利用玉米黑粉菌mig2-5啟動子進(jìn)行球孢白僵菌遺傳轉(zhuǎn)化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用玉米黑粉菌MIG2-5啟動子進(jìn)行球孢白僵菌遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟：1)MIG:GFP質(zhì)粒載體的構(gòu)建；2)球孢白僵菌DNA提?。?)球孢白僵菌原生質(zhì)體的制備；4)PEG介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化；5)PCR檢測；6)轉(zhuǎn)化子熒光觀察。本發(fā)明技術(shù)方案獲得的原生質(zhì)體再生率達(dá)70％以上。
【專利說明】利用玉米黑粉菌MIG2-5啟動子進(jìn)行球孢白僵菌遺傳轉(zhuǎn)化方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種利用玉米黑粉菌MIG2-5啟動子進(jìn)行球孢白僵菌遺傳轉(zhuǎn)化方法。

【背景技術(shù)】
[0002]球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是一種致病性與適應(yīng)性很強(qiáng),且寄主范圍廣的昆蟲病原真菌，已被作為昆蟲真菌制劑廣泛用于玉米螟(Ostrinia furnacalis)的生物防治。在球孢白僵菌功能基因研究及基因工程育種過程中，啟動子是外源或內(nèi)源基因?qū)胄实闹匾蛩刂弧?br> [0003]目前，球孢白僵菌的遺傳轉(zhuǎn)化啟動子主要采用來源于構(gòu)巢曲霉的PgpdA啟動子，長度為2000余bp，雖然具有良好的轉(zhuǎn)化效率，但單一的啟動子對不同類型基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，會受到酶切位點(diǎn)而影響遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建，其大小也會影響遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建，并且影響轉(zhuǎn)化效率，因此，開發(fā)一種新的高效啟動子能夠?yàn)榍蜴甙捉┚z傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建提供更多的選擇，為球孢白僵菌的功能性基因研究及基因工程育種奠定基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供一種利用玉米黑粉菌MIG2-5啟動子進(jìn)行球孢白僵菌遺傳轉(zhuǎn)化方法。其具體技術(shù)方案為:
[0005]一種利用玉米黑粉菌MIG2-5啟動子進(jìn)行球孢白僵菌遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟:
[0006]1)MIG:GFP質(zhì)粒載體的構(gòu)建
[0007]利用特異引物以質(zhì)粒MIG = CAR為模板擴(kuò)增得MIG2-5全序列，克隆到pUCm_T載體上，形成pUC-MIG，并測序驗(yàn)證；然后用XbaI和NcoI雙酶切pUC_MIG和PF質(zhì)粒，回收MIG片段，克隆到用相同酶切的PF載體上，形成MIG =GFP載體；
[0008]2)球孢白僵菌DNA提取
[0009]10mg菌粉液氮研磨成粉末；
[0010]置于預(yù)先加入600 μ L提取液的1.5mlEP管靜置2min ；
[0011]加入100 μ LlO % SDS,充分混合后加入300 μ L氯化芐，劇烈振蕩混勻；50°C水浴Ih,不用顛倒；
[0012]加入100 μ L3MNaAc,4 °C放置十分鐘后使用，冰浴15min后12000r/min離心1min ；
[0013]吸取上清液轉(zhuǎn)入新的離心管，加入體積比為25:24:1的水飽和酚/氯仿/Tris飽和酌.抽提，12000r/min離心1min ；
[0014]取上清加入RNA酶，65°C水浴30min ；
[0015]加入體積比為25:24:1的水飽和酚/氯仿/Tris飽和酚抽提，12000r/min離心1min ；
[0016]取上清，加入2倍體積的冰預(yù)冷無水乙醇，-20 V冰柜，即加滿EP管，溫和翻轉(zhuǎn)，室溫下沉淀 30min, 12000r/min 離心 1min ；
[0017]棄上清，留沉淀，以50-100 μ L的70%乙醇洗沉淀物，12000r/min離心3min,洗漆1-2 次；
[0018]干燥后，加入50 μ LTE溶解DNA，保存于_20°C備用；
[0019]3)球孢白僵菌原生質(zhì)體的制備
[0020]將培養(yǎng)好的白僵菌菌液用漏斗過濾到空瓶中，留下濾布中得到的菌絲體；
[0021]滲透壓緩沖液洗滌2-3遍，并用小勺收集菌絲到6mLEP管中；
[0022]在EP管中加入4mL的LB液體培養(yǎng)基，8 μ L β -巰基乙醇，搖菌絲，使菌絲充分混入緩沖液中；
[0023]28°C 下 100r/min 培養(yǎng) 20_25min ；
[0024]將EP管第二次過濾，收集菌絲體，并用滲透壓緩沖液洗滌兩次；
[0025]用小勺刮下濾布上的菌絲到新的EP管，加入4mL滲透壓緩沖液，再加入0.1g的酶粉振蕩；
[0026]28°C下100r/min培養(yǎng)lh，并鏡檢觀察，此時(shí)視野中應(yīng)得到透明圓球狀的原生質(zhì)體；
[0027]4) PEG介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化
[0028]將得到的原生質(zhì)體懸液吸取400 μ L到2個新的EP管中，做好標(biāo)記，分別為CK對照 MIG:GFP ；
[0029]對應(yīng)管中分別加入10 μ LMIG:GFP質(zhì)粒，冰浴20min ；
[0030]每個管中各加入100 μ LPEG4000溶液，混勻，冰浴20min ；
[0031 ] 各加入2mLPEG4000，混勻，常溫放置5min ；
[0032]加入4mL的0.7mol/L山梨醇溶液稀釋；
[0033]吸200 μ L于軟瓊脂平板上，封口標(biāo)記，于28 °C恒溫箱培養(yǎng)24h ；
[0034]將ImL的滲透壓緩沖液打在軟瓊脂平板上，重復(fù)吸打；吸出100 μ L均勻涂在帶有PPT抗性的查氏培養(yǎng)基上，于28°C恒溫箱培養(yǎng)并觀察；
[0035]5) PCR 檢測
[0036]首先利用氯化芐法提取白僵菌基因組DNA ；
[0037](I) 10mg菌粉液氮研磨成粉末；
[0038](2)置于預(yù)先加入600 μ L提取液的1.5mlEP管靜置2min ；
[0039](3)加入100 μ L10% SDS,充分混合后加入300 μ L氯化芐，劇烈振蕩混勻；50°C水浴Ih,不用顛倒；
[0040](4)加入100 μ L3MNaAc，4°C放置十分鐘后使用，冰浴15min后12000r/min離心1min ；
[0041](5)吸取上清液轉(zhuǎn)入新的離心管，加入體積比為25:24:1的水飽和酚/氯仿/Tris飽和酚抽提，12000r/min離心1min ；
[0042](6)取上清加入RNA酶，65°C水浴30min ；
[0043](7)加入體積比為25:24:1的水飽和酚/氯仿/Tris飽和酚抽提，12000r/min離心 1min ；
[0044](8)取上清，加入2倍體積的冰預(yù)冷無水乙醇，-20 V冰柜，即加滿EP管，溫和翻轉(zhuǎn)，室溫下沉淀 30min, 12000r/min 離心 1min ；
[0045](9)棄上清，留沉淀，以50-100 μ L的70%乙醇洗沉淀物，12000r/min離心3min,洗漆1_2次；
[0046](10)干燥后，加入50 μ L TE溶解DNA，保存于_20°C備用；
[0047]利用基因組DNA做模版，以MIG2-5特異性引物進(jìn)行PCR及電泳檢測；
[0048]6)轉(zhuǎn)化子熒光觀察
[0049]將轉(zhuǎn)化子在PDA平板上劃線26°C培養(yǎng)3天，掛下菌絲及孢子置于倒置熒光顯微鏡下觀察。
[0050]優(yōu)選地，步驟2)和步驟4)中所述提取液為I % SDS,0.5MNaCl、0.2MTris_Hcl、
0.01MEDTA、ph = 8.0。
[0051]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明技術(shù)方案獲得的原生質(zhì)體再生率達(dá)70%以上。應(yīng)用來源于玉米黑粉菌的MIG2-5啟動子進(jìn)行球孢白僵菌遺傳轉(zhuǎn)化，其轉(zhuǎn)化效率達(dá)到21個轉(zhuǎn)化子/ μ gDNA。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0052]圖1是MIG =GFP載體圖譜
[0053]圖2是制備的原生質(zhì)體
[0054]圖3是MIG =GFP轉(zhuǎn)化子及對照圖片；圖3a是轉(zhuǎn)化子圖片，圖3b是對照圖片；
[0055]圖4是轉(zhuǎn)化子PCR檢測圖片，泳道M為分子量marker，泳道I為陰性對照，泳道2為陽性對照，泳道3為空白對照，泳道4-11為轉(zhuǎn)MIG =GFP基因樣品檢測；
[0056]圖5是轉(zhuǎn)MIG:GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子熒光顯微檢測結(jié)果圖，其中，圖5 (a)為熒光下；圖5(b)為白光下；圖5(c)為合成光下。

【具體實(shí)施方式】
[0057]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。
[0058]I實(shí)驗(yàn)方法:
[0059]1.1遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建:將來源于玉米黑粉菌MIG2-5啟動子構(gòu)建到以抗草胺磷基因bar為篩選標(biāo)記,綠色突光蛋白GFP為標(biāo)記基因，TtrpC為終止子的遺傳轉(zhuǎn)化載體上，構(gòu)建MIG =GFP轉(zhuǎn)化載體。
[0060]1.2球孢白僵菌原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化
[0061]原生質(zhì)體的獲得
[0062](I)將培養(yǎng)好的白僵菌菌液用漏斗過濾到空瓶中，留下濾布中得到的菌絲體；
[0063](2)滲透壓緩沖液洗滌2-3遍，并用小勺收集菌絲到6mLEP管中；
[0064](3)在EP管中加入4mL的LB液體培養(yǎng)基，8 μ L β -巰基乙醇，搖菌絲，使菌絲充分混入緩沖液中；
[0065](4) 28 O 下 100r/min 培養(yǎng) 20_25min ；
[0066](5)將小管第二次過濾，收集菌絲體，并用滲透壓緩沖液洗滌兩次；
[0067](6)用小勺刮下濾布上的菌絲到新的EP管，加入4mL滲透壓緩沖液，再加入0.1g的酶粉振蕩；
[0068](7)28°C下100r/min培養(yǎng)Ih左右，并鏡檢觀察，此時(shí)視野中應(yīng)得到透明圓球狀的原生質(zhì)體。
[0069]PEG介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系建立
[0070](I)將得到的原生質(zhì)體懸液吸取400 μ L到三個新的EP管中，做好標(biāo)記，分別為CK對照和MIG =GFP質(zhì)粒；
[0071](2)對應(yīng)管中分別加入10 μ LMIG:GFP質(zhì)粒(MIG:GFP質(zhì)粒濃度56.4ug/ μ L)冰浴20min ；
[0072](3)每個管中各加入100 μ L PEG4000溶液，混勻，冰浴20min ；
[0073](4)各加入2mLPEG4000，混勻，常溫放置5min ；
[0074](5)加入4mL的0.7mol/L山梨醇溶液稀釋；
[0075](6)吸200 μ L于軟瓊脂平板上，封口標(biāo)記，于28°C恒溫箱培養(yǎng)24h ；
[0076](7)將ImL的滲透壓緩沖液打在軟瓊脂平板上，重復(fù)吸打。吸出100 μ L均勻涂在帶有PPT抗性的查氏培養(yǎng)基上，于28°C恒溫箱培養(yǎng)并觀察。
[0077]平均轉(zhuǎn)化效率分析
[0078](I)對MIG:GFP載體進(jìn)行球孢白僵菌原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化，每個載體轉(zhuǎn)化5個平板；
[0079](2)轉(zhuǎn)化后對每個轉(zhuǎn)化平板進(jìn)行轉(zhuǎn)化子數(shù)量的統(tǒng)計(jì)，取平均值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；
[0080]1.3轉(zhuǎn)化子的PCR檢測及熒光觀察
[0081](I)利用滅菌環(huán)將查氏培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)化子小心挑出，在提前準(zhǔn)備的PDA平板上畫多個“Z”字，分別標(biāo)記為轉(zhuǎn)MIG =GFP和CK。
[0082](2)將劃好的平板置于26°C恒溫培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)3d。
[0083](3)此時(shí)得到轉(zhuǎn)化子第一代，繼續(xù)挑出孢子劃線在新的PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3d得到第二代孢子；
[0084](4)同上述過程，得到第三代轉(zhuǎn)化子孢子，在超凈工作臺中挑出，置于SDY培養(yǎng)基中搖2-3d。
[0085]PCR檢測:利用氯化芐法提取球孢白僵菌轉(zhuǎn)化子基因組DNA，然后利用基因組做模版，利用GFP基因特異性引物，進(jìn)行PCR及電泳檢測。
[0086]熒光觀察:菌絲從PDA上刮下后置于SDAY培養(yǎng)基中搖三天，將實(shí)驗(yàn)控制在相同的培養(yǎng)條件及時(shí)間，在培養(yǎng)第48h置于倒置熒光顯微鏡下觀察。
[0087]2研究結(jié)果:
[0088]2.1載體MIG =GFP構(gòu)建如圖1所示。
[0089]2.2轉(zhuǎn)化子的獲得及轉(zhuǎn)化效率評價(jià)
[0090](I)獲得的原生質(zhì)體再生率達(dá)70%以上。
[0091](2)轉(zhuǎn)化子的獲得
[0092]利用PEG法將制得的hsp70_F質(zhì)粒轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體后均勻涂在帶有PPT抗性的查氏培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)后結(jié)果如圖所示。圖3a為轉(zhuǎn)入MIG:GFP質(zhì)粒的球孢白僵菌培養(yǎng)基，相比于圖3b的對照組，圖3a可看到明顯的球孢白僵菌菌落，證明原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化得到陽性轉(zhuǎn)化子。
[0093](3)轉(zhuǎn)化效率分析
[0094]每個轉(zhuǎn)化后原生質(zhì)體懸液均勻涂在5個查氏培養(yǎng)基上，篩選培養(yǎng)3-4d后，MIG =GFP的轉(zhuǎn)化子個數(shù)平均值分別為21個/ μ gDNA。
[0095]2.3PCR檢測及熒光觀察
[0096](I) PCR 檢測
[0097]對經(jīng)過三代繼代培養(yǎng)后的轉(zhuǎn)化子，提取總DNA后，利用MIG2-5特異性引物進(jìn)行PCR檢測。由圖4可知，轉(zhuǎn)化子的PCR條帶大小與MIG2-5基因大小相符。
[0098](2)熒光觀察
[0099]菌絲從PDA上刮下后置于SDAY培養(yǎng)基中搖三天，得到的菌絲體由于有GFP熒光基因的表達(dá)，所以得到的白僵菌菌絲及孢子中均有熒光出現(xiàn)，具體如圖5所示。
[0100]以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實(shí)施方式】，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此，任何熟悉本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可顯而易見地得到的技術(shù)方案的簡單變化或等效替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種利用玉米黑粉菌MIG2-5啟動子進(jìn)行球孢白僵菌遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)MIG:GFP質(zhì)粒載體的構(gòu)建 利用特異引物以質(zhì)粒MIG = CAR為模板擴(kuò)增得MIG2-5全序列，克隆到pUCm-T載體上，形成pUC-MIG，并測序驗(yàn)證；然后用XbaI和NcoI雙酶切pUC_MIG和PF質(zhì)粒，回收MIG片段，克隆到用相同酶切的PF載體上，形成MIG =GFP載體； 2)球孢白僵菌DNA提取 10mg菌粉液氮研磨成粉末； 置于預(yù)先加入600 μ L提取液的1.5mlEP管靜置2min ； 加入100 μ LlO% SDS’充分混合后加入300 μ L氯化芐，劇烈振蕩混勻；50°C水浴lh，不用顛倒； 加入100μ L3MNaAc，4°C放置十分鐘后使用，冰浴15min后12000r/min離心1min ；吸取上清液轉(zhuǎn)入新的離心管，加入體積比為25:24:1的水飽和酚/氯仿/Tris飽和酚抽提，12000r/min 離心 1min ； 取上清加入RNA酶，65°C水浴30min ； 加入體積比為25:24:1的水飽和酹/氯仿/Tris飽和酹抽提，12000r/min離心1min ；取上清，加入2倍體積的冰預(yù)冷無水乙醇，-20°C冰柜，即加滿EP管，溫和翻轉(zhuǎn)，室溫下沉淀 30min, 12000r/min 離心 1min ； 棄上清，留沉淀，以50-100 μ L的70%乙醇洗沉淀物，12000r/min離心3min，洗滌1_2次； 干燥后，加入50 μ LTE溶解DNA，保存于_20°C備用； 3)球孢白僵菌原生質(zhì)體的制備 將培養(yǎng)好的白僵菌菌液用漏斗過濾到空瓶中，留下濾布中得到的菌絲體； 滲透壓緩沖液洗滌2-3遍，并用小勺收集菌絲到6mLEP管中； 在EP管中加入4mL的LB液體培養(yǎng)基，8 μ L β -巰基乙醇，搖菌絲，使菌絲充分混入緩沖液中；
28°C 下 100r/min 培養(yǎng) 20_25min ； 將EP管第二次過濾，收集菌絲體，并用滲透壓緩沖液洗滌兩次； 用小勺刮下濾布上的菌絲到新的EP管，加入4mL滲透壓緩沖液，再加入0.1g的酶粉振蕩； 28°C下lOOr/min培養(yǎng)lh，并鏡檢觀察，此時(shí)視野中應(yīng)得到透明圓球狀的原生質(zhì)體； 4)PEG介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化 將得到的原生質(zhì)體懸液吸取400 μ L到2個新的EP管中，做好標(biāo)記，分別為CK對照MIG:GFP ； 對應(yīng)管中分別加入10 μ LMIG:GFP質(zhì)粒，冰浴20min ； 每個管中各加入100 μ LPEG4000溶液，混勻，冰浴20min ； 各加入2mLPEG4000，混勻，常溫放置5min ； 加入4mL的0.7mol/L山梨醇溶液稀釋； 吸200 μ L于軟瓊脂平板上，封口標(biāo)記，于28°C恒溫箱培養(yǎng)24h ；將ImL的滲透壓緩沖液打在軟瓊脂平板上，重復(fù)吸打；吸出100 μ L均勻涂在帶有PPT抗性的查氏培養(yǎng)基上，于28°C恒溫箱培養(yǎng)并觀察； 5)PCR檢測 首先利用氯化芐法提取白僵菌基因組DNA ； (1)10mg菌粉液氮研磨成粉末； (2)置于預(yù)先加入600μ L提取液的1.5mlEP管靜置2min ； (3)加入100μ LlO % SDS’充分混合后加入300 μ L氯化芐，劇烈振蕩混勻；50°C水浴Ih,不用顛倒； (4)加入100μ L3MNaAc，4°C放置十分鐘后使用，冰浴15min后12000r/min離心1min ； (5)吸取上清液轉(zhuǎn)入新的離心管，加入體積比為25:24:1的水飽和酚/氯仿/Tris飽和酌.抽提，12000r/min 離心 1min ； (6)取上清加入RNA酶，65°C水浴30min； (7)加入體積比為25:24:1的水飽和酚/氯仿/Tris飽和酚抽提，12000r/min離心1min ； (8)取上清，加入2倍體積的冰預(yù)冷無水乙醇，-20°C冰柜，即加滿EP管，溫和翻轉(zhuǎn)，室溫下沉淀 30min, 12000r/min 離心 1min ； (9)棄上清，留沉淀，以50-100μ L的70%乙醇洗沉淀物，12000r/min離心3min，洗滌1-2 次； (10)干燥后，加入50μLTE溶解DNA，保存于-2(rC備用； 利用基因組DNA做模版，以MIG2-5特異性引物進(jìn)行PCR及電泳檢測； 6)轉(zhuǎn)化子熒光觀察 將轉(zhuǎn)化子在PDA平板上劃線26°C培養(yǎng)3天，掛下菌絲及孢子置于倒置熒光顯微鏡下觀察。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用玉米黑粉菌MIG2-5啟動子進(jìn)行球孢白僵菌遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，步驟2)和步驟4)中所述提取液為1% SDS、0.5MNaCl、0.2MTris_Hcl、0.01MEDTA、ph = 8.0。
【文檔編號】C12N15/80GK104131027SQ201410353302
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月23日
【發(fā)明者】李啟云, 徐文靜, 路楊, 張佳詩, 張正坤, 鄭巖, 隋麗, 杜茜, 任金平, 田志來 申請人:吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院