用于改變和改善纖維性質(zhì)的纖維氧化酶組合物及造紙方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于改變和改善纖維性質(zhì)的纖維氧化酶組合物及造紙方法和應(yīng)用，所述組合物包括以下組成：對(duì)纖維具有氧化功能的生物酶組分，所述生物酶組分為通過(guò)氧化還原反應(yīng)來(lái)改變纖維表面性質(zhì)的纖維氧化酶；和對(duì)纖維氧化酶具有增加催化活性的輔助組分，所述輔助組分為纖維氧化酶的反應(yīng)產(chǎn)物的清除劑；所述生物酶組分和輔助組分的重量比例為1:0.1-50。所述組合物處理紙漿時(shí)，不但紙張的強(qiáng)度性質(zhì)顯著增強(qiáng)，而且改善紙漿的濾水性能。
【專利說(shuō)明】用于改變和改善纖維性質(zhì)的纖維氧化酶組合物及造紙方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物酶和使用生物酶改善纖維物理化學(xué)性質(zhì)的【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地，涉及一種用纖維氧化酶改變和改善纖維表面性質(zhì)的組合物及造紙方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]中國(guó)造紙工業(yè)在2000-2010年間連續(xù)10年保持高增長(zhǎng)率，到2011年我國(guó)紙及紙板的生產(chǎn)量和消費(fèi)量均超過(guò)I億噸，均居世界第一位。紙或紙板的組成原料主要是纖維，由于制漿、造紙需要大量的原料，而且對(duì)環(huán)境有一定的影響，目前世界各國(guó)造紙行業(yè)都在壓縮制漿生產(chǎn)，以保證森林資源，加上國(guó)內(nèi)原料林基地建設(shè)遲緩，供材有限，而非木漿發(fā)展受到清潔生產(chǎn)新技術(shù)開(kāi)發(fā)滯后的影響，中國(guó)造紙工業(yè)發(fā)展面臨的資源、能源和環(huán)境的約束日益突顯。
[0003]目前，中國(guó)造紙企業(yè)近80%的生產(chǎn)原料為非木纖維的原料，其中約70%為回收纖維和10%為草漿、蘆葦漿和甘蔗渣漿等。這些原料的纖維本身很多性能遠(yuǎn)比木纖維差，而且其表面活性低，纖維之間的結(jié)合力差，由此帶來(lái)很多生產(chǎn)和產(chǎn)品質(zhì)量問(wèn)題。
[0004]例如，為使產(chǎn)品的物理指標(biāo)滿足要求，造紙企業(yè)目前采用的辦法是:
[0005](I)增加產(chǎn)品的定量，增加紙張密度；此方法的缺點(diǎn)是增加生產(chǎn)成本，浪費(fèi)資源；
[0006](2)增加磨漿，提高纖維表面分絲帚化，提高紙張強(qiáng)度；此方法的缺點(diǎn)是能耗高，降低制漿的游離度，降低纖維得率和增加烘干能耗；
[0007](3)使用干強(qiáng)劑/濕強(qiáng)劑等化學(xué)品，例如使用陽(yáng)離子淀粉、陰離子淀粉、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酰胺、陰離子聚丙烯酰胺，以及低分子量陽(yáng)離子聚合物等，來(lái)增加紙漿的脫水性能或強(qiáng)度，此方法的缺點(diǎn)是成本高，鈍化纖維，對(duì)造紙水系統(tǒng)循環(huán)不利，增加COD排放；和
[0008](4)提高木纖維漿料比例，此方法缺點(diǎn)是成本高，增加進(jìn)口原料的依賴性?？梢?jiàn)，這些方法有多方面的問(wèn)題，制漿造紙工業(yè)目前迫切需要一種高效的方法來(lái)解決這些難題。
[0009]早在上世紀(jì)六十年代，人們開(kāi)始研究使用生物酶來(lái)改變紙漿和改善造紙。1986年努等人報(bào)道了木聚糖酶對(duì)漂白化學(xué)衆(zhòng)的酶法打衆(zhòng)作用(Noe P.et al., Act1n ofxylanases on chemical pulp fibers, J.Wood Chern.Techn0.，6:167，1986)。近一二十年來(lái)，人們對(duì)生物技術(shù)在制漿造紙工業(yè)的應(yīng)用進(jìn)行了大量的研究，研究范圍幾乎涉及了制楽.造紙工業(yè)的各個(gè)方面(Bajpai, B1technology for Pulp and Paper Processing,2012，Springer, ISBN 978-1-4614-1408-7)。美國(guó)專利 US4, 923，565，US5, 110，412 和US5, 308，449提出使用纖維素酶或半纖維素酶提高造紙紙漿的脫水性。US5，725，732提出使用纖維素酶和半纖維素酶解決纖維的掉毛缺陷，US6, 066，233建議用纖維素酶和果膠酶結(jié)合使用可通過(guò)紙漿的濾水性。美國(guó)專利US5，582，681提出用纖維素酶、半纖維素酶和脂肪水解酶等混合酶制劑提高衛(wèi)生紙的柔韌性。此外用纖維素酶、半纖維素酶處理紙漿，還可改善纖維壓縮性，使紙頁(yè)微孔性下降，密度提高，透明度提高。
[0010]造紙行業(yè)目前使用的所謂“纖維改性酶”都是利用纖維素水解酶，包括內(nèi)切纖維素酶和外切纖維素酶，對(duì)纖維的(-1,4苷糖鍵(b-l，4-linked D-glucose units)進(jìn)行水解反應(yīng)，逐步降解(depolymerizat1n)成為較小分子量的多糖。應(yīng)用的結(jié)果顯示，纖維素水解酶對(duì)于降低磨漿能耗和提高網(wǎng)部脫水有一定的效果。但是，基于纖維水解酶的“打漿酶”技術(shù)有幾個(gè)極大弊病:
[0011](a)纖維素水解酶對(duì)纖維的作用在造紙過(guò)程中具有不可控性和不可逆性，當(dāng)纖維素的濃度或作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，纖維素酶會(huì)首先潰解纖維細(xì)胞，對(duì)纖維表面的纖絲象剃胡須一樣的剪除，甚至對(duì)纖維整體進(jìn)行切斷，致使纖維損傷，其結(jié)果導(dǎo)致紙產(chǎn)品“發(fā)脆”和強(qiáng)度指標(biāo)(特別是撕裂度和耐破度等)大幅度下降，甚至導(dǎo)致紙漿作廢，給企業(yè)造成經(jīng)濟(jì)損失。
[0012](b)纖維素水解酶對(duì)纖維的(-1，4苷糖鍵進(jìn)行水解反應(yīng)，降低纖維的聚合度(degree of polymerizat1n)，最終產(chǎn)生葡聚糖和單糖,致使纖維溶解。當(dāng)纖維素酶的用量過(guò)高或者停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，纖維的降解率可高達(dá)1%，不僅造成纖維損失，降低纖維的綜合利用率，而且大大增加白水中的COD含量，不利于節(jié)能減排。
[0013](C)纖維素水解酶對(duì)底物“比較很挑剔”，只對(duì)較純凈的纖維素才有較顯著作用，甚至只對(duì)某種纖維素有明顯的作用。例如，現(xiàn)有纖維素酶大多數(shù)對(duì)漂白化學(xué)針葉漿有較顯著的作用，而對(duì)漂白化學(xué)闊葉漿的作用較小。如果纖維含量木素，例如未漂針葉漿，受表面木素的影響，纖維素分解酶的作用很小。對(duì)含木素高的機(jī)械漿，纖維素水解酶就失去其作用。
[0014]為了避免常規(guī)纖維素酶對(duì)纖維過(guò)分剪切而降低纖維強(qiáng)度的缺陷，美國(guó)專利US6, 294，366 和 US6, 635，146 公開(kāi)了使用截短的纖維素酶(CBD-truncated cellulose)處理紙漿，截短的酶缺少纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)，使用這樣的纖維素酶處理紙漿，可以避免這樣的纖維強(qiáng)度的損失。在相似的紡織工業(yè)應(yīng)用中，US5，916，799公開(kāi)了含有纖維二糖水解酶和內(nèi)切葡聚糖酶的纖維素酶組合物，這兩種酶己經(jīng)進(jìn)行了有限的蛋白水解，從而將酶的核心和纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域分開(kāi)，發(fā)現(xiàn)得到的酶組合物降低返染。W096/23928公開(kāi)了使用截短的纖維素酶處理含有纖維素的織物，發(fā)現(xiàn)能夠減少染料的再沉積并增加磨損。
[0015]Shoseyov 等(Chapter8 !Modulat1n of Wood Fibers and Paper byCellulose-Binding Domain, In Applicat1ns of Enzymes to Lign °C ellulosics ；Edited by Mansfield et al..ACS Symposium Series ；American ChemicalS °C iety:ffashington, DC, 2003, pagell6_132)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用纖維素親合結(jié)構(gòu)域(cellulose-binding domain, CBD)蛋白能提高紙張的強(qiáng)度，而且聚合纖維結(jié)合蛋白(即由兩個(gè)或更多的單體纖維結(jié)合蛋白組成的聚合分子，又稱纖維鍵聯(lián)蛋白)比單體纖維結(jié)合蛋白對(duì)紙張強(qiáng)度的提高更有效。Levy等(Cellulose，2002，9:91-98)報(bào)道，經(jīng)過(guò)纖維結(jié)合蛋白質(zhì)處理后的紙張的強(qiáng)度和紙面防濕性都大大地提高。Pala等(Chapter7:Cellulose-Binding Domain as a Tool for Paper Recycling, In Applicat1ns ofEnzymes to Lign°C ellulosics ；Edited by Mansfield et al..ACS Symposium Series ；American Chemical S°C iety!Washington, DC, 2003, pagel05_115)報(bào)道，用 CBD 處理后的回收廢紙的強(qiáng)度有顯著增加。Kitaoka等(J Wood Sc1.，2001，47:322-324)描述了使用纖維素親合結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)和陰離子聚合物聚丙烯酰胺(CBD-APAM)合成新的聚合物，作為干強(qiáng)度或濕強(qiáng)度添加劑，比常規(guī)干強(qiáng)/濕度添加劑更有效。
[0016]中國(guó)專利“一種用于改變和改善纖維表面性質(zhì)的組合物和造紙方法”(專利號(hào):ZL201010566132.2)提出聯(lián)合使用纖維素酶和纖維結(jié)合蛋白(CBP)和纖維素酶處理纖維紙漿，通過(guò)纖維結(jié)合蛋白選擇吸附在纖維的非晶型區(qū)域表面，庇護(hù)該區(qū)域不受纖維素酶的作用，從而避免纖維素酶對(duì)纖維非晶型纖維的過(guò)度剪切。但是在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，由于纖維結(jié)合蛋白(CBP)吸附的可逆性，特別是當(dāng)聚能酶"產(chǎn)品在磨漿之前加入時(shí)，經(jīng)過(guò)磨漿之后紙漿產(chǎn)生大量新生表面，這些新纖維表面將被暴露在纖維素酶的“攻擊”之下，如果停留時(shí)間較長(zhǎng)，纖維被過(guò)度剪切，導(dǎo)致紙產(chǎn)品的強(qiáng)度下降。
[0017]因此，制漿造紙工業(yè)迫切需要一種既能與纖維反應(yīng)使纖維表面活化、又不會(huì)潰解纖維導(dǎo)致纖維強(qiáng)度下降的新型生物酶技術(shù)，而且這種生物酶能對(duì)不同纖維材料(包括木纖維、非木纖維和回收纖維)都具有顯著活性的廣譜性生物酶，這樣的新型生物酶技術(shù)將對(duì)中國(guó)造紙工業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0018]本發(fā)明的目的之一在于提供一種用于改變和改善制漿造紙纖維材料性質(zhì)的組合物和方法，通過(guò)使用該組合物處理紙漿原料，能顯著提高纖維之間的結(jié)合力，改善紙張的質(zhì)量和紙漿的脫水效率。
[0019]實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下:
[0020]一種用于改變和改善纖維性質(zhì)的纖維氧化酶組合物，包括以下組成:
[0021]i)對(duì)纖維具有氧化功能的生物酶組分，所述生物酶組分為通過(guò)氧化還原反應(yīng)來(lái)改變纖維表面性質(zhì)的纖維氧化酶；和
[0022]ii)對(duì)纖維氧化酶具有增加催化活性的輔助組分，所述輔助組分為纖維氧化酶的反應(yīng)產(chǎn)物的清除劑；
[0023]所述生物酶組分和輔助組分的重量比例為1:0.1-50。
[0024]在其中一些實(shí)施例中，所述纖維氧化酶為一族分子量在20_50KDa、具有銅依賴性的小分子金屬酶的聚糖加氧酶。
[0025]在其中一些實(shí)施例中，所述清除劑為能有效降低反應(yīng)產(chǎn)物過(guò)氧化氫濃度的化合物，選自抗壞血酸、沒(méi)食子酸、木質(zhì)素、錳(II)鹽、銅(II)鹽或鐵(II)鹽中的一種或多種。
[0026]在其中一些實(shí)施例中，所述生物酶組分和輔助組分的重量比例為1:0.1-10。
[0027]在其中一些實(shí)施例中，所述生物酶組分和輔助組分的重量比例為1:0.1-5。
[0028]在其中一些實(shí)施例中，所述清除劑為沒(méi)食子酸和銅(II)鹽或鐵(II)鹽。
[0029]在其中一些實(shí)施例中，所述纖維氧化酶組合物中纖維氧化酶、銅(II)鹽/鐵(II)鹽和沒(méi)食子酸的重量比為1:0.05-5:1-5。
[0030]在其中一些實(shí)施例中，所述纖維氧化酶組合物中纖維氧化酶、銅(II)鹽/鐵(II)鹽和沒(méi)食子酸的重量比為1:0.05-2.5:1-4。
[0031]在其中一些實(shí)施例中，所述纖維氧化酶組合物還包括對(duì)纖維氧化酶具有促進(jìn)作用的蛋白質(zhì)，所述對(duì)纖維氧化酶具有促進(jìn)作用的蛋白質(zhì)為有催化活性的生物酶或無(wú)催化活性的纖維素結(jié)合蛋白；所述纖維氧化酶組合物中纖維氧化酶和對(duì)纖維氧化酶具有促進(jìn)作用的蛋白質(zhì)的重量比為1:1-5。
[0032]在其中一些實(shí)施例中，所述有催化活性的生物酶為氧化還原酶、非纖維素水解酶的水合酶或纖維素水解酶；所述氧化還原酶選自纖維二糖脫氫酶、漆酶、葡糖氧化酶、過(guò)氧化氫歧化酶、酒精脫氫酶或木質(zhì)素過(guò)氧化酶中一種或多種，所述非纖維素水解酶的水合酶選自淀粉酶、木聚糖酶、果膠酶或酯酶中一種或多種。
[0033]在其中一些實(shí)施例中，所述無(wú)催化活性的蛋白質(zhì)為纖維結(jié)合蛋白和/或纖維膨脹蛋白。
[0034]本發(fā)明的另一目的在于提供纖維氧化酶組合物或纖維氧化酶在造紙工藝中作為改變和改善纖維性質(zhì)的增強(qiáng)劑或助留助濾劑的應(yīng)用。
[0035]本發(fā)明的另一目的在于提供一種造紙方法，主要包括以下步驟:
[0036]a)形成含水的纖維素造紙漿料，
[0037]b)將上述用于改變和改善纖維性質(zhì)的纖維氧化酶組合物加入到造紙漿料中進(jìn)行反應(yīng)，
[0038]c)將步驟b)中得到的所述造紙漿料送上網(wǎng)，由此通過(guò)濾出水而由纖維固體組分形成紙頁(yè)，
[0039]d)將紙頁(yè)經(jīng)過(guò)壓榨段和干燥段，最終生產(chǎn)出紙產(chǎn)品。
[0040]在其中一些實(shí)施例中，步驟b)中所述纖維氧化酶組合物中的纖維氧化酶用量為每噸干漿料0.01-10千克，所述輔助組分的用量為每噸干漿料0.05-10千克。
[0041]在其中一些實(shí)施例中，步驟b)所述纖維氧化酶組合物中的纖維氧化酶用量為每噸干漿料0.05-5千克，所述輔助組分的用量為每噸干漿料0.1-5千克。
[0042]在其中一些實(shí)施例中，步驟b)所述纖維氧化酶組合物中的纖維氧化酶用量為每噸干漿料0.25-1千克，所述輔助組分的用量為每噸干漿料0.1-2千克。
[0043]在其中一些實(shí)施例中，步驟b)所述纖維氧化酶組合物中的纖維氧化酶用量為每噸干漿料0.25-0.5千克，所述輔助組分的用量為每噸干漿料0.1-2千克。
[0044]在其中一些實(shí)施例中，步驟b)中所述纖維氧化酶組合物和紙漿反應(yīng)的時(shí)間為5-600 分鐘，pH 為 3-10，溫度為 20-800C ο
[0045]在其中一些實(shí)施例中，步驟b)所述纖維氧化酶組合物和紙漿反應(yīng)的時(shí)間為20-300 分鐘，pH 為 5-8，溫度為 30-65。。。
[0046]在其中一些實(shí)施例中，步驟b)所述纖維氧化酶組合物和紙漿反應(yīng)的時(shí)間為50-150 分鐘，pH 為 5.5-8，溫度為 45-55。。。
[0047]現(xiàn)有造紙技術(shù)中紙漿制漿存在的問(wèn)題是主要是纖維的活性低，纖維之間的反應(yīng)度低，為了達(dá)到紙產(chǎn)品的質(zhì)量要求，通常的辦法是增加打漿度，但是增加磨漿會(huì)導(dǎo)致纖維被切斷，產(chǎn)生大量的細(xì)小纖維，不僅降低制漿的脫水性能，增加造紙的烘干能耗，而且可能導(dǎo)致細(xì)小纖維流失，原料利用率下降?，F(xiàn)有的“打漿酶”是利用纖維素水解酶對(duì)纖維進(jìn)行水解反應(yīng)，雖然目前該技術(shù)還在初級(jí)應(yīng)用階段，但已經(jīng)暴露出嚴(yán)重問(wèn)題，即纖維素水解酶對(duì)紙漿纖維的反應(yīng)是不可控性的和不可逆性的，稍有不當(dāng)，將造成紙漿強(qiáng)度明顯下降，甚至產(chǎn)生次品或廢品。
[0048]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果:
[0049]本發(fā)明經(jīng)發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)和研究，得出纖維氧化酶及其組合物能改變和改善纖維表面性質(zhì)，并確定了纖維氧化酶組合物的最佳組分及其配比，所述纖維氧化酶組合物或纖維氧化酶對(duì)不同纖維材料(包括木纖維、非木纖維和回收纖維)都具有顯著活性，采用所述纖維氧化酶組合物或纖維氧化酶處理紙漿原料(如:木漿/化學(xué)漿，主要是漂白和未漂白的木漿/化學(xué)漿的處理(例:漂白的闊葉漿和未漂白的針葉漿)，包括二次回收纖維；還有木漿/機(jī)械漿，例:機(jī)械針葉漿)，處理過(guò)程中，纖維氧化酶集中在晶型纖維表面的反應(yīng)，激活該部分纖維的表面活性，增加纖維反應(yīng)活性，提高纖維間的結(jié)合力，而不會(huì)潰解纖維導(dǎo)致纖維強(qiáng)度下降；采用該種纖維氧化酶及其組合物處理上述紙漿，不僅能顯著改善紙張的各種物理強(qiáng)度，如:叩解度、抗張指數(shù)、撕裂度、層間結(jié)合力、耐破度和白度，還能改善紙漿的濾水性能，同時(shí)能夠改變紙漿(如:木漿/機(jī)械漿)的打漿性能，降低機(jī)械制漿的磨漿性能，對(duì)造紙生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)具有重要意義。

【具體實(shí)施方式】
[0050]對(duì)于本發(fā)明所述技術(shù)術(shù)語(yǔ)的說(shuō)明如下:
[0051]纖維素水解酶:本發(fā)明中的“纖維素水解酶”是指所有的通過(guò)水解反應(yīng)來(lái)降解纖維素的生物酶，目前常常把纖維素水解酶和纖維素酶、纖維水解酶和纖維酶等術(shù)語(yǔ)交替使用。根據(jù)纖維素酶降解底物時(shí)不同的作用方式可將其分成3類:
[0052](I)內(nèi)切纖維素酶又稱之為內(nèi)切葡聚糖酶(Endoglucanase, EG ；EC3.2.1.4)；
[0053](2)外切纖維素酶又稱之為纖維二糖水解酶(Cellob1hydrolase，CBH ；EC3.2.1.91)；
[0054](3) β -葡萄糖苷酶(β -glucosidase, BGL ；EC3.2.1.21)。
[0055](a)內(nèi)切纖維素酶(又稱內(nèi)切葡聚糖酶，endo-1, 4_β-D-glucanase, EC3.2.1.4)，該類酶主要作用于纖維素內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)水解β_1，4-糖苷鍵，將長(zhǎng)鏈纖維素分子截短，產(chǎn)生大量非還原性末端的小分子纖維素，其分子量大小約為23-146KD ；
[0056](b)外切纖維素酶(又稱外切葡聚糖酶，exo-Ι, 4_ β -D-glucanase, EC3.2.1.91)
，該類酶作用于纖維素線狀分子末端，水解β -1, 4-D-14糖苷鍵，依次切下一個(gè)纖維二糖分子，故又稱為纖維二糖水解酶(cellob1hydrolase, CBH)，分子量約38-118KD。
[0057](c)纖維二糖酶(又稱 β-葡萄糖苷酶，β -1, 4-glucosidase,EC3.2.1.21),簡(jiǎn)稱BG0這類酶一般將纖維二糖或可溶性的纖維糊精水解成葡萄糖分子，其分子量約為76KD。
[0058]纖維素酶的酶活性(CMCase):本發(fā)明中纖維素水解酶的酶活性是指纖維素酶組分在它們將纖維素降解成葡萄糖、纖維二糖和二糖的能力方面的萄聚糖的酶活性。纖維素酶的活性一般用羧甲基纖維素的溶液粘度的降低來(lái)確定。
[0059]纖維素結(jié)合蛋白質(zhì)(cellulose binding protein, CBP):本發(fā)明中的“纖維素結(jié)合蛋白質(zhì)”是指對(duì)纖維素表面具有特別親和力、能強(qiáng)烈地吸附在纖維素表面的、但其本身對(duì)纖維素沒(méi)有催化水解反應(yīng)活性的蛋白質(zhì)。在文獻(xiàn)中，又稱為纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CelluloseBinding Domain, CBD),纖維素結(jié)合模塊(Cellulose Binding Module, CBM),纖維素吸附結(jié)構(gòu)域，纖維素親合結(jié)構(gòu)域。
[0060]纖維膨脹蛋白(Swollenin或者Expansin):本發(fā)明中的“纖維膨脹蛋白”系指一種能使結(jié)晶纖維素和半纖維素等天然底物的纖維結(jié)構(gòu)膨脹疏松的蛋白/多肽化合物，這類蛋白對(duì)纖維素沒(méi)有降解的催化功能，但能提高纖維素酶對(duì)微晶纖維素的水解能力?！袄w維膨脹蛋白”也稱為纖維膨脹因子，英文稱Swollenin和Expansin,是一類植物細(xì)胞壁擴(kuò)展蛋白，其具有纖維素酶典型結(jié)構(gòu)域組成(含纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD))的非水解活性蛋白。源于植物的纖維擴(kuò)張蛋白主要有兩類，分別命名為α-expansin和β-expansin。兩類纖維擴(kuò)張蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上有較高的同源性:a -expansin分子量約25kDa，氨基酸序列高度保守，同源性達(dá)70%~90% ; β -expansin分子量約29kDa，但氨基酸序列變化較大。
[0061]纖維氧化酶(Cellulose Oxidative Enzymes):本發(fā)明中的“纖維氧化酶”是指聚糖氧合酶(polysaccharide monooxygenase, PMO),所述“聚糖氧合酶”是指是一族分子量在20-50KDa、含有銅(II)的小分子金屬酶(metalloenzyme),能與纖維表面進(jìn)行加氧或者去氫的氧化反應(yīng)，從而改變纖維表面化學(xué)性質(zhì)的生物酶。聚糖氧合酶的其它名稱包括聚葡糖加氧酶或者稱聚葡糖單加氧酶(polysaccharide monooxygenase, ΡΜ0),裂解性聚糖氧合酶(lytic polysaccharide monooxygenase, LPM0),以及糖苷水化酶 61 族(glycosylhydrolase61, GH61)。
[0062]纖維氧化酶與纖維素水解酶的區(qū)別在于:纖維素水解酶是通過(guò)對(duì)β -1, 4-D-14糖苷鍵進(jìn)行水解反應(yīng)，使纖維素降解；而纖維氧化酶是通過(guò)對(duì)纖維素進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，反應(yīng)所改變的鍵位不限于β-1，4-?-14糖苷鍵。雖然PMO早在1974年就已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，由于用CMCase(即測(cè)試內(nèi)切纖維素酶的活性方法)分析方法，發(fā)現(xiàn)PMO對(duì)β -1, 4_D_14糖苷鍵的水解反應(yīng)非常微弱，于是人們對(duì)該酶種的作用和其反應(yīng)機(jī)理沒(méi)有進(jìn)行更深入的研究認(rèn)識(shí)，CAZy (Carbohydrate Active Enzymes,簡(jiǎn)稱 CAZy, http://www.cazy.0rg/)把它們劃分為Glycosyl Hydrolases61族(GH61)。然而,最新研究表面，PMO實(shí)際是一種銅-依賴性單氧加合酶(Copper-dependent monooxygenases, ECL 14.17.x),它是通過(guò)氧化反應(yīng)而對(duì)纖維進(jìn)行作用的，而不像普通的纖維素水解酶那樣通過(guò)水解反應(yīng)對(duì)纖維進(jìn)行作用，因此PMO是氧化酶而非水解酶。經(jīng)典的纖維素水解酶具有許多酶族，相反，PMO只有兩個(gè)家族，即 carbohydrate binding module family33 (CBM33,碳水結(jié)合域家族 33)和 glycosylhydrolase (GH61,糖苷水解酶家族61)。CAZy最近將PMO重新列分為AA9類和AAlO類生物酶。前者主要來(lái)源是真菌(fungus)，而后者主要來(lái)自于細(xì)菌、病毒和某些真菌。
[0063]PMO存在于很多木素纖維降解的微生物中，可以依此提純和表達(dá)，或者通過(guò)現(xiàn)代蛋白工程技術(shù)對(duì)酶蛋白進(jìn)行重組表達(dá)。例如，美國(guó)專利US Pat.7，273，738，美國(guó)專利申請(qǐng)USA2009/099079，美國(guó)專利申請(qǐng)USA2013/0052698公開(kāi)了一系列新的GH61酶種的列序。美國(guó)專利US8，298，795和美國(guó)專利申請(qǐng)USA2012/0083019公開(kāi)了從真菌宿主菌株Mycel1phthora thermophiIa(又稱 Chrysosporium Iucknowense)獲得重組 GH61 蛋白(recombinant GH61proteins)以及聯(lián)合使用該GH61和和纖維素酶(cellulase)組合物處理木質(zhì)纖維類物質(zhì)增加生物精煉效率、提高酒精產(chǎn)量的技術(shù)。迄今，有關(guān)PMO的應(yīng)用都在生物精煉(b1refinery)，還沒(méi)有PMO在制漿造紙中應(yīng)用的報(bào)道。
[0064]截止2013年2月，CAZy的數(shù)據(jù)庫(kù)已經(jīng)收集了 249種PMO(即GH61)蛋白氨基酸列序數(shù)據(jù)，大部分屬于子囊屬菌株(ascomycetous)和擔(dān)子菌(basid1mycetous)。而在NCBI/JGIBlast的搜索結(jié)果顯示，目前共有761套GH61的基因系統(tǒng)。隨著研究深入，可以預(yù)見(jiàn)PMO的數(shù)據(jù)會(huì)繼續(xù)迅速增加。
[0065]纖維氧化酶組合物:本發(fā)明中的“纖維氧化酶組合物”是指該組合物含有如下兩種組分，一個(gè)組分是聚糖氧合酶(polysaccharide monooxygenase),和另外一個(gè)組分是能保持或者增加對(duì)維氧化酶活性的輔助物，其中該輔助物可以是以下化合物的一個(gè)或多個(gè)化合物，(I)纖維氧化酶的反應(yīng)底物氧氣或者氧氣釋放化合物(oxygen precursors)、(2)反應(yīng)產(chǎn)物的清除劑(radical scavengers)、和(3)對(duì)纖維氧化酶具有促進(jìn)作用的蛋白質(zhì)。
[0066]本發(fā)明的“纖維氧化酶的反應(yīng)底物”是指除了纖維以外，聚糖氧化酶發(fā)生反應(yīng)所必需的電子受體一氧氣；該反應(yīng)底物可以通過(guò)如下方式提供:氧氣、空氣或者氧氣釋放化合物，本發(fā)明中的氧氣釋放化合物是指過(guò)氧化物或者臭氧，其中過(guò)氧化物包括過(guò)氧化氫、過(guò)氧化鈉、過(guò)氧化鈣、過(guò)氧化鉀。
[0067]本發(fā)明的“對(duì)纖維氧化酶的有促進(jìn)作用的蛋白質(zhì)”是指能增加聚糖氧化酶反應(yīng)活性的生物酶、纖維素結(jié)合蛋白、和訊網(wǎng)膨脹蛋白；其中對(duì)聚糖氧化酶有促進(jìn)作用的生物酶是指除了纖維素水解酶以外的其它類水解酶(包括淀粉酶、果膠酶、脂肪酶、酯酶和木聚糖酶)和氧化還原酶(包括纖維二糖脫氫酶、漆酶和木質(zhì)素過(guò)氧化酶)。
[0068]本發(fā)明的“纖維氧化酶的反應(yīng)產(chǎn)物清除劑”是指能降低聚糖氧化酶的反應(yīng)產(chǎn)物過(guò)氧化氫濃度的化合物，包括抗壞血酸(ascorbate)、沒(méi)食子酸(gallate)、木質(zhì)素(Iignin)、銅(II)鹽即二價(jià)銅鹽、鐵(II)鹽即二價(jià)鐵鹽、錳(II)鹽即二價(jià)錳鹽和鋅(II)鹽即二價(jià)鋅鹽。
[0069]本發(fā)明涉及使用纖維氧化酶來(lái)處理制漿造紙的纖維原料，以改變纖維表面的化學(xué)性質(zhì)，提高纖維的反應(yīng)活性，增加纖維之間的結(jié)合力，從而提高紙張的強(qiáng)度指標(biāo)，增加脫水烘干效率，降低能耗，為造紙企業(yè)節(jié)約生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)利潤(rùn)。
[0070]本發(fā)明所涉及的纖維素氧化酶可以是以其單個(gè)酶組分的產(chǎn)品分別加入造紙過(guò)程中，以可以將兩組分分別加入不同的位置或者是混合成一個(gè)產(chǎn)品配方加入造紙過(guò)程中同意位置，以達(dá)到最佳的效果。
[0071]本發(fā)明所涉及的使用纖維氧化酶的目的和效果是通過(guò)氧化酶對(duì)纖維表面的晶型區(qū)域反應(yīng)，產(chǎn)生表面反應(yīng)活性很高的鍵位，使纖維之間的結(jié)合力增加。而且纖維氧化酶對(duì)纖維的反應(yīng)可以通過(guò)控制在纖維表面，不會(huì)對(duì)纖維有過(guò)度的反應(yīng)，從而達(dá)到選擇性的纖維表面改性和修復(fù)。因此，與傳統(tǒng)的纖維素水解酶相比，從而避免了傳統(tǒng)纖維素水解酶的降解纖維的問(wèn)題。
[0072]本發(fā)明所述單位“kg/T”是指每噸絕干漿中添加物料的千克數(shù)。
[0073]以下將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
[0074]實(shí)施例1纖維氧化酶及其不同組合物處理漂白闊葉漿對(duì)其紙張強(qiáng)度的影響
[0075]一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br> [0076]通過(guò)對(duì)比分析評(píng)價(jià)纖維氧化酶及其組合物處理漂白闊葉漿對(duì)其紙張強(qiáng)度的影響。
[0077]二、實(shí)驗(yàn)方法
[0078](I)試驗(yàn)材料準(zhǔn)備
[0079]漂白闊葉化學(xué)漿由山東萬(wàn)國(guó)紙業(yè)26號(hào)機(jī)的紙漿廠提供。
[0080]纖維氧化酶(PMO)由美國(guó)Dyadic公司提供的GH61,該酶種從菌株Mycel1phthorathermophi Ia9又稱Sporotrichum thermophi Ie)制取，其氨基酸列序在美國(guó)專利US8, 298，795和美國(guó)專利申請(qǐng)USA2012/0083019有詳細(xì)表述。
[0081]纖維素水解酶為Dyadic公司的商業(yè)產(chǎn)品FiberZymeG200,該產(chǎn)品用和上述相同的菌株生產(chǎn)制取。其它化學(xué)藥劑從SigmaAldrich購(gòu)買(mǎi)。
[0082](2)造紙方法
[0083]A、制漿:將200克漿板和1500克去離子水放置在10升的水力碎漿機(jī)中，碎漿10分鐘；然后再加2300克水，配得得到5%的漿。
[0084]B:反應(yīng)
[0085](I)取上述配好的漿400克，放入100ml混合攪拌器中，用恒溫控制器控制漿的溫度在50°C。
[0086](2)本實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組；
[0087]對(duì)照組I為空白樣品:不加任何藥劑；
[0088]對(duì)照組2為控制樣品:加入輔助化合物(硫酸銅和沒(méi)食子酸)；
[0089]對(duì)照組3為纖維素水解酶處理:FiberZymeG200，用量為250g/T(絕干漿)或者500g/T ；
[0090]實(shí)驗(yàn)組I為不同用量的纖維氧化酶(PMO)處理；
[0091]實(shí)驗(yàn)組2為纖維氧化酶+輔助物(硫酸銅和沒(méi)食子酸)，用量按照比例變化；
[0092]上述的反應(yīng)條件均為:溫度為50°C，反應(yīng)時(shí)間為90分鐘，反應(yīng)pH為6.5-6.8 ;恒速攪拌，以提供反應(yīng)所需的氧氣。
[0093]C、磨漿:取以上準(zhǔn)備好的漿放置在200目的篩網(wǎng)，使其脫水到漿濃在11-12%，并收集網(wǎng)下白水。然后，取相當(dāng)于20g絕干漿的漿，放置到PFI機(jī)，磨漿21000轉(zhuǎn)。磨漿后，把漿取出后，然后再將白水濾液放回磨好的漿中，放置60分鐘，并取樣測(cè)試漿濃。
[0094]D、手抄紙準(zhǔn)備和強(qiáng)度測(cè)量:將上述制備好的漿，加自來(lái)水稀釋到1.0 %的漿濃，混勻，測(cè)量溫度和漿濃度，按TAPPI方法，精確制備10-12張6.5克重的手抄紙。烘干后，手抄紙放在恒溫和恒濕度的控制箱中24小時(shí)，然后按TAPPI測(cè)量方法測(cè)量其厚度(密度)、抗張強(qiáng)度、撕裂強(qiáng)度和結(jié)合強(qiáng)度。
[0095]三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0096]結(jié)果參見(jiàn)表1，從表1可知:纖維氧化酶及其組合物處理紙漿對(duì)紙張的各種強(qiáng)度性質(zhì)的影響結(jié)果。與空白條件相比，加入纖維氧化酶處理后，在相同的磨漿功率下(相同轉(zhuǎn)數(shù))，紙漿的叩解度略有升高，說(shuō)明纖維氧化酶在此處理?xiàng)l件下，對(duì)漂白闊葉漿纖維的磨漿性能影響不大。但是，在經(jīng)過(guò)纖維氧化酶處理之后，紙張各種強(qiáng)度都顯著增加，特別是紙張的撕裂度，增加了 30%以上。
[0097]從表2可知:纖維水解酶處理紙漿對(duì)紙張指標(biāo)的影響?？梢?jiàn)，經(jīng)過(guò)纖維水解酶處理后，在相同的磨漿功率下(相同轉(zhuǎn)數(shù))，紙漿的叩解度有較大的升高，紙張的抗張強(qiáng)度有增加，但是，紙張的撕裂度顯著下降(18% )。
[0098]本例證明纖維氧化酶處理化學(xué)闊葉漿對(duì)其各種強(qiáng)度指標(biāo)有極其顯著加強(qiáng)效應(yīng)，特別是對(duì)紙張的撕裂度有加大的提高。
[0099]表1各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組處理化闊漿對(duì)磨漿和紙張物理指標(biāo)的影響結(jié)果表
[0100]

【權(quán)利要求】
1.一種用于改變和改善纖維性質(zhì)的纖維氧化酶組合物，其特征是，包括以下組成: i)對(duì)纖維具有氧化功能的生物酶組分，所述生物酶組分為通過(guò)氧化還原反應(yīng)來(lái)改變纖維表面性質(zhì)的纖維氧化酶；和 ii)對(duì)纖維氧化酶具有增加催化活性的輔助組分，所述輔助組分為纖維氧化酶的反應(yīng)產(chǎn)物的清除劑； 所述生物酶組分和輔助組分的重量比例為1:0.1-50。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于改變和改善纖維性質(zhì)的纖維氧化酶組合物，其特征是，所述纖維氧化酶為一族分子量在20-50KDa、具有銅依賴性的小分子金屬酶的聚糖加氧酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于改變和改善纖維性質(zhì)的纖維氧化酶組合物，其特征是，所述清除劑為能有效降低反應(yīng)產(chǎn)物過(guò)氧化氫濃度的化合物，選自抗壞血酸、沒(méi)食子酸、木質(zhì)素、錳(II)鹽、銅(II)鹽或鐵(II)鹽中的一種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于改變和改善纖維性質(zhì)的纖維氧化酶組合物，其特征是，所述生物酶組分和輔助組分的重量比例為1:0.1-10。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的用于改變和改善纖維性質(zhì)的纖維氧化酶組合物，其特征是，所述纖維氧化酶組合物還包括對(duì)纖維氧化酶具有促進(jìn)作用的蛋白質(zhì)，所述對(duì)纖維氧化酶具有促進(jìn)作用的蛋白質(zhì)為有催化活性的生物酶或無(wú)催化活性的纖維素結(jié)合蛋白；所述纖維氧化酶組合物中纖維氧化酶和對(duì)纖維氧化酶具有促進(jìn)作用的蛋白質(zhì)的重量比為1:1-5。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于改變和改善纖維性質(zhì)的纖維氧化酶組合物，其特征是，所述有 催化活性的生物酶為氧化還原酶、非纖維素水解酶的水合酶或纖維素水解酶；所述氧化還原酶選自纖維二糖脫氫酶、漆酶、葡糖氧化酶、過(guò)氧化氫歧化酶、酒精脫氫酶或木質(zhì)素過(guò)氧化酶中一種或多種，所述非纖維素水解酶的水合酶選自淀粉酶、木聚糖酶、果膠酶或酯酶中一種或多種。
7.纖維氧化酶或如權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的纖維氧化酶組合物在造紙工藝中作為改變和改善纖維性質(zhì)的增強(qiáng)劑或助留助濾劑的應(yīng)用。
8.一種造紙方法，其特征是，主要包括以下步驟: a)形成含水的纖維素造紙漿料， b)將權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述用于改變和改善纖維性質(zhì)的纖維氧化酶組合物加入到造紙漿料中進(jìn)行反應(yīng)， c)將步驟b)中得到的所述造紙漿料送上網(wǎng)，由此通過(guò)濾出水而由纖維固體組分形成紙頁(yè)， d)將紙頁(yè)經(jīng)過(guò)壓榨段和干燥段，最終生產(chǎn)出紙產(chǎn)品。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的造紙方法，其特征是，步驟b)中所述纖維氧化酶組合物中的纖維氧化酶用量為每噸干漿料0.01-10千克，所述輔助組分的用量為每噸干漿料0.05-10千克；或/及 步驟b)中所述纖維氧化酶組合物和紙漿反應(yīng)的時(shí)間為5-600分鐘，pH為3-10，溫度為20-80。。。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的造紙方法，其特征是，步驟b)所述纖維氧化酶組合物中的纖維氧化酶用量為每噸干漿料0.05-5千克，所述輔助組分的用量為每噸干漿料0.1-5千克；或/及 步 驟b)所述纖維氧化酶組合物和紙漿反應(yīng)的時(shí)間為20-300分鐘，pH為5-8，溫度為30-65。。。
【文檔編號(hào)】C12N9/04GK104178474SQ201410368089
【公開(kāi)日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2014年7月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月29日
【發(fā)明者】王祥槐, 謝焱 申請(qǐng)人:瑞辰星生物技術(shù)（廣州）有限公司