氨基甲酸酯類農(nóng)藥降解酶CFH與其編碼基因cfd以及二者的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于應用環(huán)境微生物和農(nóng)業(yè)領域，涉及氨基甲酸酯類農(nóng)藥降解酶CFH與其編碼基因cfd以及二者的應用。本發(fā)明降解呋喃丹等氨基甲酸酯類農(nóng)藥降解酶基因cfd的開放閱讀框全長為2139?bp，序列如SEQ?ID?NO.1所示，其編碼產(chǎn)物CFH含712個氨基酸，序列為SEQ?ID?NO.2。CFH能降解呋喃丹等氨基甲酸酯類農(nóng)藥。基因cfd可用于構建可降解呋喃丹等氨基甲酸酯類農(nóng)藥的轉(zhuǎn)基因工程菌或作物，降解酶CFH可用于消除土壤、水體和農(nóng)產(chǎn)品中呋喃丹等氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留。
【專利說明】氨基甲酸酯類農(nóng)藥降解酶CFH與其編碼基因cfd以及二者的應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于應用環(huán)境微生物和農(nóng)業(yè)領域，涉及能降解呋喃丹等氨基甲酸酯類農(nóng)藥的酶CFH與其編碼基因cfd以及二者的應用。

【背景技術】
[0002]我國人多地少，大量使用化學農(nóng)藥是保證作物高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的必要措施，但同時也帶來嚴重污染。農(nóng)藥的難降解性，導致土壤和農(nóng)產(chǎn)品殘留率較高，如目前在長三角和珠三角農(nóng)田土壤檢出率達90%以上，受農(nóng)藥污染的農(nóng)產(chǎn)品更是如此，如國際綠色和平組織2009年檢測結果表明，我國90 %農(nóng)產(chǎn)品檢出農(nóng)藥殘留，66 %的樣品殘留至少5種以上農(nóng)藥，2010年4月份發(fā)生的青島毒韭菜事件就是有機磷殺蟲劑污染導致的，造成了惡劣影響。生物(酶)降解技術是一種新型原位生物修復技術，具有效果好、費用低和無二次污染等特點，是降解土壤和農(nóng)產(chǎn)品上農(nóng)藥殘留的理想方式。
[0003]呋喃丹等氨基甲酸酯類農(nóng)藥是一類在世界范圍內(nèi)應用廣泛的殺蟲劑。該類農(nóng)藥毒性作用機理與有機磷農(nóng)藥相似，主要是抑制膽堿酯酶活性。氨基甲酸酯類農(nóng)藥可經(jīng)呼吸道、消化道侵入機體，也可經(jīng)皮膚粘膜緩慢吸收，主要分布在肝、腎、脂肪和肌肉組織中。近年來，由于其高毒性以及頻繁發(fā)生的農(nóng)藥中毒事件，部分品種被世界各國限用，甚至禁用。以呋喃丹為例，歐盟和加拿大已禁用，美國禁用于任何作物(人食用)；2014年版的中國國家禁用和限用農(nóng)藥名單中，呋喃丹屬于限用農(nóng)藥，蔬菜、果樹、茶樹、中草藥材是其禁止使用的范圍。這也就意味著呋喃丹等氨基甲酸酯類農(nóng)藥仍然在被大量使用，其在土壤和農(nóng)產(chǎn)品中殘留是依然我們要面對和解決的問題。
[0004]要利用生物(酶)降解技術解決氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留問題首先要獲得優(yōu)良的菌株和基因資源。目前能夠降解該類農(nóng)藥的微生物已有較多報道，但是相應的基因資源卻報道很少。目前共有三個相關的基因cehA (GenBank登陸號:AB069723)、cahA (GenBank登陸號:AB081302)和mcd，前兩個基因編碼的降解酶只對西維因有較強活性，mcd的序列雖然可以從GenBank (登陸號:AF160188)中獲得，但并未有直接的文獻報道，相關文獻只報道了其出發(fā)菌株、酶的純化和基因的定位。因此，至今還沒有針對氨基甲酸酯類農(nóng)藥的廣譜、高效降解酶基因的報道。這限制了人們利用生物(酶)降解技術消除土壤和農(nóng)產(chǎn)品上的氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的上述不足，提供呋喃丹等氨基甲酸酯類農(nóng)藥降解酶CFH與其編碼基因cfd以及二者的應用?；騝fd可用于構建降解氨基甲酸酯類農(nóng)藥的轉(zhuǎn)基因微生物或植物，亦可用于生產(chǎn)降解氨基甲酸酯類農(nóng)藥的酶制劑，用于消除土壤、水體和農(nóng)產(chǎn)品中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留。
[0006]本發(fā)明的目的可通過如下技術方案實現(xiàn):
[0007]一種氨基甲酸酯類農(nóng)藥降解酶基因cfd，其核苷酸序列為SEQ ID N0.1。
[0008]基因cfd的出發(fā)菌株鞘氨醇桿菌(Sphingobium sp.) YBL3保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC N0:M208076。質(zhì)譜分析結果表明菌株YBL3的粗酶液可以把呋喃丹、西維因和異丙威等氨基甲酸酯類農(nóng)藥的酰胺鍵斷裂而降解這些農(nóng)藥，消除其毒性。
[0009]克隆氨基甲酸酯類農(nóng)藥降解酶基因的策略為鳥槍法。首先提取菌株YBL3的總DNA,總DNA采用Sau3AI部分酶切后和BamHI用酶切的質(zhì)粒pUC118酶連，酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞獲得總DNA文庫。用高效液相色譜(HPLC)檢測法篩選出能夠降解呋喃丹的克隆，然后將用降解能力的克隆測序、分析，確定目標基因的開放閱讀框(ORF)。最后獲得目標基因的開放閱讀框大小為2139bp，命名為cfd，其編碼的酶命名為CHL這是首次針對氨基甲酸酯類農(nóng)藥的廣譜、高效降解酶基因的報道。
[0010]所述Cfd基因所編碼的酶CFH，其氨基酸序列為:SEQ ID N0.2。
[0011]含有所述cfd基因的重組表達載體。
[0012]所述的重組表達載體優(yōu)選將所述cfd基因插入pET_29a(+)的NdeI和EcoRI位點之間所得
[0013]含有所述cfd的基因工程菌。
[0014]所述的基因工程菌的出發(fā)菌株為大腸桿菌BL21 (DE3)。
[0015]所述cfd基因在構建降解氨基甲酸酯類農(nóng)藥的轉(zhuǎn)基因作物中的應用。
[0016]所述cfd基因在去除農(nóng)產(chǎn)品、土壤和水體中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留中的應用。
[0017]所述降解酶era在降解氨基甲酸酯類農(nóng)藥中的應用。
[0018]所述降解酶era在去除農(nóng)產(chǎn)品、土壤和水體中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留中的應用。
[0019]所述重組表達載體在構建降解氨基甲酸酯類農(nóng)藥的轉(zhuǎn)基因作物中的應用。
[0020]所述重組表達載體在去除水體中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留中的應用。
[0021]有益效果
[0022]1.本發(fā)明用鳥槍法成功的從菌株YBL3(CCTCC N0:M208076)中克隆出基因cfd。在GenBank比對結果表明該基因為一個新的基因，全長(從起始密碼子到終止密碼子)為2139bp，編碼712個氨基酸。
[0023]2.本發(fā)明中的降解酶CFH或攜帶cfd基因的工程菌能高效降解氨基甲酸酯類農(nóng)藥。基因cfd可用于構建降解氨基甲酸酯類農(nóng)藥的轉(zhuǎn)基因微生物或植物，亦可用于生產(chǎn)降解氨基甲酸酯類農(nóng)藥的酶制劑，用于消除土壤、水體和農(nóng)產(chǎn)品中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1基因cfd在BL21 (pET_29a (+))中表達策略圖。
[0025]圖2基因cfd在BL21 (pET_29a(+))中表達產(chǎn)物降解呋喃丹生成呋喃酚的質(zhì)譜檢測圖。圖2A為降解產(chǎn)物的一級質(zhì)譜圖；圖2B為物質(zhì)SI (呋喃丹)的二級質(zhì)譜圖；圖2C為物質(zhì)S2 (呋喃酚)的二級質(zhì)譜圖。
[0026]生物材料保藏信息
[0027]鞘氨醇桿菌YBL3，分類命名為Sphingobium sp.YBL3，保存在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址為中國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCC N0:M208076，保藏日期為2008年5月22日。

【具體實施方式】
[0028]實施例1基因cfd的克隆
[0029](I)細菌基因組總DNA的提取
[0030]YBL3 (CCTCC N0:M208076)在液體 LB 培養(yǎng)基中(37°C、200rpm、18h)大量培養(yǎng)后，采用CTAB法提取高純度、大片段的菌株YBL3基因組總DNA，溶于TE緩沖液(pH8.0)中，置于-20°C保藏，具體方法參考F.奧斯伯等編的《精編分子生物學實驗指南》。
[0031](2) pUCl 18 (BamHI)購買于寶生物工程(大連)有限公司。
[0032](3)采用Sau3AI部分酶切菌株YBL3總DNA。
[0033](4)DNA 的回收
[0034]酶切后的總DNA通過電泳(TAE緩沖液)進行純化，采用axygenb1sciences (China)回收試劑盒進行回收，回收的 DNA溶于 10mmol /I,的 Tris *HC1 (pH8.0)中，置于-20°C保藏 。
[0035](5)酶連
[0036]建立如下反應體系:
[0037]pUCl 18(5amHI)0.1 μ§
總DN A片段0.1 μ§
1x連接_緩沖液I μΙ
[0038]
Τ4 DNA連I妾酶0.5 μL
加雙蒸水至10 μL
[0039]16°C溫育 12 小時。
[0040](6)轉(zhuǎn)化及篩選
[0041]取10 μ I酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化200 μ I大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞(TaKaRa，Code:D9057)，具體方法參照F.奧斯伯等編的《精編分子生物學實驗指南》P23。涂布含有100mg/kg氨芐青霉素的LB平板，培養(yǎng)24h后分別挑選克隆子進行擴大培養(yǎng)，將菌體細胞重懸于PBS (pH7.0)中，置于恒溫搖床中180rpm，30°C振蕩培養(yǎng)2小時，取出PBS菌懸液，調(diào)節(jié)菌體濃度至0D_ = 2.0便制成了菌株克隆子的靜息細胞，靜息細胞懸液中加入50mg.L-1的呋喃丹，180rpm，30°C，于恒溫搖床中振蕩培養(yǎng)24h。加入等體積二氯甲烷終止反應并劇烈振蕩提取產(chǎn)物，有機相經(jīng)無水硫酸鈉脫水、氮氣吹干后溶于100μ L甲醇待測。用HPLC檢測克隆子能否降解呋喃丹，液相條件為:色譜柱，Kromasil 100-5C18 (4.6mmX 250mmX 5 μ m)；流動相，甲醇/水(體積比70/30);流速，Iml ?mirT1 ;紫外檢測器,波長280nm和230nm ;進樣量,20 μ I ο
[0042](7)基因核苷酸序列測定
[0043]將(6)中獲得的能降解呋喃丹的陽性克隆子委托上海英駿生物技術有限公司進行序列測定，呋喃丹降解酶基因cfd的核苷酸序列為SEQ ID N0.1，根據(jù)基因cfd核苷酸序列所推到的712個氨基酸序列為SEQ ID N0.2。
[0044]實施例3呋喃丹水解酶Cm在BL21 (pET_29a (+))中的高效表達及其功能測定(技術路線圖1)
[0045](I)基因cfd的PCR擴增
[0046]以正向引物:5’-TCTGGACATATGTCTAGTGACAAACTCCAT-3’ (SEQ ID N0.3)和反向引:5? -TCTGGAGAATTCATTGTCTTTTTGCATCA-3>(SEQ ID N0.4)為引物，用 PCR 從菌株 YBL3
總DNA中擴增出基因cfd序列。
[0047]擴增體系:

【權利要求】
1.一種氨基甲酸酯類降解酶基因Cfd，其核苷酸序列為SEQ ID N0.1。
2.權利要求1所述的基因cfd所編碼的降解酶CFH，其氨基酸序列為SEQID N0.2。
3.含有權利要求1所述的基因cfd的重組表達載體。
4.含有權利要求1所述的基因cfd的基因工程菌。
5.根據(jù)權利要求4所述的基因工程菌，其特征在于所述的基因工程菌的出發(fā)菌株為大腸桿菌 BL21(DE3)。
6.權利要求1所述基因cfd在構建降解氨基甲酸酯類農(nóng)藥的轉(zhuǎn)基因作物中的應用。
7.權利要求1所述基因cfd在去除水體中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留中的應用。
8.權利要求2所述降解酶CFH在消除土壤、水體或農(nóng)產(chǎn)品中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留中的應用。
9.權利要求3所述重組表達載體在構建降解氨基甲酸酯類農(nóng)藥的轉(zhuǎn)基因作物中的應用。
10.權利要求1所述重組表達載體在去除水體中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留中的應用。
【文檔編號】C12N15/82GK104178504SQ201410378234
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月1日 優(yōu)先權日:2014年8月1日
【發(fā)明者】閆新, 洪青, 李順鵬, 谷濤, 何健, 蔣建東 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學