一種r-3-氨基丁醇的生物制備方法
【專利摘要】一種R-3-氨基丁醇的生物制備方法，按照人工設(shè)計如SEQIDNO：1所示的序列進行全基因合成，克隆入pET24a得到重組表達載體；將重組表達載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌獲得可以重組D-轉(zhuǎn)氨酶基因工程菌；對該菌進行培養(yǎng)制備重組D-轉(zhuǎn)氨酶；反應(yīng)溶液中加入終濃度為10-300mmol/L的3-羰基丁醇、質(zhì)量百分濃度為2-15%的二甲基亞砜或乙腈、終濃度為0.1-1mmol/L的磷酸吡哆醛，終濃度為0.02-1mol/L的異丙胺或D-丙氨酸和質(zhì)量百分濃度為0.01-1%的重組D-轉(zhuǎn)氨酶組成反應(yīng)體系進行反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后提取反應(yīng)液中的R-3-氨基丁醇；本發(fā)明成本低，轉(zhuǎn)化率達到97%以上和產(chǎn)物得率大于87%，沒有副產(chǎn)物，更適合工業(yè)應(yīng)用。
【專利說明】—種R-3-氨基丁醇的生物制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種R-3-氨基丁醇，具體的說是一種R-3-氨基丁醇的生物制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]生物催化具有反應(yīng)條件溫和、效率高、立體和區(qū)域選擇性強、環(huán)境友好等特點，因此生物催化在新藥的研究和開發(fā)中得到廣泛的應(yīng)用。此外，利用理性設(shè)計和定向進化對生物催化劑進行改造優(yōu)化，如提高催化劑的穩(wěn)定性和底物選擇性，將使其能夠更好地應(yīng)用于生產(chǎn)工藝。
[0003]R-3-氨基丁醇在有機合成和藥物生產(chǎn)中有著廣泛的用途，結(jié)構(gòu)式如下:

【權(quán)利要求】
1.一種R-3-氨基丁醇的生物制備方法，其特征在于:其制備方法包括以下步驟: 步驟一、重組D-轉(zhuǎn)氨酶基因工程菌的制備 按照人工設(shè)計如SEQ ID NO:1所示的序列進行全基因合成，克隆入pET24a的Nde I和Hind III位點；轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細胞；挑取陽性轉(zhuǎn)化子并測序鑒定后，得到重組表達載體；將重組表達載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)菌株中，獲得可以誘導(dǎo)表達重組D-轉(zhuǎn)氨酶的重組D-轉(zhuǎn)氨酶基因工程菌； 步驟二、重組D-轉(zhuǎn)氨酶的制備 將重組D-轉(zhuǎn)氨酶基因工程菌接種到含有卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C培養(yǎng)16h，得到種子培養(yǎng)液；將種子培養(yǎng)液接種到含卡那霉素抗性的TB液體培養(yǎng)基中，接種量為含卡那霉素抗性的TB液體培養(yǎng)基體積的1% ;然后置于37°C下培養(yǎng)至0D600值為0.4-1.0，加入異丙基-β -D-半乳糖苷或乳糖，置于28-30°C繼續(xù)培養(yǎng)16_24h后，離心收集菌體；采用磷酸鹽緩沖液將收集后的菌體洗一次之后重懸，將懸浮液置于冰浴中超聲破碎后再離心，所得上清液即為重組D-轉(zhuǎn)氨酶，檢測其中的蛋白含量，備用； 步驟三、R-3-氨基丁醇的制備 在反應(yīng)溶液中依次加入終濃度為10-300mmol/L的底物、質(zhì)量濃度為2-15%的助溶劑、終濃度為0.1-lmmol/L的輔因子、終濃度為0.02-lmol/L的氨基供體和質(zhì)量濃度為0.2-0.4%的重組D-轉(zhuǎn)氨酶組成反應(yīng)體系；將該反應(yīng)體系在25-30°C的條件下反應(yīng)24_26h ；反應(yīng)結(jié)束后，檢測反應(yīng)液中R-3-氨基丁醇的含量；然后用乙酸乙酯或二氯甲烷提取反應(yīng)液中的R-3-氨基丁醇，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙酯或二氯甲烷，即得到R-3-氨基丁醇； 所述底物為3-羰基丁醇；所述的反應(yīng)溶液為pH為7.0-10.0的50-100mmol/L磷酸鹽緩沖液、Tirs緩沖液或碳酸氫鹽緩沖液；所述的助溶劑為二甲基亞砜或乙腈；所述的輔因子為磷酸吡哆醛；所述的氨基供體為異丙胺或D-丙氨酸。
2.如權(quán)利要求1所述的R-3-氨基丁醇的生物制備方法，其特征在于:步驟二中所述超聲破碎的具體方法為:將懸浮液置于冰浴中采用超聲波破碎，參數(shù)為工作5s，間歇15s，循環(huán)數(shù)30。
3.如權(quán)利要求1所述的R-3-氨基丁醇的生物制備方法，其特征在于:步驟二所述檢測上清液中蛋白含量的方法為Bradford法。
4.如權(quán)利要求1所述的R-3-氨基丁醇的生物制備方法，其特征在于:步驟三中反應(yīng)體系的反應(yīng)過程，取樣采用高效液相進行檢測樣品中R-3-氨基丁醇的生成量，以監(jiān)控其反應(yīng)過程。
【文檔編號】C12N9/10GK104131048SQ201410375457
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年8月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月1日
【發(fā)明者】范文超, 丁鵬 申請人:洛陽華榮生物技術(shù)有限公司