一種使煙草獲得馬鈴薯y病毒抗性的方法及vigs載體的制作方法
【專利摘要】一種使煙草獲得馬鈴薯Y病毒抗性的方法，該方法是首先制備含VIGS載體的根癌農(nóng)桿菌；該VIGS載體的靶標序列為馬鈴薯Y病毒CP序列，如Seq?ID?No.1所示；再于煙苗剪葉后，噴施上述根癌農(nóng)桿菌和PBNTRA6根癌農(nóng)桿菌的混合菌液，使根癌農(nóng)桿菌侵染剪葉煙苗，通過侵染將CP基因片段導入煙草。本發(fā)明同時提供一種以馬鈴薯Y病毒基因為靶標的上述VIGS載體。本發(fā)明以種植普通煙草為試材，以煙田危害廣泛的馬鈴薯Y病毒為靶標病毒進行具體實驗驗證，實驗數(shù)據(jù)顯示，導入CP基因的煙草獲得良好的PVY病毒抗性。
【專利說明】一種使煙草獲得馬鈴薯Y病毒抗性的方法及VIGS載體

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及利用RNA沉默技術誘導植物抗性技術，特別是一種使煙草獲得馬鈴薯Y病毒抗性的方法及VIGS載體。

【背景技術】
[0002]煙草是我國重要的經(jīng)濟作物。煙草馬鈴薯Y病毒病(Potato virus Y，PVY)是煙草上的最重要病害之一。根據(jù)近年調(diào)查發(fā)現(xiàn):煙草PVY的危害日益嚴重，防治困難，嚴重影響煙草的產(chǎn)量和品質(zhì)，已造成巨大的經(jīng)濟損失。目前生產(chǎn)上煙草PVY病毒病缺乏有效的防治措施，對煙草花葉病毒防效較好的藥劑(如寧南霉素、病毒A等)對煙草PVY的防治效果非常有限，煙草PVY無藥可防，導致農(nóng)民濫用藥、誤打藥，造成藥害和煙葉中農(nóng)藥殘留，污染環(huán)境，嚴重影響煙草產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，生產(chǎn)上迫切需要一種新的方法來有效防治煙草PVY，保障煙草的生產(chǎn)安全。病毒誘導的基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)應用于植物病毒病害的防治可能是解決此問題的有效途徑之一。
[0003]病毒誘導的基因沉默(Virus-1nduced gene silence, VIGS)是植物抗病毒侵染的一種自然機制。當病毒基因組cDNA導入植株并表達后，誘發(fā)RNA介導的防御機制(RNA-mediated deference, RMD),同時誘發(fā)與插入片段同源基因的表達沉默。早在20世紀20~30年代期間，人們就發(fā)現(xiàn)感染了病毒溫和株系的植株可以抵御隨后的溫和株系及與其親源關系相近的強毒株系病毒的侵染，即交叉保護現(xiàn)象。進一步研究發(fā)現(xiàn)，交叉保護現(xiàn)象是由于病毒誘導產(chǎn)生了 RNA沉默，使植株產(chǎn)生了對該病毒的抗性，即病毒誘導的基因沉默。后來在轉(zhuǎn)基因植株中出現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，即病毒接種的初期，病毒正常增殖，接種葉片表現(xiàn)出被病毒感染的癥狀。但隨著病毒在植株中的系統(tǒng)擴散，植株的新生葉片中雖僅含有少量的轉(zhuǎn)入基因，但表現(xiàn)出對該病毒的抗性。RNA沉默廣泛存在于真核生物中，包括真菌、藻類、昆蟲、植物、原生動物、無脊椎動物和脊椎動物等。大量實驗證明，病毒誘導的基因沉默是植物抗病的可能機制，VIGS與動物干擾(RNA interference, RNAi)機理上有許多相似之處，雙鏈(dsRNA)是基因沉默的關鍵因子，VIGS啟動時一般先形成雙鏈dsRNA，dsRNA首先被稱為DICER( —種RNA III酶)的核酸酶降解為不同長度的小RNA，然后這些小RNA分子與RNA誘導的沉默復合體(RNA-1nduced silencing complex, RISC)結合并引導RISC降解同源mRNA。21-24nt的小mRNA在調(diào)芐基因的表達和保護基因組中發(fā)揮著作用，這些小分子RNA能夠作為沉默信號分子被放大，且植物和動物體內(nèi)有不同的放大機制，通過提高dsRNA的量可以明顯增強VIGS的效果。將靶病毒基因片段插入VIGS病毒載體-煙草脆裂病毒(Tobacco rattle virus, TRV)，插入片段隨著TRV的侵染進入植物基因組，轉(zhuǎn)錄成dsRNA，隨TRV的在植物體內(nèi)的擴展產(chǎn)生大量dsRNA，病毒侵染植物，導致侵入病毒的靶向同源基因降解，抑制靶病毒的侵染。
[0004]Ratciff 等將其改造成 TRV 的 RNAl (PTV00)和 RNA2 (PBNTRA6) cDNA 的雙元表達載體，并利用TRV載體成功使轉(zhuǎn)基因煙草的綠色熒光蛋白基因沉默。TRV是目前應用最廣的VIGS載體，具有沉默效率高且效果持久、各種組織均可產(chǎn)生沉默等優(yōu)點，介導基因沉默同時不會帶來病毒誘導的癥狀，改造后的病毒能夠促進非病毒序列的插入以及對植物的后續(xù)感染，因而已被廣泛應用于煙草、番茄、馬鈴薯、碧冬茄、辣椒等多種茄科植物。
[0005]病毒外殼蛋白(coat protein, CP)是ORF編碼的最后一個蛋白，包被病毒RNA,對病毒起保護作用。CP分為三個區(qū)域:暴露在病毒粒子表面的N-端、C-端和中間區(qū)域。中間區(qū)域較為保守，與病毒組裝、胞間連絲排通極限及細胞到細胞的移動有關。CP的N-端區(qū)域最易變異，參與病毒在植物細胞間長距離的移動。CP的N-端包含一個保守的氨基酸序列(DAG)，該基序通過與HC-Pro互作參與和蚜蟲口針的結合，因此CP對蚜蟲的傳毒很重要。此外，CP還參與調(diào)控病毒RNA復制、擴增等過程。
[0006]選用對蚜蟲傳毒有重要影響的CP基因作為抗馬鈴薯Y病毒的靶標基因，干擾病毒的組裝、移動和傳播，達到防病毒效果。但到目前為止，通過基因沉默原理，特異性的沉默馬鈴薯Y病毒CP基因使煙草獲得馬鈴薯Y病毒抗性的方法還未見報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術問題是:針對上述現(xiàn)有技術的不足，提供一種使煙草獲得馬鈴薯Y病毒抗性的方法，以及該方法涉及到的VIGS載體。
[0008]為了解決上述技術問題，本發(fā)明所采用的技術方案是:一種使煙草獲得馬鈴薯Y病毒抗性的方法，該方法步驟如下:
[0009](I)制備含VIGS載體的根癌農(nóng)桿菌；該VIGS載體的靶標序列為馬鈴薯Y病毒CP序列，如Seq ID N0.1所示；
[0010](2)煙苗剪葉后噴施上述根癌農(nóng)桿菌和PBNTRA6根癌農(nóng)桿菌的體積比為1:1的混合菌液，使根癌農(nóng)桿菌侵染剪葉煙苗，通過侵染將CP基因片段導入煙草。
[0011]本發(fā)明同時提供一種以馬鈴薯Y病毒基因為靶標的VIGS載體，所述VIGS載體的靶標序列為CP序列，如Seq ID N0.1所示。
[0012]本發(fā)明還保護轉(zhuǎn)化有上述VIGS載體的菌株，其出發(fā)菌株為根癌農(nóng)桿菌GV3101。
[0013]本發(fā)明目的在于，以煙草馬鈴薯Y病毒脈壞死株系為材料，構建靶向CP基因的VIGS載體，誘發(fā)煙草自身防御機制的同時，干擾煙草馬鈴薯Y病毒在植物體內(nèi)的復制、運輸、致病性和傳播，并使病毒失去保護作用，達到防御煙草馬鈴薯Y病毒病的目的。本發(fā)明區(qū)別現(xiàn)有技術的思路是:構建的使煙草產(chǎn)生馬鈴薯Y病毒抗性的VIGS載體的沉默對象是入侵病毒的CP基因，而非植物本身基因。
[0014]本發(fā)明以種植普通煙草為試材，以煙田危害廣泛的馬鈴薯Y病毒為靶標病毒進行具體實驗驗證，實驗數(shù)據(jù)顯示，噴施菌液的煙草獲得良好的PVY病毒抗性?；诒景l(fā)明的構思，說明書中記載的實驗方法的指導以及本領域普通技術人員所具備的常規(guī)實驗技能，本領域技術人員可以將本發(fā)明的方法應用到多種煙草病毒病，這種應用都在本發(fā)明請求保護的范圍內(nèi)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是含PVY CP基因片段載體的構建。
[0016]圖2是含馬鈴薯Y病毒脈壞死株系馬鈴薯總RNA提取的電泳圖。
[0017]其中:從左至右，第1-6泳道:含馬鈴薯Y病毒脈壞死株系馬鈴薯總RNA提取，可以觀察到有明顯的兩條帶，證明RNA提取成功,可進行反轉(zhuǎn)錄；第7泳道:2k plus mark。
[0018]圖3是馬鈴薯Y病毒CP基因PCR擴增電泳圖。
[0019]其中，M:2k plus mark ；1:退火溫度50°C ；2:退火溫度52°C ；3:退火溫度54°C ；
4:退火溫度56°C ;5:退火溫度58°C ;6:陰性對照。
[0020]圖4是PTVOO-CP載體質(zhì)粒酶切電泳圖。
[0021]其中，I=PTVOO-CP 質(zhì)粒；2 =PTVOO-CP 質(zhì)粒酶切；M:2K plus mark。
[0022]圖5是大田驗證PTVOO-CP的轉(zhuǎn)入。
[0023]其中，1-2:陰性對照；3_24:田間試驗隨機采樣，反轉(zhuǎn)錄后用PTV00R/PTV00FPCR擴增；M:2K plus mark。
[0024]圖6是接種實驗。
[0025]其中，A、C表示含VIGS載體的被試煙苗，與正常煙苗無異；B、D表示噴施清水對照，有明顯的脈壞死、花葉癥狀。

【具體實施方式】
[0026]本發(fā)明中所有引物皆由上海生工生物工程公司合成。
[0027]實施例1PVY的CP基因的克隆及測序驗證
[0028]馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)是馬鈴薯Y病毒屬中的典型種，對馬鈴薯、煙草等重要經(jīng)濟作物危害相當嚴重，特別是PVY壞死株系(PVYN)可以造成寄主植物提前死亡而絕產(chǎn)。PVY-CP基因序列如SEQ ID N0.1所示。
[0029]本發(fā)明針對馬鈴薯Y病毒(PVY)脈壞死株系的CP基因設計引物:CPF: 5'-GAGGATCCGCATTCAACCAAATCTCAACA-3' (如 SEQ ID N0.2 所示)，CPR: 5' -TAGGTACCGCATAGCGAGCCAAACTTCC-3' (如SEQ ID N0.3所示)，下劃線部分為引入的酶切位點，采用PCR方法克隆PVY的CP基因，具體步驟如下:
[0030]提取含馬鈴薯Y病毒總RNA。通過瓊脂糖凝膠電泳和核酸定量儀檢測其質(zhì)量和濃度，見圖 2,通過反應體系(RNA50ng_5ug、Anchored oligo (dT) Primerlul>2*TS Rect1nMixlOul、Enzyme Mixlul > gDNA Removerlul、去 RNA 水補足至 20ul)進行反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。[0031 ] 利用引物CPF/CPR，以該馬鈴薯Y病毒cDNA為模板，進行PCR擴增，獲得PVY-CP基因片段，見圖3。其中，PCR反應體系為:10父？0?緩沖液2111、0嫩模板1111、(1見131.6111、上下游引物各0.8ul、Taq酶0.4ul、去離子水補足至20ul ；PCR反應條件為:94V 3min預變性，940C 30sec變性；50-68°C 30sec退火；72V Imin延伸(目的片段大于500 bp用I分鐘，小于 500 bp 用 40 秒)，35 個循環(huán)，72°C 10min，4°C保存。
[0032]對PCR產(chǎn)物(PVY-CP基因片段)進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收該PVY-CP基因片段，將該回收片段與載體Tl Cloning Vector (購自北京全式金生物技術有限公司)連接,取1ul連接產(chǎn)物,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞(感受態(tài)大腸桿菌TransTl ChemicallyCompetent Cell購自北京全式金生物技術有限公司)。根據(jù)載體上的氨芐青霉素抗性標記篩選陽性轉(zhuǎn)化子，利用克隆載體檢測引物(M13+:5’ -AGGGTTTTCCCAGTCACG-3’，如SEQ IDN0.4 所示，Ml3-:5’ -GTGTGAAATTGTTATCCGCTC-3’，如 SEQ ID N0.5 所示)，按前述的 PCR 擴增方法和體系篩選陽性克隆，其PCR產(chǎn)物大小約530bp，與CP基因片段長度基本一致。將陽性克隆送上海生工生物工程公司測序，結果與預期完全一致。
[0033]實施例2 VIGS載體(PTV00-CP重組載體)構建
[0034]病毒載體:煙草脆裂病毒(Tobacco rattle virus, TRV), Ratciff等將其改造成TRV的RNAl和RNA2 cDNA的雙元表達載體，通過進一步改造成PTVOO和PBNTRA6，本實驗亦有保存。
[0035]本發(fā)明中利用PTVOO —組酶切位點BamHI/Kpnl，將PCR擴增獲得的CP基因片段(530bp)連接到PTVOO酶切位點中。將PTVOO-CP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞中，擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒用于根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。酶切驗證如圖4，可結合參見圖1。測序結果顯示序列構建位置正確。操作如下:
[0036]步驟1.PTVOO載體片段酶切與回收
[0037]提取大腸桿菌中PTVOO質(zhì)粒(質(zhì)粒DNA的小量提取試劑盒)。取25ul質(zhì)粒，利用BamHI和KpnI內(nèi)切酶，采用10ul酶切體系，37°C酶切45min，回收酶切產(chǎn)物中3K左右長度的質(zhì)粒片段；采用DNA/RNA的紫外分光檢測瓊脂糖凝膠電泳分析判斷回收片段的濃度?；厥掌螛擞洖镻TVOO-BamHI/KpnI。
[0038]步驟2.PVY-CP基因PCR片段酶切與回收
[0039]分別純化回收PCR產(chǎn)物得CP基因片段。各取25ul回收片段，利用KpnI和BamHI內(nèi)切酶，采用10ul酶切體系，37°C酶切45min，回收酶切產(chǎn)物中對應SEQ ID N0.1所示序列長度的質(zhì)粒片段。取Iul回收片段，進行凝膠電泳判斷回收質(zhì)量。CP回收片段標記為CP-KpnI/BamH1.
[0040]步驟3.PTVOO-BamHI/KpnI和CP_KpnI/BamHI的連接與轉(zhuǎn)化大腸桿菌
[0041]取5ul CP-KpnI/BamHI 和 2ul PTVOO-BamHI/KpnI 以反應體系(10XT4 DNALigat1n Buffer4ul、T4 DNA Ligase (lU/ul) 2ul、酶切回收后 PCR 片段 10ul、載體(50-400ng)4ul、無菌去離子水補足到20ul)分別進行接連，用PCR儀進行控溫，16°C 16h。
[0042]將鏈接產(chǎn)物進入大腸桿菌感受態(tài)細胞，參照實施例1中的PCR擴增方法和反應體系，于篩選平板加入50mg/L卡那霉素(Kan)為抗生素篩選陽性轉(zhuǎn)化子，利用克隆載體檢測引物M13+/-檢測轉(zhuǎn)化子，選擇PCR檢測為陽性的轉(zhuǎn)化菌，測序驗證:得到重組載體，標記為PTV00-CP。
[0043]實施例3 PTV00-CP重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101
[0044]步驟1.根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞制備
[0045](I)挑選根癌農(nóng)桿菌GV3101菌落，接種于含有50mg/L的利福平的液體LB培養(yǎng)基中，28°C 200rpm 培養(yǎng) 16h。
[0046](2)取500ulGV3101菌液至50ml液體LB培養(yǎng)基中搖陪至0D600值為0.6左右。
[0047](3)將菌液冰浴 30min, 4°C。5000rmp 離心 1min,收集菌。
[0048](4)用40ml預冷的10%甘油重懸菌體，4°C 4500rmp，離心10min，收集菌體。
[0049](5)用20ml預冷的10%甘油重懸菌體，4°C 4500rmp，離心10min，收集菌體。
[0050](6)用1ml預冷的10%甘油重懸菌體，4°C 4500rmp，離心10min，收集菌體。
[0051](7)用2ml預冷的10%甘油重懸菌體，分裝每管50ml液氮速凍。_80°C保存。
[0052]步驟2.PTV00-CP 電擊轉(zhuǎn)化進 GV3101
[0053](I)從_80°C冰箱中取出感受態(tài)細胞，置于冰上解凍。
[0054](2)取Iul純化后的PTV00-CP質(zhì)粒于1.5ml的離心管中，將其和0.1cm的電擊杯一起置于冰上預冷。
[0055](3)將10ul解凍的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)移至1.5ml的離心管中，小心混勻，冰上放置1min0
[0056](4)打開電轉(zhuǎn)儀，調(diào)至Manal，使其電壓2.1kv0
[0057](5)將此混合物轉(zhuǎn)移至已預冷的點擊杯中，輕輕敲擊電擊杯，使其混合物均勻進入電擊杯的底部。
[0058](6)將電擊杯推入電轉(zhuǎn)化儀，按(4)中設定的參數(shù)，聽到蜂鳴后，向電擊杯中迅速加入1ml的SOC液體培養(yǎng)基，重懸細胞后，轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中。
[0059](7)28°C、200rmp 震蕩培養(yǎng) 3h。
[0060](8)取50_100ul菌液涂布在加有抗生素Kan和Rif的LB培養(yǎng)基上，平板正向放置Ih, 28°C倒置培養(yǎng)2-3天，直至菌落長出。
[0061](9)以實施例1中的PCR擴增方法和反應體系，利用克隆載體檢測引物M13+/-篩選陽性克隆，陽性克隆PCR產(chǎn)物大小約530bp，與預期大小一致，選擇PCR檢測為陽性轉(zhuǎn)化菌，測序驗證:得到根癌農(nóng)桿菌陽性菌液，標記PTV00-CP-GV3101。
[0062]實施例4含CP基因煙草的獲得
[0063]步驟1.PTVOO-CP導入被試煙草
[0064](l)28°C、200rmp 培養(yǎng) PTV00-CP-GV3101 和 PBNTRA6-GV3101 菌液，搖至 0D600 為
0.4-0.6 左右；
[0065](2)將 PTV00-CP-GV3101 和 PBNTRA6-GV3101 以 1:1 比例混合在一起，放置 30min ；
[0066](3)選取將剪葉的煙草苗，進行剪葉，噴施(2)中所述的混合菌液；
[0067](4) 1min后，用清水噴施，將葉片菌液洗凈；
[0068](5)每隔3天噴施I次，連續(xù)噴施3次。
[0069]步驟2.被試煙草RT-PCR檢測
[0070]待育苗盤煙草長至足夠移苗，提取被試煙苗RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用引物(PTV00R: 5' -TAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTC-3'，如 SEQ ID N0.6 所示；PTV00F: 5' -GGCMTCAGGTGCGACAATC-3'，如SEQ ID N0.7所示)，RT-PCR檢測CP基因是否成功轉(zhuǎn)入被試煙草中。結果如圖5所示,顯示CP基因成果轉(zhuǎn)入。
[0071]實施列5 VIGS技術處理煙草的抗性確定
[0072]本實驗原理，TRV侵染煙草引起防衛(wèi)反應，同時由于TRV的侵染將PVY CP基因?qū)霟煵?，啟動VIGS，PVY侵染煙草時引起CP基因同源降解，抑制PVY的侵染。
[0073]待田間煙草進入旺長初期，摩擦接種馬鈴薯Y病毒脈壞死株系病毒。
[0074](I)配置 0.01mol/L、ρΗ7.0 磷酸緩沖液。PBS 配置 KCl 0.2g、KH2PO40.2g、NaCl
8.0g、Na2HPO4.2H20 1.56g、溶于1000ml三蒸水中，分裝消毒，高壓鍋中121。。20min消毒；
[0075](2)病毒制備:取實驗室保存含馬鈴薯Y病毒脈壞死株系煙草發(fā)病葉片。按1:200比例加磷酸緩沖液，搗碎，雙層紗布過濾后立即使用；
[0076](3)借種方法:選取長成新葉，在表面均勻撒上碳化硅(600目)，用毛筆蘸取接種懸浮液，在葉面輕度摩擦造成微傷，每株接種I片葉，接種后20min用清水沖洗葉面上多余的病毒汁液。接種當天溫度為20-30°C，正常栽培管理；
[0077](4)病情調(diào)查與分級標準，根據(jù)國家病害調(diào)查標準GB/T 233222-2008。
[0078]

【權利要求】
1.一種使煙草獲得馬鈴薯Y病毒抗性的方法，其特征在于，該方法步驟如下: (1)制備含VIGS載體的根癌農(nóng)桿菌；該￥163載體的靶標序列為馬鈴薯Y病毒CP序列，如 Seq ID N0.1 所示； (2)煙苗剪葉后，噴施上述根癌農(nóng)桿菌和PBNTRA6根癌農(nóng)桿菌的體積比為1:1的混合菌液，使根癌農(nóng)桿菌侵染剪葉煙苗，通過侵染將CP基因片段導入煙草。
2.如權利要求1所述的一種使煙草獲得馬鈴薯Y病毒抗性的方法，其特征在于，所述VIGS載體為PTVOO-CP載體。
3.一種以馬鈴薯Y病毒基因為靶標的VIGS載體，其特征在于，所述VIGS載體的靶標序列為馬鈴薯Y病毒CP序列，如Seq ID N0.1所示。
4.含有權利要求3所述VIGS載體的菌株。
5.如權利要 求4所述的菌株，其出發(fā)菌株為根癌農(nóng)桿菌GV3101。
【文檔編號】C12N1/21GK104131032SQ201410362991
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月28日 優(yōu)先權日:2014年7月28日
【發(fā)明者】唐前君, 魏潤潔, 肖啟明, 蔡海林, 曾維愛, 楊紅武, 胡新喜, 劉雙清, 李魏, 周志成, 李迅 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學, 湖南省煙草公司長沙市公司