一種荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內(nèi)粗多糖的發(fā)酵工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內(nèi)粗多糖的發(fā)酵工藝，采用價(jià)格較低的無機(jī)Na2SeO3作為硒源，以液體發(fā)酵培養(yǎng)的方式，在用馬鈴薯葡萄糖制備的液體培養(yǎng)基中加入Na2SeO3溶液，通過荷葉離褶傘菌絲體的富集轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒，降低了硒的毒性，提高菌絲體的利用價(jià)值；將Na2SeO3在液體培養(yǎng)基的發(fā)酵中期加入，有效地降低硒對(duì)延滯期荷葉離褶傘菌絲體的抑制和毒害作用，提高荷葉離褶傘菌絲體中富硒胞內(nèi)多糖的積累量。通過單因素試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)以及響應(yīng)面分析法，對(duì)富硒荷葉離褶傘胞內(nèi)粗多糖發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳發(fā)酵條件，得到胞內(nèi)粗多糖與各發(fā)酵條件各因素變量的二次回歸方程模型，該模型回歸極顯著，對(duì)試驗(yàn)擬合較好，有一定的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】一種荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內(nèi)粗多糖的發(fā)酵工藝

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及硒多糖的生產(chǎn)工藝，具體涉及一種荷葉離褶傘富 硒胞內(nèi)粗多糖的發(fā)酵工藝。

【背景技術(shù)】
[0002] 荷葉離裙傘afecasies )菌絲體中蛋白質(zhì)含量高，氨基酸種類齊全， 含有多種維生素，其多糖可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)，降低胰島素依賴型小白鼠的血糖濃度，是一 種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值都很高的菌類。而且荷葉離褶傘菌絲體可以有效地富集一定量的 硒。食用菌對(duì)硒具有較強(qiáng)的富集能力，通過菌絲體細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝，使無機(jī)硒安全有效地轉(zhuǎn) 化為有機(jī)硒多糖，其生物藥理活性普遍高于多糖和硒，更容易被機(jī)體吸收和利用，同時(shí)營(yíng)養(yǎng) 成分因富硒得到改善。荷葉離褶傘人工栽培困難，其抗雜菌能力較差、出菇條件要求極高、 子實(shí)體產(chǎn)量不穩(wěn)定、栽培周期長(zhǎng)等問題嚴(yán)重影響該菌的全面推廣，改善荷葉離褶傘菌絲體 的營(yíng)養(yǎng)成分，提高其應(yīng)用價(jià)值顯得尤為重要。目前國(guó)內(nèi)對(duì)食用菌中硒多糖研究?jī)H限于從富 硒子實(shí)體和菌絲體中的提取條件的優(yōu)化，富硒多糖發(fā)酵條件的僅限于培養(yǎng)基成分，培養(yǎng)時(shí) 間和pH因素等因素的改變，在優(yōu)化的工藝條件下生產(chǎn)富硒粗多糖的產(chǎn)量仍然低，且工序復(fù) 雜。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明為了解決現(xiàn)有生產(chǎn)富硒粗多糖效率低的問題，提供一種荷葉離褶傘富硒胞 內(nèi)粗多糖的發(fā)酵工藝。
[0004] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的： 一種荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內(nèi)粗多糖的發(fā)酵工藝，具體包括以下步驟： a) 供試菌種 荷葉離褶傘菌種由河西學(xué)院甘肅省應(yīng)用真菌工程實(shí)驗(yàn)室提供，菌種保藏在"中國(guó)微生 物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心"，菌種保藏號(hào)CGMCC No. 1518,菌株號(hào)ZY48-1，專利 號(hào)：ZL200510096405. 0 ; b) 菌種活化 將荷葉離褶傘母種菌塊接入新鮮的PDA固體培養(yǎng)基上，置于22°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 15d后，再轉(zhuǎn)接一次，22°C培養(yǎng)15d，備用； c) 液體培養(yǎng)基制備 將200g馬鈴薯洗凈，去皮挖眼，切成2cm2的小塊，加水煮沸2(T30min，至馬鈴薯小塊煮 爛能被玻璃棒戳破即可，然后過300目篩得濾液，取其濾液80(T9(K)mL加入20g葡萄糖，使 葡萄糖溶化后加水至l〇〇〇mL，備用； d) 荷葉離褶傘富硒胞內(nèi)粗多糖發(fā)酵生產(chǎn) 將上述制備的液體培養(yǎng)基取l〇〇mL進(jìn)行滅菌，所述的滅菌條件為115°C，20min、115°C， 30min、121°C，15min、121°C，20min、121°C，30min 其中的任意一種，冷卻至 20?25°C后接入 荷葉離褶傘活化菌種塊，接種后置于22°C、121rpm下培養(yǎng)發(fā)酵，至發(fā)酵的2~12d時(shí)，加入同 等滅菌條件下滅菌的lmg/mL Na2Se03溶液，使硒在液體培養(yǎng)基中的濃度為(TlOug/mL，然后 繼續(xù)在22°C、121rpm下培養(yǎng)發(fā)酵一定時(shí)間，在所述的繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵期間每天測(cè)定荷葉離褶 傘菌絲體富硒胞內(nèi)粗多糖含量； e)利用響應(yīng)面曲線法得到最優(yōu)工藝條件 根據(jù)步驟d測(cè)定的荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內(nèi)粗多糖的含量(mg/100mL)，得到優(yōu)化單 因素發(fā)酵條件，然后利用響應(yīng)面曲線法得到荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內(nèi)粗多糖的最優(yōu)發(fā)酵 工藝條件。
[0005] 1.荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內(nèi)粗多糖的生產(chǎn) 1. 1滅菌條件對(duì)荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內(nèi)粗多糖生產(chǎn)的影響 將100mL的液體培養(yǎng)基和Na2Se03溶液，采取將液體培養(yǎng)基和Na 2Se03溶液分別滅菌后 再混合及兩者混合后再滅菌的不同方式，在115~121°C、滅菌2(T30min，混合時(shí)都使硒在液 體培養(yǎng)基中的濃度為10ug/mL，冷卻至20~25°C后，接入6片直徑為6mm的荷葉離褶傘活化 菌種塊，在2(T25°C、121rpm下培養(yǎng)至接種后第12d，測(cè)定荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內(nèi)粗多 糖含量。
[0006] 結(jié)合圖1所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從圖2中得知，液體培養(yǎng)基和Na2Se03溶液分別滅菌后 再混合的方式培養(yǎng)的荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內(nèi)粗多糖含量高；滅菌條件為12rC，20min 時(shí)，荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內(nèi)粗多糖含量達(dá)到最大，為70. 8 mg/100mL。
[0007] 優(yōu)選的液體培養(yǎng)基和Na2Se03溶液分別在121°C下滅菌20min后兩者再混合。
[0008] 1. 2硒濃度對(duì)荷葉離褶傘富硒胞內(nèi)粗多糖含量的影響 分別對(duì)100mL的液體培養(yǎng)基和lmg/mL Na2Se03溶液在優(yōu)選滅菌條件：12rC，20min下 滅菌，將Na2Se03溶液加入液體培養(yǎng)基中，使硒在液體培養(yǎng)基中的濃度為(TlOug/mL，冷卻至 20~25°C后接入6片直徑為6mm的荷葉離褶傘活化菌種塊，在2(T25°C、121rpm下培養(yǎng)至接 種后第12d，測(cè)定荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內(nèi)粗多糖含量。
[0009] 從圖3中得知，隨著液體培養(yǎng)基中加入Na2Se03量的增加，荷葉離褶傘菌絲體富硒 胞內(nèi)粗多糖含量呈現(xiàn)"N"字形，在濃度<4ug/mL和>4ug/mL時(shí)對(duì)荷葉離褶傘菌絲體中富硒 胞內(nèi)粗多糖含量的分泌均有抑制作用。在加硒濃度為4ug/mL時(shí)，荷葉離褶傘菌絲體中富 硒胞內(nèi)粗多糖含量達(dá)到113. 2 mg/100mL高于不加 Na2Se03時(shí)菌絲體中胞內(nèi)粗多糖103. 6 mg/100mL 的量。
[0010] 優(yōu)選的硒添加量為在液體培養(yǎng)基中加入Na2Se03溶液使硒在液體培養(yǎng)基中的濃度 為 4ug/mL〇
[0011] 1. 3硒添加時(shí)間對(duì)荷葉離褶傘富硒胞內(nèi)粗多糖含量的影響 將100mL的液體培養(yǎng)基，在12rC，20min下滅菌，冷卻至2(T25°C后接入6片直徑為 6mm的荷葉離褶傘活化菌種塊，在2(T25°C、121rpm下培養(yǎng)發(fā)酵至接種后第2~12d時(shí)，加入 同等條件下滅菌的Na 2Se03溶液，使硒在液體培養(yǎng)基中的濃度均為4ug/mL，繼續(xù)在20~25°C、 121rpm下培養(yǎng)至接種后第12d，測(cè)定荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內(nèi)粗多糖含量。
[0012] 如圖4所示，隨著硒添加時(shí)間的推遲，荷葉離褶傘菌絲體中富硒胞內(nèi)粗多糖含量 呈現(xiàn)波浪式增加，后逐步降低的趨勢(shì)，在發(fā)酵的第6d加入Na 2Se03后，富硒胞內(nèi)粗多糖含量 達(dá)到最大，為320. 6 mg/100mL，第6d后波浪式的降低，說明在菌絲體開始生長(zhǎng)的過程中加 入Na2Se03有助于積累菌絲體中富硒胞內(nèi)粗多糖。
[0013] 優(yōu)選的在液體培養(yǎng)基發(fā)酵的第6d加入硒為荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內(nèi)粗多糖合 成的優(yōu)選加入時(shí)間。
[0014] 1. 4培養(yǎng)時(shí)間對(duì)荷葉離褶傘富硒胞內(nèi)粗多糖含量的影響 將100mL的液體培養(yǎng)基，在121°C，20min下滅菌，冷卻至2(T25°C后接入6片直徑為6mm 的荷葉離褶傘活化菌種塊，在20~25°C、121rpm下培養(yǎng)，至接種后發(fā)酵的第6d時(shí)，加入同等 條件下滅菌的Na2Se0 3溶液，使硒在液體培養(yǎng)基中的濃度均為4ug/mL，繼續(xù)在22°C、121rpm 下培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間分別設(shè)定為接種后第疒13d，測(cè)定荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內(nèi)粗多糖含 量。
[0015] 如圖5所示，隨著發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，荷葉離褶傘菌絲體內(nèi)的富硒多糖含量呈 現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在接種后發(fā)酵培養(yǎng)的第7?9d，荷葉離褶傘富硒胞內(nèi)粗多糖含量 的增加比較緩慢，在接種后發(fā)酵培養(yǎng)的第9?10d，胞內(nèi)粗多糖含量迅速增加，至發(fā)酵第10d 達(dá)到最大值，為320.2 mg/100mL，第10d后富硒胞內(nèi)粗多糖含量開始降低，降低幅度較慢。
[0016] 優(yōu)選的培養(yǎng)時(shí)間為加入Na2Se03溶液后繼續(xù)在22°C、121rpm下培養(yǎng)，至接種后的第 10 do
[0017] 優(yōu)選工藝條件為：在250mL三角瓶中，加入100mL的液體培養(yǎng)基，在12rC，20min 下滅菌，冷卻至2(T25°C后接入6片直徑為6mm的荷葉離褶傘活化菌種塊，在22°C、121rpm 下培養(yǎng)，至發(fā)酵至接種后第6d時(shí)，加入同等條件下滅菌的lmg/mL Na2Se03溶液，使硒在液體 培養(yǎng)基中的濃度為4ug/mL，繼續(xù)在22°C、121rpm下培養(yǎng)發(fā)酵至接種后第10d，得到的荷葉離 褶傘菌絲體富硒胞內(nèi)粗多糖含量最高為320. 2 mg/100mL。
[0018] 2. Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，固定滅菌條件，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，以硒濃度、培 養(yǎng)時(shí)間和添加硒的時(shí)間為相應(yīng)變量，分別以Xp X2和X3表示，并以_1，〇, 1分別代表變量的 水平，Box -Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素和水平見表1，以荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內(nèi)粗多糖為 響應(yīng)值，見表2。
[0019] 表1 · Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平

【權(quán)利要求】
1. 一種荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內(nèi)粗多糖的發(fā)酵工藝，其特征在于：具體包括以下步 驟： a) 菌種活化 將荷葉離褶傘母種菌塊接入新鮮的固體培養(yǎng)基上，置于22°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15d 后，再轉(zhuǎn)接一次，22°C培養(yǎng)15d，備用； b) 液體培養(yǎng)基制備 將200g馬鈴薯洗凈，去皮挖眼，切成2cm2的小塊，加水煮沸2(T30min，至馬鈴薯小塊煮 爛能被玻璃棒戳破即可，過300目篩得濾液，取其濾液80(T9(K)mL加入20g葡萄糖，使葡萄 糖溶化后加水至l〇〇〇mL定容，備用； c) 荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內(nèi)粗多糖的發(fā)酵生產(chǎn) 取100mL步驟b制備的液體培養(yǎng)基置于115~121°C下滅菌15~30min，冷卻后接入6片 直徑為6mm荷葉離褶傘活化菌種塊，接種后放在2(T25°C、121rpm下培養(yǎng)發(fā)酵，發(fā)酵期間加 入同等條件下滅菌的Na 2Se03溶液，使硒在液體培養(yǎng)基中的濃度為(TlOug/mL，然后繼續(xù)在 2(T25°C、121rpm下培養(yǎng)，每天測(cè)定荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內(nèi)粗多糖的含量。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內(nèi)粗多糖的發(fā)酵工藝，其特征在 于：所述的步驟c中接種后放在2(T25°C、121rpm下培養(yǎng)發(fā)酵，接種后發(fā)酵2~12d時(shí)加入同 等滅菌條件下滅菌的Na 2Se03溶液。
3. 如權(quán)利要求1所述的一種荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內(nèi)粗多糖的發(fā)酵工藝，其特征在 于：所述的步驟c中加入Na2Se0 3溶液后繼續(xù)在20~25°C、121rpm下培養(yǎng)，培養(yǎng)至接種后的第 7?13d。
4. 如權(quán)利要求1所述的一種荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內(nèi)粗多糖的發(fā)酵工藝，其特征在 于：所述的步驟c取100mL的液體培養(yǎng)基，在121°C下滅菌20min，冷卻至20~25°C后接入 6片直徑為6mm的荷葉離褶傘活化菌種塊置于22°C、121rpm下培養(yǎng)發(fā)酵，至接種后的第6d 時(shí)，加入同等條件下滅菌的lmg/mL Na2Se03溶液，使硒在液體培養(yǎng)基中的濃度為4ug/mL，然 后繼續(xù)在22°C、121rpm下培養(yǎng)，直至接種后第10d測(cè)定荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內(nèi)粗多糖 的含量。
5. 如權(quán)利要求1所述的一種荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內(nèi)粗多糖的發(fā)酵工藝，其特征在 于：根據(jù)步驟c得到優(yōu)化單因素發(fā)酵條件，然后利用響應(yīng)面曲線法得到荷葉離褶傘菌絲體 富硒胞內(nèi)粗多糖的最佳發(fā)酵工藝條件。
6. 如權(quán)利要求1所述的一種荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內(nèi)粗多糖的發(fā)酵工藝，其特征在 于：所述的步驟a的固體培養(yǎng)基為PDA固體培養(yǎng)基。
【文檔編號(hào)】C12P19/04GK104152511SQ201410371991
【公開日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月31日
【發(fā)明者】高慧娟, 魏生龍, 席亞麗, 梁倩倩, 劉志芳, 袁承玲, 趙麗 申請(qǐng)人:甘肅祁連食用菌工程技術(shù)研究中心