一種檢測不同流感病毒的引物組合物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測不同流感病毒的引物組合物及其應(yīng)用。本發(fā)明公開的一組引物組合物，由如下(1)-(4)任意所示的引物對組成：(1)SEQ?ID?No.1所示的DNA分子和SEQ?ID?No.2所示的DNA分子；(2)SEQ?ID?No.3所示的DNA分子和SEQ?ID?No.4所示的DNA分子；(3)SEQ?ID?No.5所示的DNA分子和SEQ?ID?No.6所示的DNA分子；(4)SEQ?ID?No.7所示的DNA分子和SEQ?ID?No.8所示的DNA分子。本發(fā)明對及時診斷、及時治療發(fā)病犬，及時預(yù)測流行趨勢，預(yù)防流感大流行，以及開展大規(guī)模犬流感病毒的流行病學(xué)監(jiān)測有著積極的意義。
【專利說明】—種檢測不同流感病毒的引物組合物及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種引物組合物及其應(yīng)用，特別涉及一種能同時檢測H3N2亞型犬流感病毒，H3N8亞型犬流感病毒，H1N1/2009亞型流感病毒和季節(jié)性H3N2亞型人流感病毒的引物組合物及其應(yīng)用，屬于病毒檢測領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002]犬對多種流感病毒均易感，由于犬和人的高度接觸性，流感病毒可能通過患犬而感染人類，威脅公共衛(wèi)生健康。病毒學(xué)和血清學(xué)調(diào)查表明我國犬群中主要流行的是犬H3N2、H1N1/2009和人季節(jié)性H3N2流感病毒。而歐美犬群中主要流行的是H3N8亞型犬流感病毒，也不排除其傳播到中國犬群的可能性。一旦引起犬流感病毒在犬中的大流行，將會對犬和人類造成不可估量的損失和傷害。因此，對這些病毒做好及時的監(jiān)測是非常有必要的。這就迫切需要建立一種能夠同時檢出這四種病毒的通用性良好的檢測方法。
[0003]傳統(tǒng)的流感病毒檢測方法為:采用雞胚進行病毒分離培養(yǎng)(需時2-3天)，然后采用血凝抑制試驗進行流感病毒亞型的鑒定(需時I天)。傳統(tǒng)的檢測方法費時、費力，不能做出快速而及時的診斷，而且由于病毒的變異頻率非常高，常常導(dǎo)致這些方法無法檢出病毒，出現(xiàn)漏檢的情況。因此，臨床上，迫切需要一種能快速鑒別診斷犬流感病毒的檢測方法，以確保可以及時發(fā)現(xiàn)及時治療，對預(yù)防犬流感的大流行以及人類感染具有重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種檢測不同流感病毒的引物組合物及其應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明提供一組引物組合物，由如下(1)-(4)任意所示的引物對組成:
[0006](I) SEQ ID N0.1 所示的 DNA 分子和 SEQ ID N0.2 所示的 DNA 分子；
[0007](2) SEQ ID N0.3 所示的 DNA 分子和 SEQ ID N0.4 所示的 DNA 分子；
[0008](3) SEQ ID N0.5 所示的 DNA 分子和 SEQ ID N0.6 所示的 DNA 分子；
[0009](4) SEQ ID N0.7 所示的 DNA 分子和 SEQ ID N0.8 所示的 DNA 分子；
[0010]所述SEQ ID N0.1 所示的 DNA 分子、SEQ ID N0.3 所示的 DNA 分子、SEQ ID N0.5所示的DNA分子、SEQ ID N0.7所示的DNA分子為上游引物；
[0011]所述SEQ ID N0.2 所示的 DNA 分子、SEQ ID N0.4 所示的 DNA 分子、SEQ ID N0.6所示的DNA分子、SEQ ID N0.8所示的DNA分子為下游引物；
[0012]所述SEQ ID N0.1所示的DNA分子和SEQ ID N0.2所示的DNA分子分別為擴增H3N8亞型犬流感病毒的上游引物和下游引物，所述SEQ ID N0.3所示的DNA分子和SEQ IDN0.4所示的DNA分子分別為擴增季節(jié)性H3N2亞型人流感病毒的上游引物和下游引物，所述SEQ ID N0.5所示的DNA分子和SEQ ID N0.6所示的DNA分子分別為擴增H1N1/2009亞型流感病毒的上游引物和下游引物，所述SEQ ID N0.7所示的DNA分子和SEQ ID N0.8所示的DNA分子分別為擴增H3N2亞型犬流感病毒的上游引物和下游引物；
[0013]所述H3N8 亞型犬流感病毒具體為 A/canine/California/70645-4/2006(H3N8)、A/canine/Colorado/6723-8/2008 (H3N8)、A/canine/Colorado/30604/2006 (H3N8)、A/canine/Colorado/17864/2006(H3N8)和 / 或A/canine/Colorado/8880/2006(H3N8)；
[0014]所述季節(jié)性H3N2亞型人流感病毒具體為A/Jiangxi/262/05 (H3N2)、A/Beijing-Xicheng/11542/2011 (H3N2)、A/Beijing-Huairou/1458/2012(H3N2)、A/Anhu1-Baohe/1127/2012(H3N2)和 / 或 A/Henan-Muye/35/2012(H3N2)；
[0015]所述H1N1/2009 亞型流感病毒具體為 A/California/04/2009 (HlNl)、A/canine/Beijing/cau9/2009 (HlNl)、A/canine/Beijing/cau2/2009 (HlNl)、A/Beijing/7/2009 (HlNl)和 / 或A/Beijing/132/2010(HlNl)；
[0016]所述H3N2 亞型犬流感病毒具體為 A/canine/Bei jing/364/2009 (H3N2)、A/canine/Beijing/359/2009 (H3N2)、A/canine/Bei jing/362/2009 (H3N2)、A/canine/Beijing/305/2009(H3N2)和 / 或 A/canine/Beijing/418/2010(H3N2)。
[0017]上述引物組合物中，所述引物由如下(I)-⑷所示的引物對組成:
[0018](I) SEQ ID N0.1 所示的 DNA 分子和 SEQ ID N0.2 所示的 DNA 分子；
[0019](2) SEQ ID N0.3 所示的 DNA 分子和 SEQ ID N0.4 所示的 DNA 分子；
[0020](3) SEQ ID N0.5 所示的 DNA 分子和 SEQ ID N0.6 所示的 DNA 分子；
[0021](4) SEQ ID N0.7 所示的 DNA 分子和 SEQ ID N0.8 所示的 DNA 分子。
[0022]一種檢測或輔助檢測樣品中是否含有H3N2亞型犬流感病毒、H3N8亞型犬流感病毒、季節(jié)性H3N2亞型人流感病毒和/或H1N1/2009亞型流感病毒的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護范圍，該試劑盒包含上述任一所述的引物組合物；
[0023]所述H3N2 亞型犬流感病毒具體為 A/canine/Bei jing/364/2009 (H3N2)、A/canine/Beijing/359/2009 (H3N2)、A/canine/Bei jing/362/2009 (H3N2)、A/canine/Beijing/305/2009(H3N2)和 / 或 A/canine/Beijing/418/2010(H3N2)；
[0024]所述H3N8 亞型犬流感病毒具體為 A/canine/California/70645-4/2006 (H3N8)、A/canine/Colorado/6723-8/2008 (H3N8)、A/canine/Colorado/30604/2006 (H3N8)、A/canine/Colorado/17864/2006(H3N8)和 / 或 A/canine/Colorado/8880/2006(H3N8)；
[0025]所述季節(jié)性H3N2亞型人流感病毒具體為A/Jiangxi/262/05 (H3N2)、A/Beijing-Xicheng/11542/2011 (H3N2)、A/Beijing-Huairou/1458/2012(H3N2)、A/Anhu1-Baohe/1127/2012(H3N2)和 / 或 A/Henan-Muye/35/2012(H3N2)；
[0026]所述H1N1/2009 亞型流感病毒具體為 A/California/04/2009 (HlNl)、A/canine/Beijing/cau9/2009 (HlNl)、A/canine/Beijing/cau2/2009 (HlNl)、A/Beijing/7/2009 (HlNl)和 / 或 A/Beijing/132/2010 (HlNl)。
[0027]一種檢測或輔助檢測樣品中是否含有H3N2亞型犬流感病毒、H3N8亞型犬流感病毒、季節(jié)性H3N2亞型人流感病毒和/或H1N1/2009亞型流感病毒的方法也屬于本發(fā)明的保護范圍，包括如下步驟:以樣品的cDNA為模板，以上述任一所述的引物組合物為引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物；如果PCR擴增產(chǎn)物中有148bp的片段，則樣品候選為含有H3N8亞型犬流感病毒的樣品，如果PCR擴增產(chǎn)物中有303bp的片段，則樣品候選為含有季節(jié)性H3N2亞型人流感病毒的樣品，如果PCR擴增產(chǎn)物中有407bp的片段，則樣品候選為含有H1N1/2009亞型流感病毒的樣品，如果PCR擴增產(chǎn)物中有544bp的片段，則樣品候選為含有H3N2亞型犬流感病毒的樣品；
[0028]所述148bp的片段為SEQ ID N0.1所示的DNA分子和SEQ ID N0.2所示的DNA分子為引物擴增得到的；
[0029]所述303bp的片段為SEQ ID N0.3所示的DNA分子和SEQ ID N0.4所示的DNA分子為引物擴增得到的；
[0030]所述407bp的片段為為SEQ ID N0.5所示的DNA分子和SEQ ID N0.6所示的DNA分子為引物擴增得到的；
[0031]所述544bp的片段為為SEQ ID N0.7所示的DNA分子和SEQ ID N0.8所示的DNA分子為引物擴增得到的。
[0032]上述方法中，所述PCR的體系為:ddH206.5 μ 1，2XPCR擴增緩沖液12.5 μ 1，上述任一所述的引物組合物中濃度為20μπ?Ο1/μ I的各上游引物各0.5 μ 1，上述任一所述的引物組合物中濃度為20 μ mol/μ I的各下游引物各0.5 μ 1，CDNA2 μ I ；
[0033]所述2 XPCR擴增緩沖液的商品名稱具體為2 XEasyTaq PCR SuperMix，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號為AS111，包含EasyTaq DNA聚合酶、dNTPs和優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液，濃度為2 X ；
[0034]所述PCR 的反應(yīng)程序為 94 °C 5min ；94°C 30s，57°C 30s, 72 °C 35s, 30 個循環(huán)；72°C 1min ；4°C 24h ；
[0035]所述H3N2 亞型犬流感病毒具體為 A/canine/Bei jing/364/2009 (H3N2)、A/canine/Beijing/359/2009 (H3N2)、A/canine/Bei jing/362/2009 (H3N2)、A/canine/Beijing/305/2009(H3N2)和 / 或 A/canine/Beijing/418/2010(H3N2)；
[0036]所述H3N8 亞型犬流感病毒具體為 A/canine/California/70645-4/2006 (H3N8)、A/canine/Colorado/6723-8/2008 (H3N8)、A/canine/Colorado/30604/2006 (H3N8)、A/canine/Colorado/17864/2006(H3N8)和 / 或 A/canine/Colorado/8880/2006(H3N8)；
[0037]所述季節(jié)性H3N2亞型人流感病毒具體為A/Jiangxi/262/2005A/Jiangxi/262/05(H3N2)、 A/Beijing_Xicheng/11542/2011(H3N2)、 A/Bei jing-Huairou/1458/2012 (H3N2) , A/Anhu1-Baohe/1127/2012 (H3N2)和 / 或 A/Henan-Muye/35/2012(H3N2)；
[0038]所述H1N1/2009 亞型流感病毒具體為 A/California/04/2009 (HlNl)、A/canine/Beijing/cau9/2009 (HlNl)、A/canine/Beijing/cau2/2009 (HlNl)、A/Beijing/7/2009 (HlNl)和 / 或 A/Beijing/132/2010 (HlNl)。
[0039]上述任一所述的引物組合物在制備檢測或輔助檢測樣品中是否含有H3N2亞型犬流感病毒、H3N8亞型犬流感病毒、季節(jié)性H3N2亞型人流感病毒和/或H1N1/2009亞型流感病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0040]上述試劑盒在制備檢測或輔助檢測樣品中是否含有H3N2亞型犬流感病毒、H3N8亞型犬流感病毒、季節(jié)性H3N2亞型人流感病毒和/或H1N1/2009亞型流感病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0041]上述任一所述的應(yīng)用中，所述H3N2亞型犬流感病毒為A/canine/Beijing/364/2009 (H3N2)、A/canine/Beijing/359/2009 (H3N2)、A/canine/Beijing/362/2009 (H3N2)、A/canine/Bei jing/305/2009(H3N2)和 / 或 A/canine/Beijing/418/2010(H3N2)；
[0042]所述H3N8 亞型犬流感病毒為 A/canine/California/70645_4/2006 (H3N8)、A/canine/Colorado/6723-8/2008 (H3N8)、A/canine/Colorado/30604/2006 (H3N8)、A/canine/Colorado/17864/2006(H3N8)和 / 或 A/canine/Colorado/8880/2006(H3N8)；
[0043]所述季節(jié)性H3N2亞型人流感病毒為A/Jiangxi/262/05 (H3N2)、A/Beijing-Xicheng/11542/2011 (H3N2)、A/Beijing-Huairou/1458/2012 (H3N2)、A/Anhu1-Baohe/1127/2012(H3N2)和 / 或 A/Henan-Muye/35/2012(H3N2)；
[0044]所述H1N1/2009 亞型流感病毒為 A/California/04/2009 (HlNl)、A/canine/Beijing/cau9/2009 (HlNl)、A/canine/Beijing/cau2/2009 (HlNl)、A/Beijing/7/2009 (HlNl)和 / 或 A/Beijing/132/2010 (HlNl)。
[0045]本發(fā)明提供了一組能同時檢測H3N2亞型犬流感病毒、H3N8亞型犬流感病毒、季節(jié)性H3N2亞型人流感病毒和H1N1/2009亞型流感病毒的引物組合物，并在此基礎(chǔ)上建立了一種能同時檢測這四種病毒的多重RT-PCR方法。本發(fā)明提供的方法較血凝抑制傳統(tǒng)方法更快捷，且覆蓋范圍廣，不僅能夠檢出經(jīng)典類型毒株，還能檢出近年來最新的流行變異株，具有很好的覆蓋性和通用性。本發(fā)明的方法不僅可以檢測臨床采集的樣品如鼻咽拭子，而且也可對病毒尿囊液進行檢測，操作簡單、容易推廣，便于基層操作和應(yīng)用，成為犬流感病毒診斷和流行病學(xué)調(diào)查的有用檢測工具。本發(fā)明對及時診斷、及時治療發(fā)病犬，及時預(yù)測流行趨勢，預(yù)防流感大流行，以及開展大規(guī)模犬流感病毒的流行病學(xué)監(jiān)測有著積極的意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0046]圖1為特異性檢測。
[0047]圖2為靈敏度檢測。
[0048]圖3為敏感性檢測。

【具體實施方式】
[0049]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0050]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0051]Trizol 購自 invitrogen 公司，產(chǎn)品目錄號為 15596-026。
[0052]Ribolock Rnase Inhibitor 購自 fermentas 公司，產(chǎn)品目錄號為 E00381。
[0053]dNTP Mix購自fermentas公司，產(chǎn)品目錄號為ROl9I。
[0054]RevertAid Reverse Transcriptase 購自 fermentas 公司，產(chǎn)品目錄號為 EP0441,內(nèi)含 5 X React1n Buffer (pH 8.3 的 250 mM Tris-HCl, 250 mM KCl, 20 mM MgCl2, 50mMDTT)。
[0055]2XEasyTaq PCR SuperMix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號為AS111，包含EasyTaq DNA聚合酶、dNTPs和優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液，濃度為2X。
[0056]H3N2 亞型犬流感病毒 A/canine/Bei jing/364/2009 (H3N2)、A/canine/Beijing/359/2009 (H3N2)、A/canine/Beijing/362/2009 (H3N2)、A/canine/Beijing/305/2009 (H3N2)、A/canine/Bei jing/418/2010 (H3N2)在文獻“Sun Y., SunS., Ma J., Tan Y., Du L., Shen Y., Mu Q., Pu J., Lin D., and Liu J..1dentificat1n andcharacterizat1n of avian—origin H3N2 canine influenza viruses in northernChina during 2009-2010.Virology 435 (2)，301-307 (2013) ” 中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。
[0057]季節(jié)性H3N2 亞型人流感病毒 A/Jiangxi/262/05(H3N2)在文獻“Sun Y.，BiY.，Pu J., Hu Y.，Wang J.，Gao H.，Liu L，Xu Q., Tan Y.，Liu Μ.，Guo X.，Yang H.，andLiu J.Guinea pig model for evaluating the potential public health risk ofswine and avian influenza viruses.Plos One 5 (11)，el5537 (2010)，，中公開過，A/Beijing-Xicheng/11542/2011 (H3N2)、A/Bei jing-Huairou/1458/2012 (H3N2)、A/Anhu1-Baohe/1127/2012(H3N2) ^A/Henan-Muye/35/2012 (H3N2)在文獻“黃維娟，成艷輝，李希妍，趙翔，郭俊峰，王釗，譚敏菊，李明，隋竑豉，隗合江，陳瑤瑤，肖寧，藍雨，王大燕，舒躍龍.2011-2012年度中國H3N2亞型流感病毒病原學(xué)特征分析[J].病毒學(xué)報，2013，29 (3): 258-264”中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。
[0058]H3N8 亞型犬流感病毒 A/canine/California/70645-4/2006 (H3N8)，A/canine/Colorado/6723-8/2008 (H3N8)，A/canine/Colorado/30604/2006 (H3N8)，A/canine/Colorado/17864/2006(H3N8)和 A/canine/Colorado/8880/2006(H3N8)在文獻 “Rivailler，P.，Perry, 1.A.，Jang, Y.，Davis, C.T.，Chen L.M.，Dubovij E.J.，andDonisj R.0.Evolut1n of canine and equine influenza(H3N8)viruses co-circulatingbetween 2005 and 2008.Virology 408 (I)，71-79 (2010) ” 中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。
[0059]H1N1/2009 亞型流感病毒 A/California/04/2009 (HlNl)在文獻 “Garten，R.J.，Davis, C.T.，Russell, C.A.，Shuj B.，Lindstromj S.，Balishj A.，Sess1ns, W.M.，Xu，X.，Skepnerj E.，Deydej V.，Okomo-Adhiamboj M.，Gubareva, L.，Barnes, J.，Smith, C.B.，Emery, S.L.，Hillman, M.J.，Rivaillerj P.，Smagalaj J.，de Graafj M.，Burke, D.F.，F(xiàn)ouchierj R.A.，Pappas, C.，Alpuche-Arandaj C.M.，Lopez-GatelI, H.，Olivera，H.，Lopez, 1.，Myers, C.A.，F(xiàn)aixj D.，Blair, P.J.，Yuj C.，Keene, K.M.，Dotson, P.D.Jr.，Boxrudj D.，Sambolj A.R.，Abidj S.H.，St George, K.，Bannermanj T.，Moore, A.L.，Stringer, D.J.，Blevins, P.，Demmler-Harrisonj G.J.，Ginsberg, M.，Krinerj P.，Waterman, S.，Smolej S.，Guevara, H.F.，Belongiaj E.A.，Clark, P.A.，Beatrice, S.T.，Donisj R.，Katz, J.，F(xiàn)inellij L.，Bridges, C.B.，Shaw, M.，Jerniganj D.B.，Uyekij T.M.，Smith, D.J.，Klimov, A.1.and Coxj N.J.Antigenic and genetic characteristicsof swine-origin 2009 A(HlNl) influenza viruses circulating in humans.Science 325 (5937)，197-201 (2009)” 中公開過，A/canine/Beijing/cau2/2009(HlNl)和 A/canine/Beijing/cau9/2009 (HlNl)在文獻“Degui Lin，Shasha Sun,LijieDuj Jingjiao Ma，Linghong Fan, Juan Pu，Yipeng Sun, Jingyi Zhao, Honglei Sunand Jinhua Liu.Natural and experimental infect1n of dogs with pandemicH1N1/2009 influenza virus.Journal of General Virology93，119-123(2012)” 中公開過，A/Beijing/7/2009 (HlNl)和 A/Bei jing/132/2010 (HlNl)在文獻“Yipeng Sun, QiXuj Ye Shen，Linqing Liuj Kai Wei，Honglei Sun,Juan Pu,Kin-Chow Chang，JinhuaLiua.Naturally Occurring Mutat1ns in the PA Gene Are Key Contributorsto Increased Virulence of Pandemic H1N1/09 Influenza Virus in Mice.J.Virol.2014, 88(8):4600.”中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。
[0060]犬瘟病毒(OTV-WZ)在文獻“劉巧榮，包新奇，孫明，王芳，喬明明，李佳，陳曦，秦亞嫂，陳西釗.感染CDV的犬病料N、H、F基因的克隆與序列分析[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2011,21(4):37-41”中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。
[0061]犬細小病毒(CPV/BJ005/07)在文獻“宋永奇，李玉燕，呂艷麗，韓博.犬細小病毒VP2基因序列分析[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2008，24(7):26-31”中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。
[0062]實施例1、臨床樣品檢測
[0063]一、臨床樣品的采集
[0064]臨床棉拭子:鼻拭子或咽拭子。4°C保存，24小時內(nèi)送實驗室檢測。
[0065]二、樣品處理
[0066]將棉拭子分別浸入ImlPBS溶液(含I萬單位青霉素、鏈霉素)中，充分搶動，抒干后棄去拭子，將溶液4°C 8000rpm離心5min，取上清液為樣本液，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0067]三、陽性對照為臨床感染H3N2亞型犬流感病毒和實驗分別感染H3N8亞型犬流感病毒、H1N1/2009亞型流感病毒或季節(jié)性H3N2亞型人流感病毒的犬的鼻拭子或咽拭子。4°C保存，24小時內(nèi)送實驗室檢測，按照步驟二的方法進行處理。陰性對照為滅菌雙蒸水，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0068]四、設(shè)計并合成針對H3N2亞型犬流感病毒，H3N8亞型犬流感病毒，H1N1/2009亞型流感病毒和季節(jié)性H3N2亞型人流感病毒HA基因高度保守區(qū)域的引物，如表1所示。
[0069]表1引物組合物
[0070]

【權(quán)利要求】
1.一組引物組合物，由如下(1)-(4)任意所示的引物對組成: (1)SEQ ID N0.1所示的DNA分子和SEQ ID N0.2所示的DNA分子； (2)SEQ ID N0.3所示的DNA分子和SEQ ID N0.4所示的DNA分子； (3)SEQ ID N0.5所示的DNA分子和SEQ ID N0.6所示的DNA分子； (4)SEQ ID N0.7所示的DNA分子和SEQ ID N0.8所示的DNA分子； 所述SEQ ID N0.1所示的DNA分子、SEQ ID N0.3所示的DNA分子、SEQ ID N0.5所示的DNA分子、SEQ ID N0.7所示的DNA分子為上游引物； 所述SEQ ID N0.2所示的DNA分子、SEQ ID N0.4所示的DNA分子、SEQ ID N0.6所示的DNA分子、SEQ ID N0.8所示的DNA分子為下游引物； 所述SEQ ID N0.1所示的DNA分子和SEQ ID N0.2所示的DNA分子分別為擴增H3N8亞型犬流感病毒的上游引物和下游引物，所述SEQ ID N0.3所示的DNA分子和SEQ ID N0.4所示的DNA分子分別為擴增季節(jié)性H3N2亞型人流感病毒的上游引物和下游引物，所述SEQID N0.5所示的DNA分子和SEQ ID N0.6所示的DNA分子分別為擴增H1N1/2009亞型流感病毒的上游引物和下游引物，所述SEQ ID N0.7所示的DNA分子和SEQ ID N0.8所示的DNA分子分別為擴增H3N2亞型犬流感病毒的上游引物和下游引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物組合物，其特征在于:所述引物組合物由如下(1)-(4)所示的引物對組成: (1)SEQ ID N0.1所示的DNA分子和SEQ ID N0.2所示的DNA分子； (2)SEQ ID N0.3所示的DNA分子和SEQ ID N0.4所示的DNA分子； (3)SEQ ID N0.5所示的DNA分子和SEQ ID N0.6所示的DNA分子； (4)SEQ ID N0.7所示的DNA分子和SEQ ID N0.8所示的DNA分子。
3.一種檢測或輔助檢測樣品中是否含有H3N2亞型犬流感病毒、H3N8亞型犬流感病毒、季節(jié)性H3N2亞型人流感病毒和/或H1N1/2009亞型流感病毒的試劑盒，該試劑盒包含權(quán)利要求I或2所述的引物組合物。
4.一種檢測或輔助檢測樣品中是否含有H3N2亞型犬流感病毒、H3N8亞型犬流感病毒、季節(jié)性H3N2亞型人流感病毒和/或H1N1/2009亞型流感病毒的方法，包括如下步驟:以樣品的cDNA為模板，以權(quán)利要求1或2所述的引物組合物為引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物；如果PCR擴增產(chǎn)物中有148bp的片段，則樣品候選為含有H3N8亞型犬流感病毒的樣品，如果PCR擴增產(chǎn)物中有303bp的片段，則樣品候選為含有季節(jié)性H3N2亞型人流感病毒的樣品，如果PCR擴增產(chǎn)物中有407bp的片段，則樣品候選為含有H1N1/2009亞型流感病毒的樣品，如果PCR擴增產(chǎn)物中有544bp的片段，則樣品候選為含有H3N2亞型犬流感病毒的樣品； 所述148bp的片段為以SEQ ID N0.1所示的DNA分子和SEQ ID N0.2所示的DNA分子為引物擴增得到的； 所述303bp的片段為以SEQ ID N0.3所示的DNA分子和SEQ ID N0.4所示的DNA分子為引物擴增得到的； 所 述407bp的片段為以SEQ ID N0.5所示的DNA分子和SEQ ID N0.6所示的DNA分子為引物擴增得到的； 所述544bp的片段為以SEQ ID N0.7所示的DNA分子和SEQ ID N0.8所示的DNA分子為引物擴增得到的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述PCR的體系為:ddH206.5 μ 1，2XPCR擴增緩沖液12.5 μ 1，權(quán)利要求1或2所述的引物組合物中濃度為20μπιο1/μ I的各上游弓丨物各0.5 μ 1，權(quán)利要求1或2所述的引物組合物中濃度為20μπ?Ο1/μ I的各下游引物各0.5 μ 1，CDNA2 μ I ； 所述2XPCR擴增緩沖液的商品名稱具體為2XEasyTaq PCR SuperMix，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號為AS111，包含EasyTaq DNA聚合酶、dNTPs和優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液，濃度為2 X ； 所述 PCR 的反應(yīng)程序為 94 V 5min ；94 V 30s, 57 V 30s, 72 V 35s, 30 個循環(huán)；72°C 1min ；4°C 24h。
6.權(quán)利要求1或2所述的引物組合物在制備檢測或輔助檢測樣品中是否含有H3N2亞型犬流感病毒、H3N8亞型犬流感病毒、季節(jié)性H3N2亞型人流感病毒和/或H1N1/2009亞型流感病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求3所述的試劑盒在制備檢測或輔助檢測樣品中是否含有H3N2亞型犬流感病毒、H3N8亞型犬流感病毒、季節(jié)性H3N2亞型人流感病毒和/或H1N1/2009亞型流感病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/11GK104131009SQ201410363681
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月28日
【發(fā)明者】孫怡朋, 劉金華, 王倩 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)