基于共區(qū)域化觸發(fā)鏈式雜交反應(yīng)的適體傳感器檢測腺苷的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于共區(qū)域化觸發(fā)鏈式雜交反應(yīng)的適體傳感器用于檢測腺苷，由生物素化的適體鏈-1、適體鏈-2、發(fā)卡探針和鏈霉親和素修飾的磁性納米球組成，本發(fā)明的適體傳感器用于檢測腺苷，檢測方法為：(1)鏈酶親和素化修飾磁球的活化；(2)生物素化適體鏈-1的固定；(3)腺苷誘導的雙適體的共區(qū)域化；(4)共區(qū)域化觸發(fā)的鏈式雜交反應(yīng)；(5)加入染料SYBR?Green?I和熒光檢測；(6)計算：根據(jù)所測得的熒光值計算含有腺苷的待檢測物中腺苷的濃度。本發(fā)明的適體傳感器，通過共區(qū)域化誘導的鏈式雜交反應(yīng)，降低了傳統(tǒng)鏈式雜交反應(yīng)的非特異性反應(yīng)，具有檢測靈敏度高、樣品使用量小、無需酶放大等優(yōu)勢，可實現(xiàn)對低濃度腺苷的分析檢測。
【專利說明】基于共區(qū)域化觸發(fā)鏈式雜交反應(yīng)的適體傳感器檢測腺苷

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及構(gòu)建一種基于共區(qū)域化觸發(fā)鏈式雜交反應(yīng)的腺苷適體傳感器檢測腺 苷。

【背景技術(shù)】
[0002] 腺苷是一種重要的生物藥物小分子，參與機體多種生命活動的調(diào)節(jié)，具有重要的 生理和藥理作用，如舒張血管、收縮平滑肌以及對神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。此外， 生物樣本中腺苷的檢測可用于疾病診斷、病程的監(jiān)測以及癌癥的早期診斷。因此對腺苷的 定量檢測，尤其是生物樣本中腺苷的檢測在臨床研究、疾病的診斷和預防以及癌癥的早期 診斷等方面有重要的生物學意義。
[0003] 雖然大量的腺苷適體傳感體系已成功實現(xiàn)了腺苷的分析檢測，但是能夠直接用于 生物樣本中腺苷檢測的適體傳感器卻很少，這主要是以下兩個原因造成的：1、生物樣本中 復雜體系的干擾，復雜的環(huán)境會對檢測體系尤其含有蛋白酶的體系造成較大的影響；2、方 法靈敏度不夠，不能達到生物樣本的檢測標準，正常人尿液中腺苷的含量是2 μ mol Γ1? 7 μ mol L'而生物樣本中腺苷的檢測在疾病的診斷和預防以及臨床研究方面具有較高的 臨床應(yīng)用意義，例如生理狀態(tài)下腺苷含量的波動可用于心、腦生理功能的研究，尿液中腺苷 含量的升高可用于腫瘤的早期診斷。因此，建立一個高靈敏度、高選擇性，能實現(xiàn)生物樣本 中腺苷直接檢測的傳感體系是十分必要的。
[0004] 目前，為了實現(xiàn)高靈敏度的分析檢測，多種信號放大技術(shù)如滾環(huán)擴增、外切酶輔助 的信號擴增、核酸酶輔助的信號擴增以及基于聚合切刻酶等已被廣泛用于腺苷的分析中。 這些方法雖然能大大提高腺苷的檢測靈敏度，但是均需酶的輔助作用。而蛋白酶和核酸酶 的一些固有缺點（如易變性失活、高成本、需要特別的識別位點等），大大限制了這些放大 技術(shù)的廣泛應(yīng)用。近年來，粘性末端介導的鏈置換反應(yīng)由于原理簡單（堿基配對的基本原 理）、無酶、反應(yīng)快速和無需特別設(shè)計的優(yōu)勢而得以快速發(fā)展，基于發(fā)卡結(jié)構(gòu)自組裝的HCR 和CHA反應(yīng)是其中最為典型的兩類方法。然而，非特異性反應(yīng)的發(fā)生常常會造成較大的背 景信號，影響方法的靈敏度，因此我們構(gòu)建了一種基于共區(qū)域化觸發(fā)的鏈式雜交反應(yīng)的適 體傳感器，可以避免非特異性反應(yīng)的發(fā)生，實現(xiàn)腺苷的高靈敏檢測，同時實現(xiàn)生物樣本中腺 苷的直接分析檢測。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對現(xiàn)有腺苷分析技術(shù)不能實現(xiàn)生物樣本中腺苷的直接檢測的問題，本發(fā)明的目 的是提供一種基于共區(qū)域化觸發(fā)鏈式雜交反應(yīng)的適體傳感器，將該適體傳感器用于腺苷的 分析檢測，具有靈敏度高、選擇性強和重現(xiàn)性好等優(yōu)點，并且可以直接用于人尿液中腺苷的 含量測定，無需任何前處理過程。該適體傳感器的工作原理是：首先，通過鏈酶親和素和生 物素之間的特異性作用，將生物素化的適體鏈-1 (Bio-Apt-Ι)固定在磁球表面；然后加入 腺苷和適體鏈-2 (Apt-2)，通過腺苷的"粘合"作用，使得Bio-Apt-Ι和Apt-2結(jié)合在一起， 從而使得Bio-Apt-1連接的粘性末端區(qū)域和Apt-2連接的鏈置換區(qū)域發(fā)生共區(qū)域化，形成 完整的引物鏈，可以觸發(fā)發(fā)卡結(jié)構(gòu)H1和H2發(fā)生鏈式雜交反應(yīng)（HCR);反應(yīng)完成后，加入內(nèi) 插染料SYBR Green I，產(chǎn)生熒光信號的輸出。
[0006] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0007] -種基于共區(qū)域化觸發(fā)鏈式雜交反應(yīng)的適體傳感器，由生物素化的適體鏈-1、 適體鏈-2、發(fā)卡探針和鏈霉親和素修飾的磁性納米球組成，其中，所述生物素化的適體 鏈-1(Bio-Apt-1)為：
[0008] 5' -biotin-TTTTTTTTTTTT GTG CAA GTA CCA TT TAG ACC ACC TGG GGG AGT AT-3'（核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示）；
[0009] 所述適體鏈-2 (Apt-2)的序列為：
[0010] Apt-2 :5, -ΑΤΑ CTC CCC C AGGTGG TGT CTA GGA TTC GGC GTG-3，，（如 SEQ ID NO. 2所示）；
[0011] (注：Apt-2中斜體加粗序列是與Apt-1雜交的堿基）；
[0012] 所述發(fā)卡探針由發(fā)卡探針H1和發(fā)卡探針H2組成，其中，發(fā)卡探針H1的核苷酸序 列為：
[0013] 5'-TGT CTA GGA TTC GGC GTG GGT TM CAC GCC GAA TCC TAG ACA TGG TAC TTG CAC-3'（如 SEQ ID NO. 3 所示）；
[0014] 發(fā)卡探針H2的核苷酸序列為：
[0015] δ^ΤΤΑ ACC CAC GCC GAA TCC TAG ACA GTG CAA GTA CCA TGT CTA GGA TTC GGC GTG-3'（如 SEQ ID NO. 4 所示）。
[0016] 所述鏈霉親和素修飾的磁性納米球（鏈酶親和素化修飾的磁性微球），下述簡 稱磁球，為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)產(chǎn)品，本發(fā)明所用的磁球購自Bangs Laboratories, Carmel，IN，USA，lmL 包裝，密度為 1.343g mL1，直徑為 350nm。
[0017] 所述基于共區(qū)域化觸發(fā)鏈式雜交反應(yīng)的適體傳感器，用于檢測腺苷的過程如下：
[0018] (1)鏈酶親和素化修飾磁球的活化：為了防止磁球的聚集，磁球儲備液中含有大 量的表面活性劑，在使用前，需要先將這些表面活性劑洗去，以活化磁球的功能，活化方式 為：
[0019] ①在離心管中加入200 μ L的TTL緩沖液和1 μ L鏈霉親和素修飾的磁性納米球， 經(jīng)充分震蕩洗滌后（震蕩約5min)，將離心管置于磁球分離架上靜置7min，移除溶液部分 (用移液槍小心吸出溶液，棄去）；
[0020] ②重復上述①的操作5次，最后得到活化的鏈酶親和素化修飾的磁性微球 (1 μ L)，待用；
[0021] 所述TTL緩沖液的組成為：由Tris-HCl、Tween20、LiCl和水組成，其中，各組分的 濃度為：1〇〇臟〇1 L-1Tris-HCl ;0· 1% Tween20 ;lmol L-1LiCl ;ρΗ8· 0 ;
[0022] (2)生物素化適體鏈-1 (Bio-Apt-1)的固定：向上述活化好的1 μ L活化的鏈酶親 和素化修飾的磁性微球中加入50 μ L的濃度為2. 0 X 10 _6mol Γ1的Bio-Apt-Ι，充分震蕩混 勻后，放于37°C恒溫箱中孵育2h ;反應(yīng)完后，放于磁球分離架上，靜置7min，移除溶液部分 (用移液槍小心吸出溶液，棄去）；然后用200 μ L的Tris-HCl雜交緩沖液清洗兩次，最后獲 得表面固定生物素化Apt-Ι的磁球；
[0023] 所述Tris-HCl雜交緩沖液的組成為：由Tris-HCl、NaCl、MgCldP水組成，其中，各 組分的濃度為：10mmol L Iris-HCl，ρΗ7· 4 ;300mmol L WaCl ；1mmo1 L ^gCl^。
[0024] 本發(fā)明的基于共區(qū)域化觸發(fā)鏈式雜交反應(yīng)的適體傳感器，可以用于腺苷的分析檢 測，具體應(yīng)用時，應(yīng)用方法如下：
[0025] (3)腺苷誘導的雙適體的共區(qū)域化：向上述步驟（2)制備得到的表面固定生物素 化Apt-Ι的磁球中加入40 μ L的濃度為1. 0X 10 _6mol Γ1的Apt-2和10 μ L的含有腺苷的 待檢測物，充分震蕩混勻后，放于37°C恒溫箱中孵育2h ;反應(yīng)完后，放于磁球分離架上，靜 置7min，移除溶液部分（用移液槍小心吸出溶液，棄去）；然后用200 μ L的Tris-HCl雜交 緩沖液清洗兩次，最后獲得腺苷誘導共區(qū)域化的Apt-l/Apt-2復合物；
[0026] 進一步地，所述含有腺苷的待檢測物為人的尿液；
[0027] (4)共區(qū)域化觸發(fā)的鏈式雜交反應(yīng)：在上述腺苷誘導共區(qū)域化的Apt-l/Apt-2復 合物中加入50yL的發(fā)卡探針H1、H2的混合物（優(yōu)選的，所述混合物中，發(fā)卡探針H1和H2 的濃度相同，均為3. OX l(T6m〇l Γ1)。充分震蕩混勻后，放于37°C恒溫箱中孵育3h ;反應(yīng) 完后，放于磁球分離架上，靜置7min，移除溶液部分（用移液槍小心吸出溶液，棄去）；然后 用200 μ L的PBS緩沖液清洗兩次（以除去未反應(yīng)的發(fā)卡探針），最后獲得表面固定有長的 DNA雙鏈的磁球；
[0028] 進一步地，發(fā)卡探針Η1和Η2在使用之前進行退火，目的是保證發(fā)卡的穩(wěn)定性；退 火的步驟是：在90°C加熱5min，然后緩慢冷卻到室溫；
[0029] (5)加入染料SYBR Green I和熒光檢測：用PBS緩沖液將SYBR Green I稀釋成 濃度為2. 0X10_6mol Γ1，然后加入到上述得到的表面固定有長的DNA雙鏈的磁球中，室溫 靜置lOmin，然后進行熒光檢測，得熒光值；
[0030] 進一步地，所述熒光光度計的基本設(shè)置為：激發(fā)波長為477nm，掃描范圍為500? 600nm，激發(fā)狹縫寬度2. 5nm，發(fā)射狹縫寬度2. 5nm，PMT電壓700V ;
[0031] (6)計算：根據(jù)上述所測得的熒光值計算含有腺苷的待檢測物中腺苷的濃度；
[0032] 進一步地，利用下述線性方程計算得到腺苷的濃度：
[0033] Δ F = 14. 55+1769. 72 X 104C, (r = 0. 998)；
[0034] 其中，AF表示熒光凈信號值，C表示腺苷的濃度，單位為mol Γ1 ;該線性方程的線 性范圍是 1. OX l〇_6mol Γ1 ?1. 2Χ 10_4mol Γ1 之間。
[0035] 本發(fā)明的基于共區(qū)域化觸發(fā)鏈式雜交反應(yīng)的適體傳感器的設(shè)計思路以及用于腺 苷的檢測的原理為：雜交鏈反應(yīng)（HCR)是一組利用粘性末端介導的鏈遷移反應(yīng)來實現(xiàn)信號 放大的方法，整個反應(yīng)是由堿基對形成是產(chǎn)生的自由能來驅(qū)動的。HCR反應(yīng)是在等溫、無酶 的條件下進行的。與其它以酶為基礎(chǔ)構(gòu)建的放大方法相比，HCR更穩(wěn)定，更價廉。但是，HCR 反應(yīng)中的非特異性反應(yīng)是造成其背景信號的主要原因，也是限制其靈敏度的主要原因。因 此，本發(fā)明將粘性末端區(qū)域與鏈遷移區(qū)域分開，利用目標物誘導兩個區(qū)域發(fā)生共區(qū)域化，創(chuàng) 造性的解決了傳統(tǒng)HCR這種非特異性反應(yīng)問題，構(gòu)建了一種全新的、高靈敏的腺苷分析檢 測方法。
[0036] 共區(qū)域化的發(fā)生會催化發(fā)卡探針H1和H2進行自組裝，形成一條長的雙螺旋聚合 物，SYBRGreen I是本設(shè)計中使用到的熒光信號標記分子，這種分子的特性是，在溶液中或 是遇到單鏈DNA時幾乎不發(fā)熒光，而當插入到雙鏈DNA的股溝中之后，會產(chǎn)生明顯增強的熒 光信號，從而實現(xiàn)熒光檢測。
[0037] 本發(fā)明具有如下有益效果：
[0038] (1)本發(fā)明的適體傳感器具有檢測靈敏度高、樣品使用量小、無需酶放大等優(yōu)勢， 可實現(xiàn)對低濃度腺苷的分析檢測。
[0039] (2)通過共區(qū)域化誘導的鏈式雜交反應(yīng)，降低了傳統(tǒng)鏈式雜交反應(yīng)的非特異性反 應(yīng)，提1? 了實驗的靈敏度。
[0040] (3)通過磁性微球的分離作用，消除了復雜基質(zhì)的干擾，可用于生物樣本中腺苷的 分析檢測，無需任何前處理過程。
[0041] (4)本發(fā)明的適體傳感器用于腺苷定量檢測的檢測方法具有較好的重現(xiàn)性和精密 度，對腺苷具有良好的選擇性，可實現(xiàn)在人尿樣中對腺苷的檢測。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0042] 圖1 :生物素化適體鏈-1 (Bio-Apt-Ι)的固定示意簡圖。
[0043] 圖2 :腺苷誘導的共區(qū)域化示意簡圖。
[0044] 圖3 :共區(qū)域化觸發(fā)的HCR反應(yīng)示意簡圖。
[0045] 圖4 :插入SYBR Green I產(chǎn)生突光不意簡圖。
[0046] 圖5 :腺苷誘導共區(qū)域化的適體傳感器的工作原理示意圖。
[0047] 圖6 :腺苷誘導共區(qū)域化的適體傳感器的熒光圖譜，其中，1 :Bi〇-Apt-l+Apt_2 ;2 : Bi〇-Apt-l+Apt-2+Adenosine ;3 :Bi〇-Apt-l+Apt_2+Adenosine+Hl+H2。F:體系突光強度； Wavelength:掃描的體系發(fā)射波長；
[0048] 圖7 :腺苷濃度對體系熒光強度的影響示意圖。
[0049] 圖8 : AF與腺苷濃度的線性關(guān)系示意圖。
[0050] 圖9 :腺苷與其類似物的選擇性實驗結(jié)果示意圖。
[0051] 圖10 :尿樣中腺苷濃度對體系熒光強度的影響示意圖（曲線）。
[0052] 圖11 :尿樣中腺苷濃度對體系熒光強度的影響示意圖（線性）。
[0053] 圖12 :尿樣中的選擇性考察示意圖。

【具體實施方式】
[0054] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
[0055] 下述實施例中，未詳盡描述的試劑、方法均為所屬領(lǐng)域的常規(guī)試劑、方法。
[0056] 實施例1構(gòu)建基于共區(qū)域化觸發(fā)鏈式雜交反應(yīng)的適體傳感器，進行腺苷的檢測 [0057](一）儀器和試劑
[0058] (1)儀器裝置
[0059] 熒光分光光度計（F-2500型號，日本Hitachi);電熱恒穩(wěn)培養(yǎng)箱（DNP-9052， 上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；干式恒溫器（K30,杭州奧盛儀器有限公司）；旋渦混合器 (VDRTEX-5,海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；天平（H-101，上海康樂光電儀器有限公 司）；電子天平（ME型號，梅特勒-托利多儀器有限公司）。
[0060] (2)試劑
[0061] 本實驗所使用的核酸探針均由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成和提純，如下 所示：
[0062] 生物素化的適體鏈-1 (Bio-Apt-1)為：
[0063] 5' -biotin-TTTTTTTTTTTT GTG CAA GTA CCA TT TAG ACC ACC TGG GGG AGT AT-3'（核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示）；
[0064] 適體鏈-2 (Apt-2)序列為：
[0065] Apt-2 :5, -ΑΤΑ CTC CCC C AGGTGG TGT CTA GGA TTC GGC GTG-3，，（如 SEQ ID NO. 2所示）；
[0066] (注：Apt-2中斜體加粗序列是與Apt-1雜交的堿基）；
[0067] 發(fā)卡探針由發(fā)卡探針HI和發(fā)卡探針H2組成，其中，發(fā)卡探針HI的核苷酸序列為：
[0068] 5'-TGT CTA GGA TTC GGC GTG GGT TM CAC GCC GAA TCC TAG ACA TGG TAC TTG CAC-3'（如 SEQ ID NO. 3 所示）；
[0069] 發(fā)卡探針H2的核苷酸序列為：
[0070] δ^ΤΤΑ ACC CAC GCC GAA TCC TAG ACA GTG CAA GTA CCA TGT CTA GGA TTC GGC GTG-3'（如 SEQ ID NO. 4 所示）。
[0071] DNA粉末先經(jīng)高速離心（8000rpm，6min)，然后用適當體積的超純水溶解混勻，配 成濃度為100 μ Μ的儲備液，最后分裝成10 μ L的小體積置于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0072] 腺苷（Adenosine, ^ 99 % )購于 Sigma-Aldrich(上海，中國）。 燦11〇^-]^1:117]^68〇口〇印115^;[11]^)購于？1'〇111:丨61'。40(%丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺，過硫酰 胺（APS)，四甲基乙二胺（TEMED)，溴化乙錠（EB)均購于上海生物工程有限公司（上海，中 國）。6X上樣緩沖液和DNA marker購于大連寶生物有限公司（大連，中國）。SYBR Green I購于百泰克生物技術(shù)有限公司（北京，中國）。人血清和人尿樣均取自于山東大學校醫(yī)院， 肝癌病人尿樣取自于山東省省立醫(yī)院。
[0073] 試驗中所有試劑均為分析純，所用水均由Millipore Milli Q water (18. 25ΜΩ . cm)制備。10XTAE/Mg(0.4mol I^TrisJJmol Γ1 醋酸，2.0Xl(T2mol I^EDTAJNa， 0.125111011^(0130)0)21^.440)0
[0074] TTL 緩沖液：100mmol I^Tris-HCl，?！?1% Tween20, lmol L-1LiCl，ρΗ8· 0。
[0075] PBS 緩沖液：0· 15mol Γ1 的 NaCl，7. 6 X l(T3mol Γ1 的 Na2HP04, 2. 4 X l(T3mol Γ1 的 NaH2P04, pH = 7. 4。
[0076] Tris-HCl 雜交緩沖液：10mmol PTris-HCl，pH7. 4, 300mmol L_1NaCl, lmmol L-1MgCl2。
[0077] 鏈霉親和素修飾的磁性納米球（簡稱磁球，lmL包裝，密度為1. 343g πι?Λ直徑為 350nm, Bangs Laboratories, Carmel, IN, USA) 〇
[0078] lmL的鏈酶親和素化的磁球按照每份100 μ L的體積進行分裝，放在-4°C冰箱保存 備用。
[0079] (二）實驗步驟
[0080] (1)鏈酶親和素化修飾磁球的活化：為了防止磁球的聚集，磁球儲備液中含有大 量的表面活性劑，在使用前，需要先將這些表面活性劑洗去，以活化磁球的功能?；罨绞?為：
[0081] ①在離心管中加入200 μ L的TTL緩沖液和1 μ L鏈霉親和素修飾的磁性納米球， 經(jīng)充分震蕩洗滌后（震蕩5min)，將離心管置于磁球分離架上靜置7min，移除溶液部分（用 移液槍小心吸出溶液，棄去）；
[0082] ②重復上述①的操作5次，最后得到活化的鏈酶親和素化修飾的磁性微球 (1 μ L)，待用。
[0083] (2)生物素化適體鏈-1 (Bio-Apt-Ι)的固定（示意簡圖如圖1所示）：向上述活化 好的1 μ L活化的鏈酶親和素化修飾的磁性微球中加入50 μ L的濃度為2. 0X 10_6mol Γ1 的Bio-Apt-1，充分震蕩混勻后，放于37°C恒溫箱中孵育2h ;反應(yīng)完后，放于磁球分離架上， 靜置7min，移除溶液部分（用移液槍小心吸出溶液，棄去）；然后用200 μ L的Tris-HCl雜 交緩沖液清洗兩次，最后獲得表面固定生物素化Apt-Ι的磁球。
[0084] (3)腺苷誘導的雙適體的共區(qū)域化（示意簡圖如圖2所示）：向上述步驟⑵制備 得到的表面固定生物素化Apt-Ι的磁球中加入40 μ L的濃度為1. 0Xl(T6mol Γ1的Apt-2 和10yL不同濃度的腺苷（濃度 5mol ?Λ5·0Χ1(Γ5πιο1 ?Λ?·0Χ1(Γ4πιο1 ?Λ?·2Χ1(Γ4πιο1 ΙΛ共7組），充分震蕩混勻后， 放于37°C恒溫箱中孵育2h ;反應(yīng)完后，放于磁球分離架上，靜置7min，移除溶液部分（用移 液槍小心吸出溶液，棄去）；然后用200 μ L的Tris-HCl雜交緩沖液清洗兩次，最后獲得腺 苷誘導共區(qū)域化的Apt-l/Apt-2復合物；
[0085] (4)共區(qū)域化觸發(fā)的鏈式雜交反應(yīng)（HCR反應(yīng)）（示意簡圖如圖3所示）：在上述腺 苷誘導共區(qū)域化的Apt-l/Apt-2復合物中加入發(fā)卡探針HI、H2的混合物（混合物中，發(fā)卡 探針H1和H2的濃度相同，均為3.0X10_ 6mol Γ1 ;)，總體積為50yL，充分震蕩混勻后，放 于37°C恒溫箱中孵育3h ;反應(yīng)完后，放于磁球分離架上，靜置7min，移除溶液部分（用移液 槍小心吸出溶液，棄去）；然后用200μ L的PBS緩沖液清洗兩次（以除去未反應(yīng)的發(fā)卡探 針），最后獲得表面固定有長的DNA雙鏈的磁球；
[0086] 發(fā)卡探針Η1和Η2在使用之前進行退火，目的是保證發(fā)卡的穩(wěn)定性；退火的步驟 是：在90°C加熱5min，然后緩慢冷卻到室溫；
[0087] (5)加入染料SYBR Green I和熒光檢測（示意簡圖如圖4所示）：用PBS緩沖液 將SYBRGreen I稀釋成濃度為2.0Xl(T6m〇l Γ1，然后加入到上述得到的表面固定有長的 DNA雙鏈的磁球中，室溫靜置lOmin，然后進行熒光檢測，得熒光值；
[0088] 同時，設(shè)置兩組對照，也加入染料SYBR Green I，進行熒光檢測，一組對照為沒有 添加腺苷的Bi〇-Apt-l+Apt-2(即步驟3中，只添加 Apt-2、不添加腺苷而得到的復合物，直 接加入染料進行突光檢測），另一組對照為Bi〇-Apt-l+Apt-2+Adenosine(即步驟3中的腺 苷誘導共區(qū)域化的Apt-l/Apt-2復合物，直接加入染料進行熒光檢測）；
[0089] 熒光光度計的基本設(shè)置為：激發(fā)波長為477nm，掃描范圍為500?600nm，激發(fā)狹縫 寬度2. 5nm，發(fā)射狹縫寬度2. 5nm，PMT電壓700V。
[0090] (三）結(jié)果與討論
[0091] (1)腺苷誘導共區(qū)域化的適體傳感器的工作原理
[0092] 基于腺苷誘導共區(qū)域化觸發(fā)HCR的適體傳感器工作原理如圖5所示：首先，通過鏈 酶親和素和生物素之間的特異性作用，將生物素化的適體鏈1 (Apt-ι)固定在磁球表面；然 后加入腺苷和適體鏈2 (Apt-2)，通過腺苷的"粘合"作用，使得Apt-Ι和Apt-2結(jié)合在一起， 從而使得Apt-Ι連接的粘性末端區(qū)域和Apt-2連接的鏈置換區(qū)域發(fā)生共區(qū)域化，形成完整 的引物鏈，可以進一步觸發(fā)發(fā)卡結(jié)構(gòu)HI和H2發(fā)生HCR反應(yīng)；反應(yīng)完后，加入內(nèi)插染料SYBR GreenI，產(chǎn)生突光信號。
[0093] (2)熒光實驗驗證
[0094] 圖 6 的實驗條件：CAdenQSine = 1. OX 10_4m〇l ΙΛ(：Αρη = 2. OX 10_6m〇l L_l，CApt_2 = 1. 0 X l(T6mol ΙΛ CH1 = 3. 0 X l(T6mol ΙΛ CH2 = 3. 0 X l(T6mol ΙΛ CSYBK Green ! = 2. 0 X 1(Γ 6mol L-1，反應(yīng)時間HCR2h，反應(yīng)溫度37°C。
[0095] 圖6為體系的突光光譜圖，從圖中可以看出，體系中沒有腺苷時，Bio-Apt-l+Apt-2 的熒光強度很低；加入腺苷后，Bio-Apt-l+Apt-2的熒光強度有所增加，說明腺苷可以誘導 Apt-Ι和Apt-2發(fā)生共區(qū)域化，與電泳結(jié)果是一致的；在腺苷、Bio-Apt-Ι和Apt-2體系中加 入H1和H2后，可以檢測到很強的熒光信號，說明Apt-Ι和Apt-2的共區(qū)域化可以觸發(fā)HCR 反應(yīng)，生成較長的DNA雙鏈。該實驗現(xiàn)象說明腺苷可以成功的誘導雙適體發(fā)生共區(qū)域化，從 而進一步觸發(fā)HCR反應(yīng)。
[0096] (3)系統(tǒng)條件優(yōu)化
[0097] 為了獲得較好的傳感性能，對可能造成影響的實驗條件進行了逐個優(yōu)化，主要包 括Apt-Ι的濃度、Apt-2的濃度、發(fā)卡H1和H2的濃度、HCR的反應(yīng)時間和染料的濃度。最終 選擇的實驗條件為：Apt-Ι的濃度為2. OX 10_6mol ΙΛ Apt-2的濃度為1. OX 10_6mol ΙΛ 發(fā)卡 Η1、Η2 的濃度為 3.0Xl(T6mol L'SYBRGreen I 的濃度為 2.0Xl(T6mol L'HCR 的 反應(yīng)時間為2h。
[0098] (4)腺苷的分析檢測
[0099] 在最優(yōu)實驗條件（上述確定的）下，該體系對腺苷濃度的響應(yīng)情況如圖7所示， 隨著腺苷濃度的增加，體系的凈熒光信號逐漸增大。所建立的適體傳感系統(tǒng)的線性范圍為 1.0Xl(T6mol Γ1 ?1.2Xl(T4mol Γ1，線性回歸方程為八？= 14.55+1769.72父104(：(如圖 8所示），相關(guān)系數(shù)1'為0.998，方法對腺苷的檢測限為2.0\10^ 111〇1171。證明了本發(fā)明所 構(gòu)建的無酶、免標記和雙重信號擴增的適體傳感器可以成功用于腺苷的靈敏檢測。
[0100] 圖 7 的實驗條件：Caph = 2. OX l(T6mol I71，CApt_2 = 1. OX l(T6mol I71，CH1 = 3. OX l(T6mol ΙΛ CH2 = 3. OX l(T6mol ΙΛ CSYBK Green ! = 2. OX l(T6mol ΙΛ HCR 反應(yīng)時間 2h，反應(yīng)溫度37°C。
[0101] 圖 8 的實驗條件：(3Αρη = 2. OX l(T6mol I71，CApt_2 = 1. OX l(T6mol I71，CH1 = 3. OX l(T6mol ΙΛ CH2 = 3. OX l(T6mol ΙΛ CSYBK Green ! = 2. OX l(T6mol ΙΛ HCR 反應(yīng)時間 211，溫度37°〇。
[0102] (5)建立適體傳感器的方法學驗證
[0103] 為了驗證基于發(fā)卡結(jié)構(gòu)自組裝的適體傳感方法的精密度，本發(fā)明進行了日內(nèi)實驗 和日間實驗的相對標準偏差（RSD)的考察（N = 3)。最優(yōu)實驗條件下，選擇1. OX l(T5m〇l L'S.OXlO - ^iol L-1和1.0X10_4mol L-1三個濃度的三個樣本進行實驗。實驗結(jié)果表明三 個樣本的RSD分別為1. 7%、1. 2%和0. 7%，如表1所示。同樣在上述三個濃度下，連續(xù)三 次實驗之間的RSD分別為3. 9%、2. 9%和1. 9% (表2所示），說明該適體傳感方法具有良 好的精密度。
[0104] 表1日內(nèi)精密度考察
[0105]

【權(quán)利要求】
1. 一種基于共區(qū)域化觸發(fā)鏈式雜交反應(yīng)的適體傳感器檢測腺苷，其特征在于：由生物 素化的適體鏈-1、適體鏈-2、發(fā)卡探針和鏈霉親和素修飾的磁性納米球組成，其中，所述生 物素化的適體鏈-1為： 5，-biotin-TTTTTTTTTTTT GTG CAA GTA CCA TT TAG ACC ACC TGG GGG AGT AT-3，，核 苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示； 所述適體鏈-2的序列為： Apt-2 :5，-ATA CTC CCC C AGGTGG TGT CTA GGA TTC GGC GTG-3，，如 SEQ ID NO. 2 所 示； 所述發(fā)卡探針由發(fā)卡探針HI和發(fā)卡探針H2組成，其中，發(fā)卡探針HI的核苷酸序列為： 5' -TGT CTA GGA TTC GGC GTG GGT TAA CAC GCC GAA TCC TAG ACA TGG TAC TTG CAC-3'，如 SEQ ID NO. 3 所示； 發(fā)卡探針H2的核苷酸序列為： 5' -TTA ACC CAC GCC GAA TCC TAG ACA GTG CAA GTA CCA TGT CTA GGA TTC GGC GTG-3'，如 SEQ ID NO. 4 所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于共區(qū)域化觸發(fā)鏈式雜交反應(yīng)的適體傳感器，其特征在 于：所述鏈霉親和素修飾的磁性納米球，密度為1. 343g πι?Λ直徑為350nm。
3. 權(quán)利要求1所述的基于共區(qū)域化觸發(fā)鏈式雜交反應(yīng)的適體傳感器在檢測腺苷中的 應(yīng)用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：應(yīng)用方式如下： (1) 鏈酶親和素化修飾磁球的活化： ① 在離心管中加入200 μ L的TTL緩沖液和1 μ L鏈霉親和素修飾的磁性納米球，經(jīng)充 分震蕩洗滌后，將離心管置于磁球分離架上靜置7min，移除溶液部分； ② 重復上述①的操作5次，最后得到1 μ L活化的鏈酶親和素化修飾的磁性微球，待 用； (2) 生物素化適體鏈-1的固定：向上述活化好的lyL活化的鏈酶親和素化修飾的 磁性微球中加入50 μ L的濃度為2. OX 10_6mol Γ1的Bio-Apt-Ι，充分震蕩混勻后，放于 37°C恒溫箱中孵育2h ;反應(yīng)完后，放于磁球分離架上，靜置7min，移除溶液部分；然后用 Tris-HCl雜交緩沖液清洗兩次，最后獲得表面固定生物素化Apt-Ι的磁球； (3) 腺苷誘導的雙適體的共區(qū)域化：向上述步驟（2)制備得到的表面固定生物素化 Apt-Ι的磁球中加入40 μ L的濃度為1. OX 10_6mol Γ1的Apt-2和10 μ L的含有腺苷的待 檢測物，充分震蕩混勻后，放于37°C恒溫箱中孵育2h ;反應(yīng)完后，放于磁球分離架上，靜置 7min，移除溶液部分；然后用Tris-HCl雜交緩沖液清洗兩次，最后獲得腺苷誘導共區(qū)域化 的Apt-l/Apt-2復合物； (4) 共區(qū)域化觸發(fā)的鏈式雜交反應(yīng)：在上述腺苷誘導共區(qū)域化的Apt-l/Apt-2復合物 中加入50 μ L的發(fā)卡探針HI、H2的混合物。充分震蕩混勻后，放于37°C恒溫箱中孵育3h ; 反應(yīng)完后，放于磁球分離架上，靜置7min，移除溶液部分；然后用PBS緩沖液清洗兩次，最后 獲得表面固定有長的DNA雙鏈的磁球； (5) 加入染料SYBR Green I和熒光檢測：用PBS緩沖液將SYBR Green I稀釋成濃度 為2. 0X10_6mol Γ1，然后加入到上述得到的表面固定有長的DNA雙鏈的磁球中，室溫靜置 lOmin,然后進行熒光檢測，得熒光值； (6)計算：根據(jù)上述所測得的熒光值計算含有腺苷的待檢測物中腺苷的濃度。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述TTL緩沖液的組成為：由Tris-HCl、 Tween20、LiCl 和水組成，其中，各組分的濃度為：100mmol PTris-HCl ;0· 1% Tween20 ; lmol L_1LiCl ；pH8. 0 ； 所述Tris-HCl雜交緩沖液的組成為：由1^8-!1(：1、似(：1、1%(：12和水組成，其中，各組分 的濃度為：10mmol L iTris-HCl，ρΗ7· 4 ;300mmol L WaCl ；1mmo1 L ^gCl^。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述含有腺苷的待檢測物為人的尿液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述發(fā)卡探針HI、H2的混合物中，發(fā)卡探 針H1和H2的濃度相同，均為3. 0Xl(T6mol L'
8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述發(fā)卡探針HI和H2在使用之前進行 退火，退火的步驟是：在90°C加熱5min，然后冷卻到室溫。
9. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述步驟（5)中，進行熒光檢測時，熒光 光度計的基本設(shè)置為：激發(fā)波長為477nm，掃描范圍為500?600nm，激發(fā)狹縫寬度2. 5nm， 發(fā)射狹縫寬度2. 5nm，PMT電壓700V。
10. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述步驟（6)中，利用下述線性方程計 算得到腺苷的濃度： Δ F = 14. 55+1769 . 72 X 104C, r = 0. 998 ； 其中，Λ F表示熒光凈信號值，C表示腺苷的濃度，單位為mol Γ1 ;該線性方程的線性范 圍是 1. OX l(T6mol Γ1 ?1. 2Χ l(T4mol Γ1 之間。
【文檔編號】C12Q1/68GK104152552SQ201410344669
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月18日
【發(fā)明者】王磊, 姜瑋, 馮春景, 富波 申請人:山東大學