變基因的組合物的使用方法，其特征在于， 所述待測DNA為人類正常DNA、細(xì)胞DNA、腫瘤組織基因組DNA、外周血細(xì)胞DNA、外周血血清 或血漿DNA、體液DNA或排泄物細(xì)胞DNA。
9. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測肺癌熱點(diǎn)突變基因的組合物的使用方法，其特征在于， 所述肺癌熱點(diǎn)基因?yàn)镋GFR、KRAS、PIK3CA基因野生型和EGFR、KRAS、PIK3CA基因突變型。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測肺癌熱點(diǎn)突變基因的組合物的使用方法，其特征在 于，所述 EGFR、KRAS、PIK3CA 基因包含 G719A、G719S、G719C、E746_A750del (1)、E746_ A750del(2)、L747_P753 > S、E746_T751 > I、E746_T751del、E746_T751 > A、E746_S752 > A、E746_S752 > V、E746_S752 > D、L747_A750 > P、L747_T751 > Q、L747_E749del、L747_ T751del、L747_S752del、L747_A750 > P、L747_P753 > Q、L747_T751 > S、L747_T751del、 L747_T751 > P、T790M、S768I、H773_V774insH、D770_N771insG、V769_D770insASV、L858R、 L861Q、G12R、G12S、G12C、G12A、G12D、G12V、G13D、E542K、E545K、E545D、H1047L、H1047R、 H1047。
11. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測肺癌熱點(diǎn)突變基因的組合物的使用方法，其特征在于， 所述樣品的DNA濃度可以低至0. 1?lng/ μ L。
12. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測肺癌熱點(diǎn)突變基因的組合物的使用方法，其特征在于， 所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的具體過程分為2個(gè)階段： (1) 擴(kuò)增反應(yīng)，92?97°C預(yù)變性5?15分鐘，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增階段，92?97°C變 性10?20s，50?65°C退火10?30s，70?75°C延伸10?35s，并進(jìn)行35?55個(gè)循環(huán)； (2) 做熔解曲線，92?97°C預(yù)變性0· 2?5分鐘，20?55°C退火0· 2?5分鐘，60? 97°C采集熒光，每秒采集熒光10?30次。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104152551SQ201410344467
【公開日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月18日
【發(fā)明者】王弢, 李宗飛, 張利清, 張麗, 樂飚, 徐維琛 申請(qǐng)人:普世華康江蘇醫(yī)療技術(shù)有限公司