斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白e基因序列及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列及其制備方法和用途，旨在提供一種斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列，該序列用于檢測腫瘤是否擴散或者作為靶位點設(shè)計治療腫瘤的藥物或者調(diào)節(jié)斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育過程，有利于人工催熟斑節(jié)對蝦細胞；其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；制備方法通過提取斑節(jié)對蝦總RNA，來cDNA第一鏈的合成，再以合成的第一鏈cDNA作為模板，利用cDNA末端快速擴增技術(shù)對目的基因的5ˊ和3ˊ末端進行PCR擴增；然后對斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因的測定，最后以進行斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因分布和表達測定；屬于分子生物學中基因克隆領(lǐng)域。
【專利說明】斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列及其制備方法和用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種細胞周期蛋白E基因序列，具體地說，是涉及一種斑節(jié)對蝦細胞 周期蛋白E基因序列，本發(fā)明還涉及該斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，屬于 分子生物學中基因克隆領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 細胞周期蛋白E是細胞周期調(diào)控過程中一個非常重要的蛋白，主要在細胞G1期與 CDK7結(jié)合并起作用，周期蛋白E屬于G1期的正調(diào)節(jié)因子，主要對G1期到S期的過渡進行調(diào) 控，與同作為G1/S轉(zhuǎn)換點功能調(diào)控的因子CyclinD、抑癌基因視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤蛋白 (retinob lastoma protein，Rb)、轉(zhuǎn)錄因子 E2F、抑癌基因 p53、KIP 家族、CDK2、4、5 等相互 作用共同決定細胞周期的正常進行。周期蛋白E在進入S期后便立即被泛素化降解。
[0003] 目前發(fā)現(xiàn)的Cyclin家族成員可分為10大類：A?J，包括亞型共15種，其中周期 蛋白E是參與細胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換的重要正性調(diào)節(jié)因子且在人的研究中最為廣泛，大多集 中于周期蛋白E對腫瘤治療方面。近些年來，各國對腫瘤的研究逐漸集中在細胞周期調(diào)控 方面，而周期蛋白E與CDK2結(jié)合后的復合物在周期調(diào)控方面起著舉足輕重的作用，特別是 其涉及的G1期磷酸化作用，更是當前的研究熱點。
[0004] 隨著基因克隆技術(shù)的發(fā)展，目前周期蛋白E基因在很多物種中相繼被克隆出來， 如 Homo sapiens :人（AAM54043. 1) ;Danio rerio:斑馬魚（ΝΡ_001002075· 1) ;Megachile rotundata :切葉蜂（ΧΡ_003700054· 1) ;Carassius auratus:鯽魚（BAA85846. 1)等，但在對 蝦中研究較少。
[0005] 目前斑節(jié)對蝦的養(yǎng)殖過程存在雌性對蝦性腺發(fā)育不同步，且人工催熟效果差的問 題，而細胞周期調(diào)控的研究對探討卵巢發(fā)育機理即雌蝦性成熟問題具有相當重要的意義， 所以，期望通過對周期蛋白E的研究為發(fā)現(xiàn)新的催熟方法提供一定的理論支持。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對上述問題，本發(fā)明的以實驗室高通量測序獲得的EST序列為基礎(chǔ)設(shè)計的PCR 擴增引物，并通過RACE技術(shù)克隆到斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因的全表達序列，有利于人 工催熟斑節(jié)對蝦。
[0007] 為解決前一技術(shù)問題，本發(fā)明提供的第一個技術(shù)方案是這樣的：該斑節(jié)對蝦細胞 周期蛋白E基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0 :1所示。
[0008] 本發(fā)明提供的后一技術(shù)方案是這樣的：該斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制 備方法，依次包括下述方法 ：
[0009] 1)總RNA的提取
[0010] 對斑節(jié)對蝦解剖并取出性腺混合液，將性腺混合液于Trizol中勻漿，提取斑節(jié)對 蝦總RNA并用DEPC水懸浮，保存；
[0011] 2)cDNA第一鏈的合成
[0012] 將步驟1)中的斑節(jié)對奸性腺總RNA與反轉(zhuǎn)錄引物混合，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成 cDNA第一鏈；
[0013] 3)斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因的PCR擴增、克隆
[0014] 以步驟1)中合成的第一鏈cDNA作為模板，利用cDNA末端快速擴增法對目的基因 的5 z和:T末端進行PCR擴增；
[0015] 其中：
[0016] 在:T RACE中，利用降落PCR方法，用接頭引物和cycE-Fl、cycE-F2進行PCR擴 增；
[0017] 在5 z RACE中，首先利用末端轉(zhuǎn)移酶在cDNA末端加上polyC尾巴后，以加尾的 cDNA為模板，以cycE-Rl和oligo-dG為引物進行一次PCR，所得PCR產(chǎn)物取用cycE-R2和 oligo-dG進行二次PCR擴增；
[0018] 4)對斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因的測定
[0019] 所得到的PCR產(chǎn)物在分離檢測后，再將PCR產(chǎn)物純化，克隆到pMD-18T載體中，轉(zhuǎn) 化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，測序；
[0020] 5)斑節(jié)對奸細胞周期蛋白E的分布和表達
[0021] a)提取斑節(jié)對奸不同組織的RNA，按照PremeScriptTM RT reagent Kit操作手冊 進行反轉(zhuǎn)錄為cDNA模板；將不同組織樣品cDNA稀釋作為模板，采用SYBR Green I染料法， 在Eppendorf熒光定量PCR儀上進行擴增和數(shù)據(jù)分析；
[0022] b)依照 TaKaRa SYBR? PrimeScriptTM RTPCR Kit 試劑盒說明書進行 PCR 反應(yīng)， 再采用相對ACT法分析Pmcyclin E基因在各樣品中的相對表達量；
[0023] c)分別提取實驗室保存的經(jīng)過MIH處理及眼柄切除手術(shù)的卵巢RNA，然后按照上 述a)所示方法進行反轉(zhuǎn)錄及熒光定量。
[0024] 進一步的，上述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，步驟2)所述的 反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄引物的序列為：5>GGCCACGCGACTAGTAC(T) 16〈3。
[0025] 進一步的，上述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，步驟2)所述的 反轉(zhuǎn)錄酶為M-MLV。
[0026] 進一步的，上述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，步驟2)所述的 接頭引物的序列為：5>GGCCACGCGTCGACTAGTAC〈3。
[0027] 進一步的，上述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，步驟2)所述的 反應(yīng)條件：42°C 60min，70°C 15min。
[0028] 進一步的，上述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，步驟3)所述的
[0029] cycE-Fl ：5>ACGCCAACCTGACTACCT<3 ；
[0030] cycE-F2 ：5>CTACAGACTACATAGACCGCTAC<3 ；
[0031] cycE-Rl ：5>CTGGTGGACTCGGGTGTTGG<3 ；
[0032] cycE-R2 :5>CTGAATTTGTGCCATGTTTC〈3。
[0033] 進一步的，上述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，步驟3)所述的 3 ' RACE 中反應(yīng)條件：94°C，5min ;94°C，45s ;6(TC，30s ;72°C，45s ;35cycles ;72°C，10min。
[0034] 進一步的，上述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，步驟3)所述 的在 5 z RACE 中反應(yīng)條件：94°C，5min ;94°C，45s ;61°C，30s ;72°C，45s ;35cycles ;72°C， 10min〇
[0035] 進一步的，上述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，步驟b)中PCR 反應(yīng)使用引物為：
[0036] cyclinE-FFl ：5>AAAACCGATGAGAAGACT<3 ；
[0037] cyclinE-FF2 ：5>TCCTACAGAAGACACCCT<3 ；
[0038] RTEF-F ：5>AAGCCAGGTATGGTTGTCAACTTT<3 ；
[0039] RTEF-R :5>CGTGGTGCATCTCCACAGACT〈3。
[0040] 該斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列用于檢測腫瘤是否擴散或者作為設(shè)計治療 腫瘤藥物的靶位點或者調(diào)節(jié)斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育過程。
[0041] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的技術(shù)方案具有如下優(yōu)點：
[0042] 本發(fā)明的是以實驗室高通量測序獲得的EST序列為基礎(chǔ)設(shè)計的PCR擴增引物，并 通過RACE技術(shù)克隆到斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因的全表達序列；此外通過斑節(jié)對蝦細胞 周期蛋白E基因設(shè)計熒光定量PCR引物，對周期蛋白E基因在斑節(jié)對蝦卵巢各個發(fā)育時相 的分布情況及在經(jīng)過MIH注射或眼柄切除手術(shù)的卵巢組織中的分布情況進行研究分析。不 僅為研究斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E在卵巢發(fā)育中的作用奠定基礎(chǔ)，而且可以為斑節(jié)對蝦養(yǎng) 殖過程中所出現(xiàn)的性腺發(fā)育參差不齊的情況從分子層面提供理論基礎(chǔ)，并且對斑節(jié)對蝦卵 巢發(fā)育過程中起重要作用，有利于人工催熟斑節(jié)對蝦，節(jié)約培養(yǎng)成本。
[0043] 細胞周期蛋白E作為細胞周期調(diào)控中一個重要的蛋白，在細胞分裂、細胞周期調(diào) 控、腫瘤發(fā)生等方面起重要作用，可以作為腫瘤是否擴散的重要檢測指標，可以作為靶位點 來設(shè)計治療腫瘤的藥物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0044] 圖1是斑節(jié)對蝦周期蛋白E基因 mRNA組織表達模式；
[0045] 垂直線表示平均值土標準誤差（重復樣品數(shù)=4)，不同的字母表示存在顯著性差 異（Ρ〈0· 05)。
[0046] 圖2是細胞eye 1 in Ε分別在經(jīng)過ΜΙΗ注射、眼柄切除的斑節(jié)對蝦卵巢中的表達情 況；垂直線表示平均值土標準誤差（重重復樣品數(shù)=3)。

【具體實施方式】
[0047] 為了更好的理解、實施本發(fā)明的權(quán)利要求，下面結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明的權(quán)利 要求做進一步的詳細說明，但本發(fā)明并不限于下述實施例，而是以權(quán)利要求為限。
[0048] 1、總RNA的提取
[0049] 試驗所用的雌雄斑節(jié)對蝦（鮮重200g左右）均取自于海南三亞，室內(nèi)水族箱內(nèi) 暫養(yǎng)三天，水溫控制在24?25°C之間。取所需性腺組織約50mg用剪刀剪碎加入lml的 Trizol (美國invitrogen公司）進行勻楽，按Trizol試劑盒使用手冊提取斑節(jié)對奸總RNA 并用DEPC水懸浮，電泳觀察所提取RNA的完整性，并置于-80°C保存。
[0050] 總RNA具體提取步驟：
[0051] (1)加 200yL 預冷氯仿，渦旋振蕩 lmin 混勻，靜置 5min，12000g，4°C，15min。
[0052] (2)取三分之一上清溶液，加入等體積的預冷的異丙醇，顛倒混勻，冰上放置 lOmin，12000g，4°C，lOmin。
[0053] (3)倒掉上清，加 lmL75%乙醇重懸沉淀，7500g，4°C離心5min。
[0054] (4)重復步驟3 -次，并用槍頭吸出上清，干燥5?lOmin
[0055] (5)加 40 μ LddH20 溶解沉淀
[0056] (6) RNA的電泳檢測：將電泳槽、梳齒等置于3% H202過夜浸泡，配置1. 5%的瓊脂 糖凝膠（用〇. 5 X TBE溶液配制），取5 μ L總RNA加1 μ L上樣緩沖液，進行30min電泳檢 測，對提取的RNA質(zhì)量進行測定。
[0057] 2、cDNA第一鏈的合成
[0058] 取步驟1中斑節(jié)對蝦性腺總RNA與反轉(zhuǎn)錄引物（5>GGCCACGCGACTAGTAC(T) 16〈3) (10pmol/L)混合在反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV，Promega，USA)的作用下合成cDNA -鏈。
[0059] cDNA的反轉(zhuǎn)錄實驗按照相關(guān)試劑盒（PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa))操作方法進行，具體如下：

【權(quán)利要求】
1. 一種斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
2. 制備權(quán)利要求1所述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列的方法，其特征在于，依次 包括下述方法： 1) 總RNA的提取 對斑節(jié)對蝦解剖并取出性腺混合液，將性腺混合液于Trizol中勻漿，提取斑節(jié)對蝦總 RNA并用DEPC水懸浮，保存； 2. cDNA第一鏈的合成 將步驟1)中的斑節(jié)對奸性腺總RNA與反轉(zhuǎn)錄引物混合，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA 第一鏈； 3) 斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因的PCR擴增、克隆 以步驟1)中合成的第一鏈cDNA作為模板，利用cDNA末端快速擴增法對目的基因的 5 z和:T末端進行PCR擴增； 其中： 在:T RACE中，利用降落PCR方法，用接頭引物和cycE-Fl、cycE-F2進行PCR擴增； 在5 z RACE中，首先利用末端轉(zhuǎn)移酶在cDNA末端加上polyC尾巴后，以加尾的cDNA為 模板，以cycE-Rl和oligo-dG為引物進行一次PCR，所得PCR產(chǎn)物取用cycE-R2和oligo-dG 進行二次PCR擴增； 4) 對斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因的測定 所得到的PCR產(chǎn)物在分離檢測后，再將PCR產(chǎn)物純化，克隆到pMD-18T載體中，轉(zhuǎn)化大 腸桿菌DH5ci感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，測序； 5) 斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E的分布和表達 a)提取斑節(jié)對奸不同組織的RNA，按照PremeScriptTM RT reagent Kit操作手冊進行 反轉(zhuǎn)錄為cDNA模板；將不同組織樣品cDNA稀釋作為模板，采用SYBR Green I染料法，在 Eppendorf熒光定量PCR儀上進行擴增和數(shù)據(jù)分析； 用相對ACT法分析Pmcyclin E基因在各樣品中的相對表達量； c)分別提取實驗室保存的經(jīng)過MIH處理及眼柄切除手術(shù)的卵巢RNA，然后按照上述a) 所示方法進行反轉(zhuǎn)錄及突光定量。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，其特征在于， 步驟2)所述的反轉(zhuǎn)錄引物的序列為：5>GGCCACGCGACTAGTAC(T)16〈3。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，其特征在于， 步驟2)所述的反轉(zhuǎn)錄酶為M-MLV。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，其特征在于， 步驟2)所述的反應(yīng)條件：42°C 60min，70°C 15min。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，其特征在于， 步驟 3)所述的 cycE-Fl :5>ACGCCAACCTGACTACCT〈3 ; cycE-F2 ：5>CTACAGACTACATAGACCGCTAC<3 ； cycE-Rl ：5>CTGGTGGACTCGGGTGTTGG<3 ； cycE-R2 :5>CTGAATTTGTGCCATGTTTC〈3。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，其特征 在于，步驟 3)所述的 3 z RACE 中反應(yīng)條件：94°C，5min ;94°C，45s ;60°C，30s ;72°C，45s ; 35cycles ;72°C,10min〇
8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，其特征在 于，步驟 3)所述的在 5 z RACE 中反應(yīng)條件：94°C，5min ;94°C，45s ;61°C，30s ;72°C，45s ; 35cycles ;72°C,10min〇
9. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，其特征在于， 步驟b)中PCR反應(yīng)使用引物： cyclinE-FFl ：5>AAAACCGATGAGAAGACT<3 ； cyclinE-FF2 ：5>TCCTACAGAAGACACCCT<3 ； RTEF-F ：5>AAGCCAGGTATGGTTGTCAACTTT<3 ； RTEF-R :5>CGTGGTGCATCTCCACAGACT〈3。
10. 權(quán)利要求1所述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列用于檢測腫瘤是否擴散或者 作為設(shè)計治療腫瘤藥物的靶位點或者調(diào)節(jié)斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育過程。
【文檔編號】C12Q1/68GK104099340SQ201410367585
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月20日
【發(fā)明者】趙超, 邱麗華, 江世貴, 周發(fā)林, 傅明駿 申請人:中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所