一種蘭花無菌苗快速菌根化的方法
【專利摘要】本發(fā)明一種蘭花無菌苗快速菌根化的方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中的蘭花人工育苗中幼苗生長緩慢、死亡率高等問題，包括一個準(zhǔn)備栽培基質(zhì)及營養(yǎng)液的步驟，所述的栽培基質(zhì)由草炭和黃沙組成，所述的草炭和黃沙的體積比為1：1.5~3；一個對無菌苗進行接種的步驟，將組織培養(yǎng)生根幼苗或無菌播種小苗移栽入無菌處理的栽培基質(zhì)中，在幼苗根部附近接種菌塊，菌塊是保藏號為CGMCC?No:9222或者CGMCC?No:9247的菌株，菌塊接種處距離根系0.3～2cm，接種后幼苗放置在培養(yǎng)室培養(yǎng)。采用本發(fā)明的方法使得蘭花幼苗形成菌根快速、侵染率高，幼苗生長快，可用于蘭花種苗生產(chǎn)。
【專利說明】一種蘭花無菌苗快速菌根化的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，尤其涉及一種蘭花的栽培技術(shù)，特別是一種蘭花無菌苗快速菌根化的方法。

【背景技術(shù)】
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[0002]蘭科植物，簡稱蘭花，是一類重要的觀賞和經(jīng)濟價值的珍貴花卉，常采用組培方法繁殖無菌小苗，但存在著組培困難、增殖系數(shù)小，生長緩慢，移栽時存活率低等問題。蘭花菌根真菌在蘭科植物生長中起著重要的作用，促進種子的萌發(fā)，在植株生長階段促進對N、P等營養(yǎng)元素的吸收和利用，分泌激素促進植株的生長，甚至拮抗致病菌抑制其生長等作用。實現(xiàn)種苗菌根化是克服蘭苗生長緩慢、提高移栽存活率的有效方法。選擇合適的培養(yǎng)方法特別是培養(yǎng)基直接影響蘭花在菌根化效果的重要因素。普通培養(yǎng)基一般更有利于真菌生長，易出現(xiàn)真菌營養(yǎng)過剩造成生長過旺纏繞植株，對植株表現(xiàn)出致病性導(dǎo)致植株生長緩慢甚至死亡的現(xiàn)象。本發(fā)明中菌根化方法，通過與目前較為常見的共生培養(yǎng)方法進行比較，從而選擇效果更佳的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

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[0003]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種蘭花無菌苗快速菌根化的方法，所述的這種蘭花無菌苗快速菌根化的方法要解決現(xiàn)有技術(shù)中使用共生培養(yǎng)基接種法常出現(xiàn)的幼苗生長緩慢、菌株生長過快甚至影響幼苗生長等技術(shù)問題。
[0004]本發(fā)明一種蘭花無菌苗快速菌根化的方法，包括以下步驟:
[0005]I) 一個準(zhǔn)備栽培基質(zhì)及營養(yǎng)液的步驟，所述的栽培基質(zhì)由草炭和黃沙組成，所述的草炭和黃沙的體積比為1:1.5?3,所述的營養(yǎng)液是液體培養(yǎng)液,在所述的液體培養(yǎng)液中，葡萄糖的質(zhì)量百分比濃度為0.15% ;
[0006]2) 一個對無菌苗進行接種的步驟，將組織培養(yǎng)生根幼苗或無菌播種小苗移栽入無菌處理的栽培基質(zhì)中，在幼苗根部附近接種至少一個菌塊，所述的菌塊為保藏號為CGMCC No:9222 或者 CGMCC No:9247 的菌株，所述保藏號為 CGMCC No:9222 (LH53)的菌株屬于散囊菌綱(Eurot1mycetes)、散囊菌目(Onygenales)、畸枝霉屬(Malbranchea),所述保藏號為CGMCC No:9247(LH94)的菌株屬于傘菌綱(Agaricomycetes)，雞油菌目(Cantharellales),膠膜菌科(Tulasnellaceae)，膠膜菌屬(Tulasnella),分類命名為Tulasnella sp.,所述的菌塊直徑在I?1mm之間，所述的菌塊接種處距離根系0.3?2cm，接種后幼苗放置在培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是溫度22?26°C，光照周期16?10h/8?14h,光強度為2000?40001ux，培養(yǎng)時間是60?10cL
[0007]進一步的，所述的液體培養(yǎng)液是MMN液體培養(yǎng)液，在所述的MMN液體培養(yǎng)液中，葡萄糖的質(zhì)量百分比濃度為0.15%。
[0008]進一步的，所述的栽培基質(zhì)中，所述的草炭和黃沙的體積比為1:2。
[0009]進一步的，所述的液體培養(yǎng)液中，所述的葡萄糖的質(zhì)量百分比濃度為0.15%。
[0010]本發(fā)明還提供了上述的一種菌株，保藏號為CGMCC No:9222，屬于散囊菌綱(Eurot1mycetes)、散囊菌目(Onygenales)、畸枝霉屬(Malbranchea)。
[0011]本發(fā)明還提供了上述的一種菌株，保藏號為CGMCC No:9247，屬于傘菌綱(Agaricomycetes)，雞油菌目(Cantharellales),膠膜菌科(Tulasnellaceae),膠膜菌屬(Tulasnella),分類命名為 Tulasnella sp.。
[0012]本發(fā)明還提供了上述的一種保藏號為CGMCC No:9222的菌株在促進蘭花幼苗生長中的用途。
[0013]本發(fā)明還提供了上述的一種保藏號為CGMCC No:9247的菌株在促進蘭花幼苗生長中的用途。
[0014]本發(fā)明的蘭花菌根真菌(LH53),屬于散囊菌綱(Eurot1mycetes)、散囊菌目(Onygenales)、畸枝霉屬(Malbranchea),其分類命名為Malbranchea sp.,該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)中，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號(中科院微生物研究所)，保藏日期為2014年5月13日，保藏號為CGMCC No:9222。
[0015]本發(fā)明的蘭花菌根真菌(LH94)，其分類命名為Tulasnella sp.，屬于傘菌綱(Agaricomycetes)，雞油菌目(Cantharellales),膠膜菌科(Tulasnellaceae),膠膜菌屬(Tulasnella),分類命名為Tulasnella sp.。該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)中，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號(中科院微生物研究所)，保藏日期為2014年6月9日，保藏號為CGMCC No:9247。
[0016]本發(fā)明的方法和現(xiàn)有的技術(shù)相比較，其效果是積極和明顯的。解決了現(xiàn)有技術(shù)中的蘭花人工育苗中幼苗生長緩慢、死亡率高等問題。采用本發(fā)明的方法將會促進蘭花幼苗菌根化效果快、侵染率高，幼苗生長質(zhì)量高，是一種促進效果更為明顯的蘭花無菌苗快速菌根化的方法，可用科學(xué)研究，也可用于蘭花種苗生產(chǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
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[0017]圖1是本發(fā)明的一種與蘭花幼苗高效共生的菌根真菌菌株菌落形態(tài)的照片。
[0018]圖2是本發(fā)明的一種接種菌株LH53的蘭花幼苗根部橫切面在光學(xué)顯微鏡100倍下顯微結(jié)構(gòu)照片。
[0019]圖3是不接種的蘭花幼苗根部橫切面在光學(xué)顯微鏡100倍下顯微結(jié)構(gòu)照片?！揪唧w實施方式】:
[0020]實施例1蘭花菌根真菌的分離與鑒定:
[0021]一、分離根系材料:采取上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院盆栽春蘭搬至遮蔭大棚處待用。
[0022]二、分離與鑒定培養(yǎng)基:
[0023]使用麥芽提取物培養(yǎng)基(MEA)，配方為:麥芽提取物20g、胰蛋白胨I克、葡萄糖20克、瓊脂20克，蒸餾水定容至1000毫升，然后121 °C高壓滅菌20分鐘，冷卻至60°C以下時加入0.03克鏈霉素。
[0024]三、分離與形態(tài)鑒定方法:
[0025]菌根真菌菌株的分離:取新鮮健康的蘭花植物數(shù)段根部，放在自來水下沖洗，直至根部表面無污泥。將根部切成幾段長約為1cm的小段，用無菌水清洗3次，濾紙吸干水分后浸入75%的酒精60s，接著浸入2%次氯酸鈉60s，然后再浸入75%的酒精30s，最后用無菌水清洗3-5遍。將消毒完成的根部材料在無菌條件下切成0.5cm小段，在無菌條件下分別將其接種至滅菌后冷卻至室溫的MEA培養(yǎng)基(含lOOug/ml青霉素)，于26°C培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3 — 25d。
[0026]菌落形態(tài)和菌絲體顯微特征觀察鑒定:待菌落從根段中長出來，用接種針挑取菌落至MEA培養(yǎng)基,繼續(xù)進行菌落形態(tài)鑒定,培養(yǎng)7-15d后觀察菌落形態(tài)的一致性和均勻性，若菌落形態(tài)有差異，進行二次分離和鑒定。菌落形態(tài)特征穩(wěn)定的菌株用接種針挑取至MEA平板22°C培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)7-15d。本實施例所使用培養(yǎng)箱為賽福恒溫恒濕培養(yǎng)箱HWS —350。
[0027]四、分子鑒定方法:
[0028]菌絲的收集:在無菌條件下挑取試管平面上保存的菌株菌絲至滅菌冷卻后的MEA培養(yǎng)基上活化，在黑暗條件下培養(yǎng)3?7d，刮取菌絲，使用CTAB法提取總DNA。
[0029]ITS區(qū)段的PCR擴增:rDNA ITS區(qū)段的擴增采用通用引物ITSl (5' TCC GTA GGTGM CCT GCG G 3' )，ITS4(5' TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3' ) ICR反應(yīng)體系的組成為10XBuffer2.5μ l,50mmol/L Mg2+3 μ I, lOmmol/L dNTP0.5 μ l,10ymol/L 引物各 0.5 μ 1，模板DNAl μ I (終濃度在50ng/l左右)，Taq酶IU (0.2 μ I)，用無菌純水定容至25 μ I。PCR反應(yīng)采用B1RAD DNA Engine型PCR儀，循環(huán)參數(shù)為:預(yù)變性95°C，5min，變性95°C，30s，退火53°C，30s，延伸72°C，45s ;終末延伸72°C，5min。共進行35個循環(huán)。
[0030]產(chǎn)物純化及測序:PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化后使用載體是PMD18?T轉(zhuǎn)化連接，測序引物為M13R(?48)，使用測序儀器ΑΒΙ3730Π進行測序(測序工作由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成)。所得序列使用PRMER3軟件進行網(wǎng)上比對，并輔以人工校對，確定序列的可靠性。得到的序列在NCBI上BLAST，使用數(shù)據(jù)庫為GenBank。
[0031]五、菌株鑒定結(jié)果:
[0032]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了兩種真菌菌株，其中一種LH53菌株形態(tài)特征為:菌落米白色，生長之初呈絨氈狀，一段時間后呈棉絮狀。
[0033]六、分子鑒定結(jié)果:
[0034]LH53真菌核糖體脫氧核糖核酸內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的序列如SEQ ID NO:1所示，ITS序列經(jīng)BLAST比對，與Malbranchea cinnamomea的ITS序列相似度為96 經(jīng)ITS序列比對最相近物種為散囊菌綱(Eurot1mycetes)、散囊菌目(Onygenales)、畸枝霉屬(Malbranchea)的真菌，保藏號為CGMCC No: 9222，鑒定為新的蘭花菌根真菌菌株。
[0035]七、菌株鑒定結(jié)果:
[0036]其中一種LH94菌株形態(tài)特征為:菌落米白色絨氈狀，呈圓形。
[0037]八、分子鑒定結(jié)果:
[0038]LH94真菌核糖體脫氧核糖核酸內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的序列如SEQ ID N0:2所示。LH94ITS序列經(jīng)BLAST比對，與菌株Tulasnella calospora的ITS序列相似度85 經(jīng)ITS序列比對最相近物種為膠膜菌屬(Tulasnella),膠膜菌科(Tulasnellaceae),雞油菌目(Cantharellales)，傘菌綱(Agaricomycetes)，分類命名為 Tulasnella sp.，保藏號為CGMCC No:9247，鑒定為新的蘭花菌根真菌菌株。
[0039]實施例2
[0040]一、蘭花組培苗材料:采集蘭花“紅美人”的組培苗，選擇的組培苗基本一致，鮮重約為0.6g,株高約為8cm。
[0041]二、栽培基質(zhì):
[0042]選擇充分滅菌后晾干的草炭:黃沙以一定比例混合作為栽培基質(zhì)，具體配方為草炭:黃沙1:2，澆入MMN液體培養(yǎng)基，500mL/1500g栽培基質(zhì)，混合均勻后分裝至640mL栽培平內(nèi)，高壓滅菌后冷卻至常溫。在無菌條件下每瓶移栽3株蘭花苗，每個處理接種6瓶蘭花苗作為重復(fù)，置于組培室無菌培養(yǎng)。待生長一周后，檢查有無污染，在無污染的組培瓶內(nèi)分別接種供試菌株，即在每個組培瓶的基質(zhì)中央放置一直徑為0.5cm的菌餅，約在栽培基質(zhì)下Icm靠近苗的根部，繼續(xù)在培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)室條件為溫度22?26°C，光照周期16?10h/8?14h，光強度為2000?40001uX，培養(yǎng)80d后，統(tǒng)計幼苗生長量和侵染情況，接種菌株后幼苗平均侵染率、鮮重增長率、株高增長率和干鮮比均高于其他處理組和對照處理組(表 I)。
[0043]結(jié)果表明:本發(fā)明方法能快速菌根化蘭花無菌幼苗，接種的菌株對蘭花幼苗的生長具有抑制或促進的作用，其中接種菌株LH127對蘭花幼苗的生長影響不利，而接種菌株LH53(保藏號為CGMCC No:9222)和LH94對蘭花幼苗的生長具有一定程度上的促進作用。
[0044]表I不同接種處理組培養(yǎng)80d后蘭苗生長情況統(tǒng)計表
[0045]
接種菌株I平均侵染率(％ ) I鮮重增長率(％ ) I株高增長率(％ ) I干鮮比(％ )
LH127 33?742.0612.288.53
LH53 ?Ο92.0432.5710.80
LH9474.34100.9730.409.85
CKO61.0427.318.30
[0046]實施例3
[0047]蘭花組培苗材料:采集蘭花“紅美人”的組培苗，選擇的組培苗基本一致，鮮重約為
0.9g，株高約為10cm。試驗設(shè)置2種接種條件，一種采用本發(fā)明的方法，即栽培基質(zhì)及接種處理方法同實施案例3 ;另一種使用DE培養(yǎng)基(配方為:葡萄糖10克、胰蛋白胨5克、磷酸氫二鉀I克、硫酸鎂0.5克、孟加拉紅0.033克，瓊脂20克，蒸餾水定容至1000毫升，調(diào)節(jié)PH值至5.0，然后121°C高壓滅菌20分鐘，冷卻至60°C以下時倒平板待用)，接種方法類似本發(fā)明方法。本案例中接種菌株LH53，培養(yǎng)80d后統(tǒng)計幼苗生長量和侵染情況。結(jié)果表明:本發(fā)明方法中平均侵染率提高34.37，鮮重增長率提高13.05%，株高增長率提高14.83%,干鮮比提高0.10%均高于其他處理組和對照處理組(表2)。
[0048]結(jié)果表明:相比較DE共生培養(yǎng)方法，本發(fā)明方法具有接種后侵染率更高、對蘭花幼苗生長的促進作用更明顯等優(yōu)良，從而更有利于蘭花菌根化生長。
[0049]表2不同接種處理組培養(yǎng)80d后蘭苗生長情況統(tǒng)計表
[0050]
接種菌株LH53j平均侵染率(％ ) j鮮重增長率(％ )j株高增長率(％) j干鮮比(％)
本發(fā)明方法66.4862.5030.208?46
DE 共生培養(yǎng)方法 32.1149.4515.378?36
[0051]實施例4
[0052]蘭花組培苗材料為蘭花“紅美人”的組培苗，選擇的組培苗基本一致，鮮重約為
0.9g，株高約為10cm。栽培基質(zhì)及處理方法同實施案例3，培養(yǎng)80d后，統(tǒng)計幼苗生長量和侵染情況，接種菌株后幼苗鮮重增長量、株高增長量均高于其他處理組和對照處理組(表3)。
[0053]結(jié)果表明:本方法能快速菌根化蘭花無菌幼苗，接種的菌株對蘭花幼苗的生長具有抑制或促進的作用，其中接種菌株LH127對蘭花幼苗的生長影響不利，而接種菌株LH53(保藏號為CGMCC No:9222)和LH94對蘭花幼苗的生長具有一定程度上的促進作用。(如圖1、圖2和圖3所示)
[0054]表3不同接種處理組培養(yǎng)80d后蘭苗生長情況統(tǒng)計表
[0055]
接種菌株I平均侵染率(％ ) I鮮重增長率(％ ) I株高增長率(％) I干鮮比(％)
LH12713.2556.0816.858.75
LH5366.4862.5030.208?46
LH9473.0689.7622.918?26
CKO47.0622.458Γθ3
【權(quán)利要求】
1.一種蘭花無菌苗快速菌根化的方法，其特征在于包括以下步驟: 1)一個準(zhǔn)備栽培基質(zhì)及營養(yǎng)液的步驟，所述的栽培基質(zhì)由草炭和黃沙組成，所述的草炭和黃沙的體積比為1:1.5?3，所述的營養(yǎng)液是液體培養(yǎng)液，在所述的液體培養(yǎng)液中，葡萄糖的質(zhì)量百分比濃度為0.15% ； 2)—個對蘭花無菌苗進行接種的步驟，將組織培養(yǎng)生根蘭花幼苗或無菌播種蘭花小苗移栽入無菌處理的栽培基質(zhì)中，在幼苗根部附近接種至少一個菌塊，所述的菌塊為保藏號為CGMCC No: 9222或者CGMCC No: 9247的菌株，所述保藏號為CGMCC No: 9222的菌株屬于散囊菌綱(Eurot1mycetes)、散囊菌目(Onygenales)、畸枝霉屬),所述保藏號為 CGMCC No: 9247 的菌株屬于傘菌綱(Agaricomycetes),雞油菌目(Cantharellales),膠膜菌科(Tulasnellaceae),膠膜菌屬ijuleisrwll3 ),所述的菌塊直徑在I?1mm之間，所述的菌塊接種處距離根系0.3?2cm，接種后幼苗放置在培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是溫度22?26°C，光照周期16?10h/8?14h，光強度為2000?40001ux，培養(yǎng)時間是60?10cL
2.如權(quán)利I所述的蘭花無菌苗快速菌根化的方法，其特征在于:所述的液體培養(yǎng)液是MMN液體培養(yǎng)液，在所述的MMN液體培養(yǎng)液中，葡萄糖的質(zhì)量百分比濃度為0.15%。
3.如權(quán)利I所述的蘭花無菌苗快速菌根化的方法，其特征在于:所述的培養(yǎng)基質(zhì)中，所述的草炭和黃沙的體積比為1:2。
4.一種菌株，保藏號為CGMCC No:9222，屬于畸枝霉屬散囊菌目(Onygenales)、散囊菌綱(Eurot1mycetes),分類命名 ife7^ra/?cA<9asp.。
5.一種菌株，保藏號為CGMCC No:9247,屬于傘菌綱(Agaricomycetes),雞油菌目(Cantharellales),膠膜菌科(TulasnelIaceae),膠膜菌屬(Julasnella )，分類命名為Tulasnella sp.。
6.權(quán)利要求4所述的一種菌株在促進蘭花幼苗生長中的用途。
7.權(quán)利要求5所述的一種菌株在促進蘭花幼苗生長中的用途。
【文檔編號】C12N1/14GK104126508SQ201410356170
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月30日
【發(fā)明者】黃芳, 張春英, 王強, 謝軍峰, 楊慧麗, 魏翔鶯 申請人:上海市園林科學(xué)研究所