基于dna條形碼的鑒別赤鏈蛇的引物及pcr-rflp方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于中藥品種鑒定【技術(shù)領(lǐng)域】，提出了一種鑒別赤鏈蛇的聚合酶鏈反應(yīng)-限制性酶切圖譜分子鑒定方法(PCR-RFLP)。本發(fā)明引物序列為：DK1-CO1：5’-CAA?CTA?ACC?ACA?AAG?ACA?TCG?G-3’，DK1-CO2：5’-CTT?CTG?GGT?GGC?CGA?AAA?ATC?A-3’；赤鏈蛇的特征DNA堿基序列為：5’-GTGCAC-3’；限制性內(nèi)切酶APaL?I識(shí)別并切割該序列。鑒定過(guò)程：提取樣本DNA；用引物DK1-CO1、DK1-CO2進(jìn)行PCR擴(kuò)增；用限制性內(nèi)切酶APaL?I消化PCR產(chǎn)物；瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果；通過(guò)與赤鏈蛇PCR-RFLP特征結(jié)果相比較，判斷待測(cè)樣品是否為赤鏈蛇。本發(fā)明還提出用于所述鑒定方法的試劑盒。本發(fā)明鑒別準(zhǔn)確、快速、可靠，有效地區(qū)分赤鏈蛇與其它蛇類。
【專利說(shuō)明】基于DNA條形碼的鑒別赤鏈蛇的引物及PCR-RFLP方法和試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于中藥品種鑒定【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種鑒別赤鏈蛇的引物及PCR-RFLP方法和試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002]赤鏈蛇(Dinodon rufozonatum)為游蛇科鏈蛇屬的爬行動(dòng)物，具有抗炎、鎮(zhèn)靜催目民、抗驚厥之功效，用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、解毒斂瘡、全身疼痛、慢性瘺管、潰瘍、疥癬等。赤鏈蛇是一種常見(jiàn)的金錢白花蛇偽品。隨著近年金錢白花蛇藥材價(jià)格的上漲以及資源的逐漸減少，越來(lái)越多的赤鏈蛇被用來(lái)充作金錢白花蛇。目前，市場(chǎng)上金錢白花蛇商品的50%為赤鏈蛇來(lái)源的偽品，兩者從形態(tài)學(xué)上的特征進(jìn)行鑒定較為困難。尋找快速、準(zhǔn)確方法鑒別赤鏈蛇，是金錢白花蛇藥材鑒定中的一個(gè)重要問(wèn)題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種準(zhǔn)確鑒別赤鏈蛇的PCR-RFLP分子鑒定方法，包括赤鏈蛇的特征DNA堿基序列、一對(duì)PCR引物、限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)、鑒定方法及其試劑盒。
[0004]本發(fā)明基于DNA條形碼。DNA條形碼(DNA barcoding)是利用一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)DNA片段對(duì)物種進(jìn)行識(shí)別和鑒定的一項(xiàng)新技術(shù)。2003年Herbert等選取線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I的一段序列在動(dòng)物界不同分類水平上(門、目、種)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)無(wú)論在哪個(gè)分類水平上該基因都具有良好的識(shí)別能力，從而提出建立以一段長(zhǎng)度為650bp的COI基因序列為基礎(chǔ)的條形碼識(shí)別方法。隨后的研究表明，COI (線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基I)基因序列種內(nèi)變異小，種間變異大，且其DNA序列本身很少存在插入和缺失，對(duì)動(dòng)物物種的識(shí)別和鑒定切實(shí)可行，被公認(rèn)為動(dòng)物界中標(biāo)準(zhǔn)的DNA條形碼基因。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:首先從各樣本中提取總DNA，利用引物DKl-COl及DK1-C02,用PCR方法擴(kuò)增COI片段，經(jīng)純化后，對(duì)該片段進(jìn)行DNA序列測(cè)定，將所得序列登錄到Genbank系統(tǒng)獲得登錄號(hào)，并建立各樣品的DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)；在比較數(shù)據(jù)庫(kù)DNA序列的基礎(chǔ)上，得到赤鏈蛇的特征DNA堿基序列:5’ -GTGCAC-3’ (位于COI序列第362位至367位)，針對(duì)赤鏈蛇與其他蛇類DNA序列的差異，選擇合適的DNA限制性內(nèi)切酶ApaL I，通過(guò)分析聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的限制性酶切圖譜差異，達(dá)到快速、準(zhǔn)確鑒別赤鏈蛇的目的。
[0006]對(duì)需要鑒定的赤鏈蛇樣品，提取其DNA，在給定的PCR條件下，用一對(duì)引物(DK1-C0UDK1-C02)擴(kuò)增，供試品能夠擴(kuò)增出一段DNA片段；用限制性內(nèi)切酶ApaL I對(duì)供試品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，赤鏈蛇會(huì)出現(xiàn)分子量為362bp，296bp的兩條DNA片段，而其它種類的蛇不出現(xiàn)上述兩條帶。當(dāng)供試品經(jīng)本法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA片段的大小，便可準(zhǔn)確鑒定供試品是否為赤鏈蛇。
[0007]本發(fā)明用于鑒別赤鏈蛇的PCR擴(kuò)增引物，其序列為:
[0008]DKl-COl:5，-CAACTAACCACAAAGACATCGG-3，；
[0009]DK1-C02:5’ -CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’。
[0010]本發(fā)明設(shè)計(jì)的用于鑒別赤鏈蛇PCR-RFLP分子鑒定方法，步驟如下:
[0011]I)提取待測(cè)樣品DNA;
[0012]2)擴(kuò)增DNA片段，PCR反應(yīng)參數(shù)包括:93°C預(yù)變性5min，55°C 2min ;93°C變性30s，55°C復(fù)性45s，70。。延伸45s, 35個(gè)循環(huán);70°C延伸5min。所述引物DKl-COl和DK1-C02，其序列為:
[0013]DKl-COl:5’ -CAACTAACCACAAAGACATCGG-3’ (SEQ ID N0.1)
[0014]DK1-C02:5’ -CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’ (SEQ ID N0.2)
[0015]3)純化PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳分析；
[0016]4)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入限制性內(nèi)切酶APaL I進(jìn)行酶切，限制性內(nèi)切酶APaL I酶切位點(diǎn)為:G'TGCAC ；
[0017]5)瓊脂糖凝膠電泳分析；
[0018]6)鑒定結(jié)果的判斷，若出現(xiàn)362bp和296bp的兩條片段，則待測(cè)樣品為赤鏈蛇；若不出現(xiàn)上述兩條片段，則待測(cè)樣品不為赤鏈蛇。
[0019]本發(fā)明方法的步驟I)和3)，采用現(xiàn)有技術(shù)的試劑盒提取DNA及純化PCR產(chǎn)物的方法，不需要配制任何試劑，使得操作時(shí)間大大縮短。
[0020]本發(fā)明還提出了用于鑒定赤鏈蛇PCR-RFLP方法的試劑盒。所述試劑盒包括:弓丨物DKl-COl (10 μ M);引物DK1-C02 (10 μ Μ) ；2XTaq DNA聚合酶混合緩沖液，其包括:TaqDNA聚合酶(0.1U/ μ L)，四種脫氧核糖核苷三磷酸(dATP、dTTP、dCTP及dGTP各500 μ Μ)，Tris-HCl (20 μ Μ、ρΗ8.3)，KCl (100 μ Μ)，MgCl2 (3 μ Μ)等；ApaL I 酶(1U/ μ L);酶切緩沖液；終止緩沖液；滅菌雙蒸水。
[0021]綜上所述，本發(fā)明解決了鑒定赤鏈蛇與其它品種蛇的難題，提供了鑒定所需的一對(duì)PCR引物、PCR反應(yīng)條件、赤鏈蛇特征DNA堿基序列、一種限制性內(nèi)切酶、鑒定方法及其試劑盒。本發(fā)明利用赤鏈蛇與其它蛇類藥材DNA序列的差異，構(gòu)建了快速、便捷、準(zhǔn)確的PCR-RFLP鑒別方法，對(duì)于保證金錢白花蛇的藥材質(zhì)量，打擊金錢白花蛇偽品的市場(chǎng)行為具有重要的價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1為各樣本PCR擴(kuò)增電泳圖:1.赤鏈蛇2.金錢白花蛇3.黃斑漁游蛇4.眼鏡蛇5.百花錦蛇6.尖吻蝮蛇；MK.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn):從上到下依次為1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、lOObp。
[0023]圖2為各樣本COI條形碼序列PCR產(chǎn)物酶切電泳結(jié)果:1.赤鏈蛇2.金錢白花蛇
3.黃斑漁游蛇4.眼鏡蛇5.百花錦蛇6.尖吻蝮蛇；MK.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn):從上到下依次為100bp、7 OObp、500bp、400bp、300bp、200bp、10bp。

【具體實(shí)施方式】
[0024]結(jié)合以下具體實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不局限于以下實(shí)施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點(diǎn)都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護(hù)范圍。實(shí)施本發(fā)明的過(guò)程、條件、試劑、實(shí)驗(yàn)方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識(shí)和公知常識(shí)，本發(fā)明沒(méi)有特別限制內(nèi)容。
[0025]1、材料
[0026]6份蛇類原動(dòng)物，主要采自廣東省、江西省、廣西壯族自治區(qū)(表1)。全部樣本均由華南瀕危動(dòng)物研究所張亮進(jìn)行性狀鑒定。
[0027]表1 6份蛇類原動(dòng)物樣本
[0028]

【權(quán)利要求】
1.用于鑒別赤鏈蛇的PCR擴(kuò)增引物，其特征在于，所述引物序列為:
DKl-COl:5，-CAACTAACCACAAAGACATCGG-3，；
DK1-C02:5’ -CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’。
2.一種鑒定赤鏈蛇的PCR-RFLP方法，其特征在于，用能夠識(shí)別赤鏈蛇特征DNA堿基序列的限制性內(nèi)切酶APaL I對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行消化，形成瓊脂糖凝膠電泳的特征圖譜；赤鏈蛇特征DNA堿基序列為:5’ -GTGCAC-3’，其位于COI序列第362位至367位；所述鑒定方法包括以下步驟: 1)樣品DNA的提取； 2)擴(kuò)增DNA片段:利用權(quán)利要求1所述的引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，得到聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物，所述PCR反應(yīng)參數(shù)包括:93°C預(yù)變性5min，55°C 2min ;93°C變性30s，55°C復(fù)性45s, 70°C延伸 45s, 35 個(gè)循環(huán);70°C延伸 5min ； 3)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，純化PCR產(chǎn)物； 4)所述PCR純化產(chǎn)物中加入限制性內(nèi)切酶APaLI進(jìn)行酶切，所述限制性內(nèi)切酶APaLI的酶切位點(diǎn)為:G~TGCAC ； 5)瓊脂糖凝膠電泳分析； 6)鑒定結(jié)果的判斷:若 在所述電泳產(chǎn)物中檢測(cè)到分子量為362bp和296bp的兩條片段，則待測(cè)樣品為赤鏈蛇；若未出現(xiàn)上述兩條片段，則待測(cè)樣本非赤鏈蛇。
3.一種用于鑒別赤鏈蛇的PCR-RFLP檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括:10μΜ引物 DKl-COl ;10y]\^|*DKl-C02 ；2XTaq DNA 聚合酶混合緩沖液，其包括:0.1U/μ L TaqDNA 聚合酶，dATP、dTTP、dCTP 及 dGTP 各 500 μ M, 20 μ M Tris_HCl、pH8.3，100 μ M KC1，3 μ MMgCl2 ;10υ/μ L ApaL I酶；酶切緩沖液；終止緩沖液；滅菌雙蒸水。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104164493SQ201410347839
【公開(kāi)日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2014年7月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月21日
【發(fā)明者】晁志, 李曉蕾, 曾偉萍 申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)