一種細(xì)胞內(nèi)蛋白自誘導(dǎo)表達(dá)的方法
【專利摘要】一種細(xì)胞內(nèi)蛋白自誘導(dǎo)表達(dá)的方法，涉及基因工程領(lǐng)域。將費(fèi)氏弧菌(Vibrio?fischeri)群體感應(yīng)相應(yīng)的啟動(dòng)子和結(jié)構(gòu)基因克隆到質(zhì)粒里，構(gòu)建了一個(gè)自誘導(dǎo)的基因通路，該通路為：lux?pR-RBS-luxI-TT-lux?pL-RBS-luxR-TT-lux?pR，它不依賴誘導(dǎo)物就能通過通路本身的正反饋實(shí)現(xiàn)后續(xù)的目的蛋白在較高的菌體濃度下自動(dòng)地大量誘導(dǎo)表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞生長期與產(chǎn)物表達(dá)時(shí)間的分開，進(jìn)而提高了產(chǎn)物產(chǎn)率。由于不用添加誘導(dǎo)物，節(jié)約了成本和簡化操作過程，另一方面還可以通過特殊的啟動(dòng)子設(shè)計(jì)，使通路在檢測(cè)重金屬離子、農(nóng)業(yè)污染菌、檢測(cè)環(huán)境變化等方面具備應(yīng)用前景。
【專利說明】一種細(xì)胞內(nèi)蛋白自誘導(dǎo)表達(dá)的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞內(nèi)蛋白自誘導(dǎo)表達(dá)的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]20世紀(jì)90年代以來，大量的研究工作表明，細(xì)菌中普遍存在著細(xì)菌與細(xì)菌之間的信息交流，并介導(dǎo)著一系列生理行為的調(diào)節(jié)，這種信息交流即細(xì)菌的群體感應(yīng)。大概調(diào)控過程是:細(xì)菌利用信號(hào)分子感知周圍環(huán)境中自身或其他細(xì)菌的細(xì)胞群體密度的變化，并且信號(hào)分子隨著群體密度的增加而增加，當(dāng)群體密度達(dá)到一定閾值時(shí)，信號(hào)分子將啟動(dòng)菌體中特定基因的表達(dá)，改變和協(xié)調(diào)細(xì)胞之間的行為，從而實(shí)現(xiàn)單個(gè)細(xì)菌無法完成的某些生理功能和調(diào)節(jié)機(jī)制，呈現(xiàn)某種生理特性。
[0003]對(duì)海洋費(fèi)氏弧菌(Vibr1 fischeri)群體感應(yīng)相關(guān)基因的研究始于1983年，是至今為止研究最為透徹的群體感應(yīng)系統(tǒng)，因此它的luxI/luxR雙組分系統(tǒng)被視為革蘭氏陰性菌群體感應(yīng)的模式系統(tǒng)，其中IuxI基因編碼信號(hào)分子AHL合成酶，IuxR基因編碼調(diào)節(jié)蛋白。在低細(xì)胞密度時(shí)，每一個(gè)細(xì)胞僅合成基礎(chǔ)水平的組成型AHL，以避免被寄主細(xì)胞識(shí)別而產(chǎn)生免疫響應(yīng)；隨著細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，可自由進(jìn)出細(xì)胞的AHL在細(xì)胞內(nèi)外累積，當(dāng)足夠高的細(xì)胞密度使AHL達(dá)到域值水平(濃度為lOnmol/L)時(shí)，信號(hào)分子可以與細(xì)菌中的LuxR調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合形成二聚體復(fù)合物，該復(fù)合物結(jié)合在目的基因的啟動(dòng)子lux box區(qū)域，一方面可以激活下游熒光素酶基因(luxCDABE)的表達(dá)，導(dǎo)致弧菌發(fā)光；另一方面，迅速啟動(dòng)編碼AHL合成酶的IuxI基因表達(dá)，誘導(dǎo)AHL自身生產(chǎn)，促進(jìn)AHL信號(hào)分子的大量釋放而形成LuxR:: AHL復(fù)合物，形成正反饋，使上述QS系統(tǒng)不斷放大。
[0004] 通常，對(duì)發(fā)酵方法進(jìn)行的優(yōu)化中，主要著力于獲得產(chǎn)物的最高可能產(chǎn)率，對(duì)此問題的一種解決方法是獲得盡可能高的菌體濃度，常常在發(fā)酵的過程中，當(dāng)菌體濃度達(dá)到一定值時(shí)，開始補(bǔ)加一些誘導(dǎo)劑或者能夠代謝成誘導(dǎo)劑的物質(zhì)，使得產(chǎn)物在較高的菌體濃度下開始合成，如中國專利201010221511.8公開了一種利用乳糖誘導(dǎo)pMFH載體生產(chǎn)重組蛋白的發(fā)酵方法，該方法在發(fā)酵過程中添加乳糖誘導(dǎo)后再補(bǔ)加甘油作為碳源，以期提高生物量的同時(shí)也提高重組蛋白的表達(dá)量。上述的方法需要監(jiān)控細(xì)菌的生長狀況，以在合適的生長期補(bǔ)加誘導(dǎo)劑，有時(shí)甚至需要改變后期的培養(yǎng)條件，因此期望的是，能否通過一種基因通路的設(shè)計(jì)，在受體菌的生長前期，更多的能量營養(yǎng)被用于菌體的生長，當(dāng)達(dá)到一定的菌體濃度后，產(chǎn)物將被自動(dòng)地大量誘導(dǎo)合成，此時(shí)流入菌體生長的能量營養(yǎng)將變少，菌體把更多的能量營養(yǎng)用于產(chǎn)物的合成，使得產(chǎn)物產(chǎn)率達(dá)到一個(gè)較高的值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種細(xì)胞內(nèi)蛋白自誘導(dǎo)表達(dá)的方法。
[0006]本發(fā)明的具體步驟如下:
[0007]將費(fèi)氏弧菌(Vibr1 fischeri)群體感應(yīng)相應(yīng)的啟動(dòng)子和結(jié)構(gòu)基因克隆到質(zhì)粒里，構(gòu)建了一個(gè)自誘導(dǎo)的基因通路，該通路為:lux pR-RBS-lux1-TT-lux pL-RBS-luxR-TT-luxPR，它不依賴誘導(dǎo)物就能通過通路本身的正反饋實(shí)現(xiàn)后續(xù)的目的蛋白在較高的菌體濃度下自動(dòng)地大量誘導(dǎo)表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞生長期與產(chǎn)物表達(dá)時(shí)間的分開，進(jìn)而提高了產(chǎn)物產(chǎn)率。
[0008]所述基因通路,含有克隆于費(fèi)氏弧菌(Vibr1 fischeri)的luxR、luxI以及啟動(dòng)子lux pR和 lux pL ；
[0009]所含的IuxR不局限于野生型費(fèi)氏弧菌的luxR，它可以是經(jīng)過改良的IuxR或者是具有與野生型費(fèi)氏弧菌的IuxR相似功能的其他基因序列。
[0010]所含的IuxI不局限于野生型費(fèi)氏弧菌的luxl，它可以是經(jīng)過改良的IuxI或者是具有與野生型費(fèi)氏弧菌的IuxI相似功能的其他基因序列。
[0011]所含的Iux PR不局限于野生型費(fèi)氏弧菌的Iux PR，它可以是經(jīng)過改良的lux pR或者是其他特殊啟動(dòng)子。
[0012]所含的lux pL不局限于野生型費(fèi)氏弧菌的lux pL，它可以是經(jīng)過改良的lux pL或者是其他特殊啟動(dòng)子。
[0013]所述基因通路，無需添加如IPTG等的誘導(dǎo)物就能實(shí)現(xiàn)后續(xù)基因的誘導(dǎo)表達(dá)。
[0014]本發(fā)明構(gòu)建了一個(gè)模擬群體感應(yīng)的基因通路，將它導(dǎo)入受體菌中，使該受體細(xì)胞擁有所構(gòu)建的群體感應(yīng)系統(tǒng)，即將費(fèi)氏弧菌群體感應(yīng)相關(guān)基因結(jié)合特定啟動(dòng)子，構(gòu)建載體并導(dǎo)入大腸桿菌，即可實(shí)現(xiàn)人工構(gòu)建的群體感應(yīng)通路。群體感應(yīng)基因正反饋機(jī)制的存在，使得后續(xù)的目的蛋白基因在一個(gè)比較高的菌體濃度下自動(dòng)地大量誘導(dǎo)表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞生長期與產(chǎn)物表達(dá)時(shí)間的分開 ，進(jìn)而提高了產(chǎn)物產(chǎn)率。并且通過特殊的啟動(dòng)子設(shè)計(jì)，該通路還可應(yīng)用于檢測(cè)環(huán)境重金屬污染、檢測(cè)環(huán)境變化和農(nóng)業(yè)污染菌等方面。
[0015]本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于一方面由于不用添加誘導(dǎo)物，節(jié)約了成本和簡化操作過程，另一方面還可以通過特殊的啟動(dòng)子設(shè)計(jì)，使通路在檢測(cè)重金屬離子、農(nóng)業(yè)污染菌、檢測(cè)環(huán)境變化等方面具備應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為自誘導(dǎo)通路的質(zhì)粒譜圖。
[0017]圖2為通路的熒光曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0018]實(shí)施例一:
[0019]生物磚元件lux pR-RBS-lux1-TT的構(gòu)建
[0020]提取質(zhì)粒pSBlA2-RBS-luxI_TT ;經(jīng)Xbal/PstI的雙酶切產(chǎn)生約800bp的后端插入片段RBS-lux1-TT和約2000bp的質(zhì)粒骨架PSB1A2，膠回收其中后端插入片段條帶RBS-1ux1-TT ;同時(shí)提取質(zhì)粒pSBlA2_lux pR，經(jīng)Spel/PstI雙酶切生成約2000bp的后端載體片段PSB1A2-1ux pR ;連接上述兩個(gè)片段，轉(zhuǎn)化到DH5a中，涂布在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上，37°C培養(yǎng)，第二天挑單菌落，37°C LB液體培養(yǎng)基200r/min震蕩培養(yǎng)14h，提取質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI和PstI雙酶切和EcoRI單酶切，跑膠驗(yàn)證，單酶切的條帶大小約為3000bp，雙酶切的條帶分別為約900bp的目的片段lux pR-RBS-lux1-TT和2000bp左右的質(zhì)粒骨架PSB1A2。該工程菌于 _20°C保存，帶有質(zhì)粒 pSBlA2-lux pR-RBS-lux1-TT。
[0021]實(shí)施例二:
[0022]生物磚元件lux pR-RBS-lux1-TT-lux pL-RBS-luxR-TT-lux pR 的構(gòu)建
[0023]提取質(zhì)粒pSBlA2_lux pL-RBS-luxR-TT-lux pR,經(jīng) EcoRI/Xbal 雙酶切，產(chǎn)生3000bp的前端載體片段lux pL-RBS-luxR-TT-lux pR-pSBlA2。同時(shí)提取質(zhì)粒pSBlA2-lux pR-RBS-lux1-TT,經(jīng)EcoRI/Spel雙酶切，產(chǎn)生約900bp的前端插入片段lux pR-RBS-lux1-TT和2000bp的質(zhì)粒骨架pSBlA2，跑膠回收前端插入片段luxpR-RBS-lux1-TT ;連接上述的前端載體片段和前端插入片段，轉(zhuǎn)化到DH5a中，涂布在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上，37°C培養(yǎng)，第二天挑單菌落，37°C LB液體培養(yǎng)基200r/min震蕩培養(yǎng)14h，提取質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI和PstI雙酶切和EcoRI單酶切，跑膠驗(yàn)證，單酶切的條帶大小約為4000bp，雙酶切的條帶分別為約2000bp的質(zhì)粒骨架PSB1A2和約2000bp的目的片段 lux pR-RBS-lux1-TT-lux pL-RBS-luxR-TT-lux pR。該工程菌于-20°C保存,帶有質(zhì)粒 pSBlA2-lux pR-RBS-lux1-TT-lux pL-RBS-luxR-TT-lux pR。
[0024]實(shí)施例三:
[0025]生物磚元件RBS-EGFP-TT的構(gòu)建
[0026]提取質(zhì)粒PSB1A2-RBS，經(jīng)Spel/PstI雙酶切，產(chǎn)生約2000bp的后端載體片段PSB1A2-RBS ;同時(shí)提取質(zhì)粒pSBlA2_EGFP_TT，經(jīng)Xbal/PstI雙酶切，產(chǎn)生約2000bp的質(zhì)粒骨架和約800bp的后端插入片段EGFP-TT，跑膠回收后端插入片段EGFP-TT ;連接上述的后端載體和后端插入片段，轉(zhuǎn)化到DH5a中，涂布在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上，37°C培養(yǎng)，第二天挑單菌落，370C LB液體培養(yǎng)基200r/min培養(yǎng)14h，提取質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI和PstI雙酶切和EcoRI單酶切，跑膠驗(yàn)證，單酶切的條帶大小約為2900bp，雙酶切的條帶分別為約2000bp的質(zhì)粒骨架PSB1A2和約900bp的目的片段RBS-EGFP-TT。該工程菌于_20°C保存，帶有質(zhì)粒 PSB1A2-RBS-EGFP-TT。
[0027]實(shí)施例四:
[0028]自誘導(dǎo)通路生物磚兀件 lux pR-RBS-lux1-TT-lux pL-RBS-luxR-TT-luxpR-RBS-EGFP-TT 的構(gòu)建
[0029]提取質(zhì)粒pSBlA2_lux pR-RBS-lux1-TT-lux pL-RBS-luxR-TT-lux pR,經(jīng)Spel/PstI 雙酶切，得到約 4000bp 的后端載體片段 pSBlA2_lux pR-RBS-lux1-TT-luxpL-RBS-luxR-TT-lux pR ;同時(shí)提取質(zhì)粒 pSBlA2-RBS-EGFP_TT，經(jīng) Xbal/PstI 雙酶切，得到約900bp的后端插入片段RBS-EGFP-TT和約2000bp的質(zhì)粒骨架pSBlA2，膠回收后端插入片段。連接上述的后端插入片段RBS-EGFP-TT和后端載體片段pSBlA2-luxpR-RBS-lux1-TT-lux pL-RBS-luxR-TT-lux pR，轉(zhuǎn)化到 DH5a 中，涂布在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上，37°C培養(yǎng)，第二天挑單菌落，37°C LB液體培養(yǎng)基200r/min培養(yǎng)14h，提取質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI和PstI雙酶切和EcoRI單酶切，跑膠驗(yàn)證，單酶切的條帶大小約為4900bp，雙酶切的條帶分別為2000bp的質(zhì)粒骨架PSB1A2和2900bp的目的片段IuxpR-RBS-lux1-TT-lux pL-RBS-luxR-TT-lux pR-RBS-EGFP-TT。該工程菌于 _20°C保存，帶有質(zhì)粒 pSBlA2-lux pR-RBS-lux1-TT-lux pL-RBS-luxR-TT-lux pR-RBS-EGFP-TT。
[0030]實(shí)施例五:
[0031]對(duì)照組生物磚元件lux pL-RBS-luxR-TT-lux pR-RBS-EGFP-TT 的構(gòu)建
[0032]提取質(zhì)粒pSBlA2_lux pL-RBS-luxR-TT-lux pR,經(jīng) EcoRI/Spel 雙酶切，得到約1200bp的前端插入片段lux pL-RBS-luxR-TT-lux pR和約2000bp的質(zhì)粒骨架pSBlA2，跑膠回收前端插入片段；同時(shí)提取質(zhì)粒PSB1A2-RBS-EGFP-TT，經(jīng)EcoRI/Xbal雙酶切，得到約為2900bp的前端載體片段RBS-EGFP-TT-pSBlA2，連接上述的前端插入片段IuxpL-RBS-luxR-TT-lux pR和前端載體片段RBS-EGFP_TT-pSBlA2，轉(zhuǎn)化到DH5a中，涂布在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上，37°C培養(yǎng)，第二天挑單菌落，37°C LB液體培養(yǎng)基200r/min培養(yǎng)14h，提取質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI和PstI雙酶切和EcoRI單酶切，跑膠驗(yàn)證，單酶切的條帶大小約為4000bp，雙酶切的條帶分別為約2000bp的質(zhì)粒骨架PSB1A2和2000bp的目的片段lux pL-RBS-luxR-TT-lux pR-RBS-EGFP-TT。該工程菌于 _20°C保存，帶有質(zhì)粒 pSBlA2_luxpL-RBS-luxR-TT-lux pR-RBS-EGFP-TT。
[0033]實(shí)施例六:
[0034]熒光曲線的測(cè)定
[0035](I)菌體活化:從甘油管中接種自誘導(dǎo)通路菌液一份和對(duì)照組菌液兩份各100 μ L于20mL LB培養(yǎng)基中，同時(shí)加入20yL的50mg/ml的氨芐青霉素。37°C，200r/min震蕩活化約12h轉(zhuǎn)接。
[0036](2)接種培養(yǎng):活化后各取250 μ L菌液轉(zhuǎn)接于裝有50mL LB培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，同時(shí)加入50 μ I的50mg/ml的氨節(jié)青霉素,對(duì)照組其中一份在轉(zhuǎn)接2h后加信號(hào)分子AHL,作為陽性對(duì)照組，信號(hào)分子終濃度為200nmol/L，對(duì)照組另一份作為陰性對(duì)照組。37°C，200r/min震蕩培養(yǎng)。
[0037](3)熒光強(qiáng)度的測(cè)定:每隔I~2h定時(shí)取適量菌液，冰浴lOmin，然后4°C，5000r/min, 1min離心下收集菌體，并用600 μ I冰預(yù)冷的PBS緩沖液重懸，再次離心，用與原先菌液量同體積的PBS緩沖液重懸，冰浴或者4°C冰箱保存待測(cè)。稀釋適當(dāng)倍數(shù)后利用熒光分光光度計(jì)測(cè)量綠色熒光蛋白的熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長為480nm，發(fā)射波長為515nm?；厥站簻y(cè)其A6tltl值。利用熒光強(qiáng)度分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，熒光值=熒光強(qiáng)度/A6tltl。
[0038](4)繪制發(fā)光曲線:以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以熒光值為縱坐標(biāo)繪制發(fā)光曲線。
[0039](5)結(jié)果:與陽性對(duì)照組相比，自誘導(dǎo)通路(實(shí)驗(yàn)組)的熒光曲線在7~8h時(shí)才出現(xiàn)明顯的熒光值的上升，而陽性對(duì)照組在3~4h已有上升的趨勢(shì)，這是由于對(duì)照組加入的信號(hào)分子已達(dá)到啟動(dòng)閾值，在第一次取樣時(shí)已啟動(dòng)后續(xù)的EGFP基因表達(dá)，且表達(dá)量隨著時(shí)間不斷地累積，而實(shí)驗(yàn)組在前幾次取樣時(shí)由于信號(hào)分子的濃度未達(dá)到啟動(dòng)EGFP基因表達(dá)的閾值，GFP的量波動(dòng)在一個(gè)小范圍內(nèi)，直到7~8h，信號(hào)分子的濃度足夠高，GFP表達(dá)量才開始上升，說明實(shí)驗(yàn)組的通路能夠延滯后續(xù)蛋白的表達(dá)，即在較高的菌體濃度下蛋白的大量表達(dá)才會(huì)被啟動(dòng)。與陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的熒光值穩(wěn)定在50000~55000之間，在對(duì)數(shù)期甚至達(dá)到60000以上，而陰性對(duì)照組在整個(gè)生長時(shí)期的熒光值在200~800之間，即自誘導(dǎo)通路的熒光蛋白表達(dá)量比陰性對(duì)照組高出有60~70倍之多，可見自誘導(dǎo)通路通過自身正反饋的調(diào)節(jié)后可以實(shí)現(xiàn)蛋白的大量誘導(dǎo)表達(dá)。
[0040] 自誘導(dǎo)通路的質(zhì)粒譜圖參見圖1，通路的熒光曲線參見圖2。
【權(quán)利要求】
1.一種細(xì)胞內(nèi)蛋白自誘導(dǎo)表達(dá)的方法，其特征在于其具體步驟如下: 將費(fèi)氏弧菌(Vibr1 fischeri)群體感應(yīng)相應(yīng)的啟動(dòng)子和結(jié)構(gòu)基因克隆到質(zhì)粒里，構(gòu)建了一個(gè)自誘導(dǎo)的基因通路，該通路為:lux pR-RBS-lux1-TT-lux pL-RBS-luxR-TT-lux pR,它不依賴誘導(dǎo)物就能通過通路本身的正反饋實(shí)現(xiàn)后續(xù)的目的蛋白在較高的菌體濃度下自動(dòng)地大量誘導(dǎo)表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了 細(xì)胞生長期與產(chǎn)物表達(dá)時(shí)間的分開，進(jìn)而提高了產(chǎn)物產(chǎn)率。
2.如權(quán)利要求1所述一種細(xì)胞內(nèi)蛋白自誘導(dǎo)表達(dá)的方法，其特征在于所述基因通路，含有克隆于費(fèi)氏弧菌(Vibr1 fischeri)的luxR、IuxI以及啟動(dòng)子lux pR和lux pL。
3.如權(quán)利要求2所述一種細(xì)胞內(nèi)蛋白自誘導(dǎo)表達(dá)的方法，其特征在于所含的IuxR為野生型費(fèi)氏弧菌的luxR，或經(jīng)過改良的luxR，或具有與野生型費(fèi)氏弧菌的IuxR相似功能的其他基因序列。
4.如權(quán)利要求2所述一種細(xì)胞內(nèi)蛋白自誘導(dǎo)表達(dá)的方法，其特征在于所含的IuxI為野生型費(fèi)氏弧菌的IuxI，或經(jīng)過改良的IuxI，或具有與野生型費(fèi)氏弧菌的IuxI相似功能的其他基因序列。
5.如權(quán)利要求2所述一種細(xì)胞內(nèi)蛋白自誘導(dǎo)表達(dá)的方法，其特征在于所含的luxpR為野生型費(fèi)氏弧菌的lux pR,或經(jīng)過改良的lux pR,或其他特殊啟動(dòng)子。
6.如權(quán)利要求2所述一種細(xì)胞內(nèi)蛋白自誘導(dǎo)表達(dá)的方法，其特征在于所含的luxpL為野生型費(fèi)氏弧菌的lux pL,或經(jīng)過改良的lux pL,或其他特殊啟動(dòng)子。
7.如權(quán)利要求1所述一種細(xì)胞內(nèi)蛋白自誘導(dǎo)表達(dá)的方法，其特征在于所述基因通路，無需添加如IPTG的誘導(dǎo)物就能實(shí)現(xiàn)后續(xù)基因的誘導(dǎo)表達(dá)。
【文檔編號(hào)】C12N15/63GK104131018SQ201410373158
【公開日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月31日
【發(fā)明者】方柏山, 黃世陽, 彭江海, 王兆守 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)