基于氯化物過氧化物酶的工程菌及其實現(xiàn)方法
【專利摘要】一種基因工程【技術領域】的基于氯化物過氧化物酶的工程菌及其實現(xiàn)方法，以灰略紅鏈霉菌基因組DNA為模板，與含有酶切位點的引物進行PCR擴增得到氯化物過氧化物酶編碼基因；然后將該基因插入大腸桿菌表達載體pET‐22b(+)中得到含有氯化物過氧化物酶編碼基因的重組表達載體；再將重組表達載體導入大腸桿菌表達菌株，篩選得到氯化物過氧化物酶的工程菌。本發(fā)明針對現(xiàn)有技術存在的由于氯化物過氧化物酶在生物體內(nèi)多為胞內(nèi)酶且表達量較低導致的應用范圍和效果嚴重受限等不足，應用基因工程手段實現(xiàn)其體外的大量表達合成并最終實現(xiàn)木質素的快速降解。
【專利說明】基于氯化物過氧化物酶的工程菌及其實現(xiàn)方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及的是一種生物基因工程【技術領域】的基因及其工程菌株，具體是一種灰 略紅鏈霉菌的基于氯化物過氧化物酶的工程菌及其實現(xiàn)方法。

【背景技術】
[0002] 木質素是由四種醇單體（對香豆醇、松柏醇、5 -羥基松柏醇、芥子醇）形成的一種 復雜酚類聚合物。木質素是構成植物細胞壁的成分之一，具有聯(lián)結強化細胞的作用。此外， 木質素也是一種含許多負電集團的多環(huán)高分子有機物，對土壤中的高價金屬離子有較強的 親和力。
[0003]根據(jù)單體的不同，可將木質素分為3種類型：由紫丁香基丙烷結構單體聚合而成 的紫丁香基木質素 （S -木質素），由愈創(chuàng)木基丙烷結構單體聚合而成的愈創(chuàng)木基木質素 (G -木質素）和由對-羥基苯基丙烷結構單體聚合而成的對-羥基苯基木質素 （H -木質 素）。一般而言，木質素在裸子植物主要存在類型為愈創(chuàng)木基木質素（G)，雙子葉植物主要 含愈創(chuàng)木基-紫丁香基木質素 （G - S)，單子葉植物則為愈創(chuàng)木基-紫丁香基-對-羥基苯 基木質素 （G - S - H)。從植物學觀點出發(fā)，木質素就是包圍于管胞、導管及木纖維等纖維束 細胞及厚壁細胞外的物質；從化學觀點來看，木質素是由高度取代的苯基丙烷單元隨機聚 合而成的高分子，它與纖維素、半纖維素一起，形成植物骨架的主要成分，在數(shù)量上僅次于 纖維素。木質素填充于纖維素構架中增強植物體的機械強度，利于輸導組織的水分運輸和 抵抗不良外界環(huán)境的侵襲。
[0004] 木質素單體同時含有多種活性官能團，如羥基、羰基、羧基、甲基及其它側鏈結構。 其中羥基在木質素中存在較多，以醇羥基和酚羥基兩種形式存在，而酚羥基的多少又直接 直接影響木質素的物理和化學結構，如能反映出木質素的醚化和縮合程度，同時也能衡量 木質素的溶解性能和反應能力；在木質素的側鏈上，有對羥基安息香酸、香草酸、紫丁香酸、 對羥基肉桂酸、阿魏酸等酯型結構存在，這些酯型結構存在于側鏈的α位或 γ位。在側鏈 α位除了酯型結構外，還有醚型連接，或作為聯(lián)苯結構的碳-碳聯(lián)結。同酚羥基一樣，木質 素的側鏈結構也直接關系它的化學特性。
[0005]由于木質素的復雜結構，高分子量及高度疏水性，與纖維素與半纖維素相比，木 質素的降解相對較難。已發(fā)現(xiàn)的木質素降解酶主要有3類：木質素過氧化物酶（Lignin peroxidase)、猛過氧化物酶（Manganese peroxidase)和漆酶（Laccase)，此外，還有一些 輔助酶也參與木質素的降解如氯化物過氧化物酶（Chloro - peroxidase)和芳基醇氧化酶 (Aryl alcohol oxidase)?；衣约t鏈霉菌（Streptomyces griseorubens)作為一種廣泛 存在于土壤的細菌，具有很強的木質素降解能力并得到了研究者越來越多的關注。研究灰 略紅鏈霉菌降解木質素的分子機制，克隆關鍵木質素降解酶基因序列，對于開發(fā)新型木質 素降解酶制劑進而實現(xiàn)木質素的快速降解具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術存在的不足，提出一種基于氯化物過氧化物酶的工程菌及其 實現(xiàn)方法，通過本發(fā)明所述的方法能夠高效表達一種克隆自灰略紅鏈霉菌氯化物過氧化物 酶，可以克服氯化物過氧化物酶在原始菌株內(nèi)表達量較低等缺點，有助于解決肥料利用率 較低等問題，此外對于實現(xiàn)土壤中銨鹽的快速轉化進而培肥土壤，最終實現(xiàn)精準農(nóng)業(yè)具有 重大意義。
[0007] 本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的：
[0008] 本發(fā)明涉及一種氯化物過氧化物酶的工程菌，該工程菌為外源表達氯化物過氧化 物酶的大腸桿菌。
[0009] 所述的胞內(nèi)氯化物過氧化物酶具體為灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD -1氯化物過氧化物酶大亞基基因 SG -CP，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1 所示，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示；核苷酸序列為825bp，編碼274個氨基酸。
[0010] 所述的氯化物過氧化物酶編碼基因通過全基因組測序和PCR擴增的方式克隆獲 得。
[0011] 所述的灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1，現(xiàn)保藏于中國普通 微生物菌種保藏管理中心（CGMCC)，保藏編號為CGMCC No. 5706,保藏日期為2012年1月9 日，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所郵編100101。
[0012] 本發(fā)明涉及上述工程菌的實現(xiàn)方法，以灰略紅鏈霉菌基因組DNA為模板，與含有 酶切位點的引物進行PCR擴增得到氯化物過氧化物酶編碼基因；然后將該基因插入大腸桿 菌表達載體PET - 22b (+)中得到含有氯化物過氧化物酶編碼基因的重組表達載體；再將重 組表達載體導入大腸桿菌表達菌株，篩選得到氯化物過氧化物酶的工程菌。
[0013] 所述的含有酶切位點的引物包括：
[0014] CP - Nco I - F:GCCATGGTGCCGTTCGTCACCGCCGGCGAC
[0015] CP - EcoR I - R:GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGGCTCTCGATGAAGTCGAGCA
[0016] 所述的PCR擴增的條件為：98°C預變性3min ;98°C變性10s，68°C延伸45s ;30個 循環(huán)后68°C終延伸3min。
[0017] 所述的大腸桿菌表達菌株為Transetta(DE3)大腸桿菌。
[0018] 本發(fā)明涉及一種氯化物過氧化物酶的工程菌的應用，將其應用于氯化物過氧化物 酶的體外高效表達，并最終實現(xiàn)木質素的快速降解。 技術效果
[0019] 現(xiàn)有氯化物過氧化物酶在灰略紅鏈霉菌內(nèi)為胞內(nèi)酶且表達量很低，因此嚴重限制 了其使用范圍和效果；與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明提供了一種全新的氯化物過氧化物酶基因 序列；在特殊條件下（如高溫以及堿性）具有更穩(wěn)定的生物學活性；本發(fā)明通過構建外源 表達載體，實現(xiàn)了氯化物過氧化物酶的體外過表達，并通過在表達重組蛋白C端添加聚組 氨酸標簽的方法，維持蛋白活性的同時也最大程度的保證了蛋白純度。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1為灰略紅鏈霉菌氯化物過氧化物酶信號肽預測圖；
[0021] 圖2為灰略紅鏈霉菌氯化物過氧化物酶3D結構模型預測圖。

【具體實施方式】
[0022] 下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施 例。 實施例1
[0023] 本實施例包括以下步驟：
[0024] 1)灰略紅鏈霉菌的分離及培養(yǎng)
[0025] 灰略紅鏈霉菌分離自上海市浦江鎮(zhèn)收集的腐爛秸桿，保藏編號為CGMCC No. 5706。 將該菌種接種于LB液體培養(yǎng)基，32 °C培養(yǎng)48h。
[0026] 上述LB液體培養(yǎng)基組分為：蛋白胨10. Og/L，酵母提取物5. Og/L，NaCl 10. Og/L， pH6. 8 - 7. 2。在液體培養(yǎng)基中加入15. 0 - 20. Og/L瓊脂即得LB固體培養(yǎng)基。
[0027] 2)基因組DNA提取
[0028] 收集2. OmL菌液，12000rpm離心2min。棄上清，收集菌體沉淀，加入180 μ L溶菌酶 (20mg/mL)和 20yL EDTA 溶液（0.5M，pH 8.0)，37°C 處理 45min，加入 4yL RNase A(100mg/ mL)，震蕩混勻15s，室溫放置5min，隨后按照細菌DNA提取試劑盒（TIANGEN)操作說明完成 剩余操作，得到高純度基因組DNA。通過0. 8%瓊脂糖凝膠電泳確定基因組DNA質量，確保 無明顯RNA條帶，基因組條帶清洗、完整、無降解、無污染。
[0029] 3)基因組測序：確定全基因組鳥槍法（WGS)策略，采用第二代測序技術，構建不同 插入片段長度的文庫，采用Illumina Miseq(2X250bp)平臺進行測序。收集測序的原始數(shù) 據(jù)，對帶接頭、低質量的數(shù)據(jù)進行過濾，隨后采用Newbler v2. 8對去除接頭的測序數(shù)據(jù)進行 從頭拼接，構建contig及scaffold，最后使用GapCloser程序進行缺口填補得到鏈霉菌基 因組草圖。
[0030] 4)蛋白編碼基因功能預測：采用Glimmer 3. 0軟件對全基因組序列進行基因預 測?；蝾A測模型選取自我訓練基因預測模型，即提取拼裝序列中最長的序列，以該序列作 為基因預測模型訓練的序列。然后以該序列構建的基因預測模型，對所有序列進行基因預 測，設定開放閱讀框的長度為ll〇bp，其余參數(shù)為Glimmer 3. 0的默認設置。
[0031] 5)氯化物過氧化物酶膜定位預測：采用SignalP 4. 1分別對氯化物過氧化物酶氨 基酸序列進行信號肽模擬預測，如圖1所示。結果表明氯化物過氧化物酶不存在明顯的信 號肽序列，推測該酶為胞內(nèi)酶。
[0032] 6)氯化物過氧化物酶3D模型預測：運用PHYRE 2在線程序對氯化物過氧化物 酶的3D空間模型進行預測。結果表明氯化物過氧化物酶與PDB數(shù)據(jù)庫中已有蛋白模型 (c4d9jl)的最高相似度分別可達33%，預測結果具有100%可信度。如圖2所示，該氯化物 過氧化物酶C端（已注明）裸露在蛋白外面，判定此處為聚組氨酸（HIS 6 · Tag)的連接位 點。
[0033] 7)氯化物過氧化物酶核苷酸序列驗證：根據(jù)全基因組測序結果，設計PCR引物如 下：
[0034] CP - F:ATGCCGTTCGTCACCGCCGGCG
[0035] CP - R:TCAGCTCTCGATGAAGTCGAGCAGGTC
[0036] 以灰略紅鏈霉菌JSD -1基因組DNA為模板，進行PCR擴增并通過瓊脂糖凝膠電泳 檢測，結果表明片段約為800bp，將PCR產(chǎn)物切膠回收，使用DNA A - Tailing Kit(TaKaRa) 加 A后連接到T - Vector PMD? 19 - T (TaKaRa)，并將連接產(chǎn)物轉入DH5 α大腸桿菌，在氨 芐（50 μ g/mL)抗性平板挑選陽性克隆，搖菌提取質粒測序。測序結果證實插入片段與基因 組測序結果完全吻合，即為本發(fā)明序列表中的SEQ ID NO. 1。
[0037] 上述PCR擴增條件為：98°C預變性3min ;98°C變性10s，55°C退火15s，68°C延伸 45s ;30個循環(huán)后68°C終延伸3min。
[0038] 上述 PCR 反應使用的 DNA 聚合酶為 PrimeSTAR? GXL Polymerase (TaKaRa)。。 實施例2
[0039] 氯化物過氧化物酶表達載體構建
[0040] 1)根據(jù)氯化物過氧化物酶序列，設計含有酶切位點的引物，序列如下：
[0041] CP - Nco I - F:GCCATGGTGCCGTTCGTCACCGCCGGCGAC
[0042] CP - EcoR I - R:GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGGCTCTCGATGAAGTCGAGCA
[0043] 2)以灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens)基因組DNA為模板，用含有 Nco I和EcoR I酶切位點引物進行PCR擴增獲得氯化物過氧化物酶基因序列，使用DNA A - Tailing Kit 加 A 后連接到 T - Vector PMD? 19 - T (TaKaRa)，并將連接產(chǎn)物轉入 DH5 α 大腸桿菌內(nèi)。挑選陽性克隆，搖菌提取質粒測序。Nco I和EcoR I進行雙酶切（37°C)，回 收氯化物過氧化物酶DNA片段CP。用相同內(nèi)切酶酶切表達載體pET-22b (+)并回收載體 DNA片段。將CP與載體片段混合，T4DNALigase(TaKaRa)過夜連接（16°C )，將連接產(chǎn)物轉 入DH5 α大腸桿菌感受態(tài)細胞內(nèi)，通過抗性平板及菌落PCR篩選含有質粒pET - 22 - CP的 陽性克隆。挑取陽性克隆接種于含有氨芐青霉素（50 μ g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，180rpm、 37 °C培養(yǎng)16小時后提取質粒。
[0044] 上述PCR擴增條件為：98°C預變性3min ;98°C變性10s，68°C延伸45s ;30個循環(huán) 后68°C終延伸3min。
[0045] 3)氯化物過氧化物酶過表達轉基因菌株的構建：
[0046] 將上述氯化物過氧化物酶表達載體pET - 22 - CP轉入Transetta(DE3)大腸桿菌， 并在含有氨芐青霉素（50 μ g/mL)和氯霉素（34 μ g/mL)的LB固體培養(yǎng)基上篩選，獲得氯化 物過氧化物酶過表達菌株。
[0047] 上述的Transetta(DE3)具有以下特征：該菌株具有氯霉素（Canf)，且含有大腸桿 菌缺乏的6種稀有密碼子（AGA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA)對應的tRNA，可有效提高外源基 因，尤其是真核生物及鏈霉菌等高GC含量生物基因在原核系統(tǒng)中的表達水平。
【權利要求】
1. 一種氯化物過氧化物酶的工程菌，其特征在于，該工程菌為外源表達氯化物過氧化 物酶的大腸桿菌； 所述的胞內(nèi)氯化物過氧化物酶具體為灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1氯化物過氧化物酶大亞基基因 SG - CP,其核苷酸序列如SEQ ID No· 1所示,其氨基 酸序列如SEQ ID No. 2所示；核苷酸序列為825bp，編碼274個氨基酸。
2. 根據(jù)權利要求1所述的工程菌，其特征是，所述的灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens)JSD - 1，現(xiàn)保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC)，保藏編號為 CGMCC No. 5706,保藏日期為2012年1月9日。
3. -種根據(jù)權利要求1或2中所述的工程菌的實現(xiàn)方法，其特征在于，以灰略紅鏈霉菌 基因組DNA為模板，與含有酶切位點的引物進行PCR擴增得到氯化物過氧化物酶編碼基因； 然后將該基因插入大腸桿菌表達載體PET -22b (+)中得到含有氯化物過氧化物酶編碼基因 的重組表達載體；再將重組表達載體導入大腸桿菌表達菌株，篩選得到氯化物過氧化物酶 的工程菌。
4. 根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征是，所述的含有酶切位點的引物包括： CP - Nco I - F:GCCATGGTGCCGTTCGTCACCGCCGGCGAC CP - EcoR I - R:GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGGCTCTCGATGAAGTCGAGCA。
5. 根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征是，所述的PCR擴增的條件為：98°C預變性 311^11;98°(：變性1〇3,681：延伸453;30個循環(huán)后68°(：終延伸31^11。
6. 根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征是，所述的大腸桿菌表達菌株為 Transetta(DE3)大腸桿菌。
7. -種含有上述任一權利要求所述的氯化物過氧化物酶的工程菌及其應用，其特征在 于，將其用于氯化物過氧化物酶的體外高效表達，并最終實現(xiàn)木質素的快速降解。
【文檔編號】C12R1/19GK104152391SQ201410374652
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月31日 優(yōu)先權日:2014年7月31日
【發(fā)明者】周培, 馮?，|, 孫玉靜, 支月娥, 羅艷青 申請人:上海交通大學