單個多能干細(xì)胞培養(yǎng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及多能干細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域以及易于在工業(yè)水平培養(yǎng)多能干細(xì)胞的方法。本發(fā)明提供了用于已經(jīng)用酶釋放為單細(xì)胞的多能干細(xì)胞的維持、傳代和分化的方法。尤其是，本發(fā)明提供了用于已經(jīng)釋放為單細(xì)胞的多能干細(xì)胞的維持、傳代和分化，而沒有隨后的多能性損失，并且沒有染色體異常增加的方法。
【專利說明】單個多能干細(xì)胞培養(yǎng)
[0001] 申請為分案申請，原申請的申請日為2008年6月30日，申請?zhí)枮?200880104926. 8 (PCT/US2008/068782)，發(fā)明名稱為"單個多能干細(xì)胞培養(yǎng)"。
[0002] 本發(fā)明涉及多能干細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域以及易于在工業(yè)水平培養(yǎng)多能干細(xì)胞的方法。
[0003] 背景
[0004] 多能干細(xì)胞，例如胚胎干細(xì)胞，具有分化成為所有成體細(xì)胞類型的能力。同樣地， 胚胎干細(xì)胞可以是由于疾病、感染或先天性異常損害的器官的替換細(xì)胞和組織的來源。體 外增殖細(xì)胞同時維持它們多能性的困難妨礙了胚胎干細(xì)胞作為替換細(xì)胞來源使用的潛力。
[0005] 當(dāng)前培養(yǎng)未分化的胚胎干細(xì)胞的方法需要復(fù)雜的培養(yǎng)條件，例如在有飼養(yǎng)細(xì)胞層 的情況下培養(yǎng)該胚胎干細(xì)胞?？蛇x擇地，通過接觸飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物獲得的培養(yǎng)基可以用來 培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞。采用這些方法的培養(yǎng)系統(tǒng)往往使用從與培養(yǎng)的干細(xì)胞不同的物種獲得的 細(xì)胞（異種細(xì)胞）。另外，這些培養(yǎng)系統(tǒng)可能補(bǔ)充動物血清。
[0006] 例如，Reubinoff 等（Nature Biotechnologyl8 :399_4〇4(2〇00))和 Thompson 等 (Science6Novemberl998 :Vol. 282. no. 5391，ρρ· 1145-1147)公開了使用小鼠胚胎成纖維 細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞層從人類胚泡的胚胎干細(xì)胞系的培養(yǎng)。
[0007] 在另一個例子中，W02005014799公開了用于哺乳動物細(xì)胞維持、增殖和分化的條 件培養(yǎng)基。W02005014799陳述："根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的培養(yǎng)基以鼠科動物細(xì)胞，尤其是那些稱 為MMH(Met鼠科動物肝細(xì)胞）的已分化且永生化的轉(zhuǎn)基因肝細(xì)胞的細(xì)胞分泌活性為條件。"
[0008] 然而，異種細(xì)胞或異種細(xì)胞產(chǎn)物的使用增加了通過這樣的方法產(chǎn)生的胚胎干細(xì)胞 群可能被病毒和/或免疫原性異蛋白質(zhì)污染的風(fēng)險。
[0009] Richards 等（Stem Cells21 :546_556, 2003)評估了一組 11 種不同的人類成體、 胎兒和初生兒飼養(yǎng)細(xì)胞飼養(yǎng)物層支持人類胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的能力。Richards等陳述："在 成體皮膚成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)物上培養(yǎng)的人類胚胎干細(xì)胞系保留了人類胚胎干細(xì)胞形態(tài)并且 仍然是多能的"。
[0010] US6642048公開了在無飼養(yǎng)物培養(yǎng)中支持靈長類動物多能干（pPS)細(xì)胞生長的培 養(yǎng)基，以及可用于生產(chǎn)這樣的培養(yǎng)基的細(xì)胞系。US6642048陳述："本發(fā)明包括從胚胎組織 獲得的或從胚胎干細(xì)胞分化的間充質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞系。在本公開中描述和例示 了取得這樣的細(xì)胞系，加工培養(yǎng)基，以及使用該條件培養(yǎng)基生長干細(xì)胞的方法。"
[0011] US20020072117公開了產(chǎn)生在無飼養(yǎng)物培養(yǎng)中支持靈長類動物多能干細(xì)胞生長的 培養(yǎng)基的細(xì)胞系。使用的細(xì)胞系是從胚胎組織獲得的或從胚胎干細(xì)胞分化的間充質(zhì)細(xì)胞和 成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞系。US20020072117還公開了該細(xì)胞系作為初始飼養(yǎng)細(xì)胞層的用途。
[0012] 在另一個例子中，Wang等（Stem Cells23 :1221-1227,2005)公開了在來源于人類 胚胎干細(xì)胞的飼養(yǎng)細(xì)胞層上長期生長人類胚胎干細(xì)胞的方法。
[0013] 在另一個例子中，Xu等（Stem Cells22 :972-980,2004)公開了從人類胚胎干細(xì)胞 衍生物獲得的條件培養(yǎng)基，所述衍生物通過遺傳修飾以過表達(dá)人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶。
[0014] 在另一個例子中，Stojkovic 等（Stem Cells200523 :306-314,2005)公開了一種 來源于人類胚胎干細(xì)胞自發(fā)分化的飼養(yǎng)細(xì)胞系統(tǒng)。
[0015] 在另一個例子中，Miyamoto 等（Stem Cells22 :433_440, 2004)公開了一種從人類 胎盤獲得飼養(yǎng)細(xì)胞的來源。
[0016] Amit等（Biol. R印rod68 :2150-2156,2003)公開了一種來源于人類包皮的飼養(yǎng)細(xì) 胞層。
[0017] 在另一個例子中，Inzunza 等（Stem Cells23 :544_549, 2005)公開了 一種來自人 類生后包皮成纖維細(xì)胞的飼養(yǎng)細(xì)胞層。
[0018] 一種可供選擇的培養(yǎng)系統(tǒng)使用補(bǔ)充有能夠促進(jìn)胚胎干細(xì)胞增殖的生長因子的無 血清培養(yǎng)基。例如，〇^〇11等出丨〇1?印1'〇(1001 :10.1095/1^〇11'印1'〇(1.105.046870,2005 年 10月19日）公開了一種無飼養(yǎng)物、無血清的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中胚胎干細(xì)胞在補(bǔ)充有能夠觸發(fā) 胚胎干細(xì)胞自我更新的不同生長因子的非條件血清替換（SR)培養(yǎng)基中維持。
[0019] 在另一個例子中，Levenstein 等（Stem Cells24 :568-574,2006)公開了在沒有成 纖維細(xì)胞或條件培養(yǎng)基的情況下，使用補(bǔ)充有bFGF的培養(yǎng)基長期培養(yǎng)人類胚胎干細(xì)胞的 方法。
[0020] 在另一個例子中，US20050148070公開了在沒有血清和成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞的確 定成分培養(yǎng)基中培養(yǎng)人類胚胎干細(xì)胞的方法，該方法包括：在包含白蛋白、氨基酸、維生素、 礦物質(zhì)、至少一種轉(zhuǎn)鐵蛋白或轉(zhuǎn)鐵蛋白代替物、至少一種胰島素或胰島素代替物的培養(yǎng)基 中培養(yǎng)干細(xì)胞，該培養(yǎng)基基本上不含哺乳動物胎兒血清并且包含至少大約l〇〇ng/ml的能 夠活化成纖維細(xì)胞生長因子信號傳導(dǎo)受體的成纖維細(xì)胞生長因子，其中該生長因子從除成 纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層以外的來源提供，在沒有飼養(yǎng)細(xì)胞或條件培養(yǎng)基的情況下該培養(yǎng)基支持干 細(xì)胞以未分化的狀態(tài)的增殖。
[0021] 在另一個例子中，US20050233446公開了一種用于培養(yǎng)干細(xì)胞的確定成分培養(yǎng)基， 包括未分化的靈長類動物原始干細(xì)胞。在溶液中，該培養(yǎng)基與培養(yǎng)的干細(xì)胞相比基本上是 等滲的。在給定的培養(yǎng)中，特定的培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及支持該原始干細(xì)胞基本上未 分化的生長所必需的量的bFGF、胰島素和抗壞血酸。
[0022] 在另一個例子中，US6800480陳述"在一種實施方案中，提供了一種用于以基本上 未分化的狀態(tài)生長靈長類動物來源的原始干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基，其包括有效支持靈長 類動物來源的原始干細(xì)胞生長的低滲透壓、低內(nèi)毒素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。該基礎(chǔ)培養(yǎng)基與有效 支持靈長類動物來源的原始干細(xì)胞生長的營養(yǎng)血清以及選自飼養(yǎng)細(xì)胞和來源于飼養(yǎng)細(xì)胞 的細(xì)胞外基質(zhì)組分的基質(zhì)組合。該培養(yǎng)基還包括非必需氨基酸、抗氧化劑、以及選自核苷和 丙酮酸鹽的第一生長因子。"
[0023] 在另一個例子中，US20050244962陳述："在一個方面本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)靈長 類動物胚胎干細(xì)胞的方法。在基本上不含哺乳動物胎兒血清（優(yōu)選還基本上不含任何動物 血清）和有從并非僅僅是（other than just)成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的來源提供的成纖維細(xì)胞 生長因子的培養(yǎng)物中培養(yǎng)干細(xì)胞。在一種優(yōu)選的形式中，通過添加足夠的成纖維細(xì)胞生長 因子使以前需要來維持干細(xì)胞培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層不必要。"
[0024] 在另一個例子中，W02005065354公開了一種基本上無飼養(yǎng)物和無血清的確定成分 的、等滲的培養(yǎng)基，包括：a)基礎(chǔ)培養(yǎng)基；b)足夠支持基本上未分化的哺乳動物干細(xì)胞生長 的量的bFGF ;c)足夠支持基本上未分化的哺乳動物干細(xì)胞生長的量的胰島素；和d)足夠 支持基本上未分化的哺乳動物干細(xì)胞生長的量的抗壞血酸。
[0025] 在另一個例子中，W02005086845公開了一種用于維持未分化的干細(xì)胞的方法，所 述方法包括使干細(xì)胞接觸足夠維持該細(xì)胞未分化狀態(tài)的量的轉(zhuǎn)化生長因子β (TGFi3)家 族蛋白質(zhì)成員、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF)家族蛋白質(zhì)成員或煙酰胺（NIC)足夠的時間以 獲得需要的結(jié)果。
[0026] 胚胎干細(xì)胞提供了用于研究和藥物篩選的潛在資源。目前，人類ES細(xì)胞系的大規(guī) 模培養(yǎng)是有問題的并且提供了相當(dāng)?shù)奶魬?zhàn)。一種對這些挑戰(zhàn)可能的解決方案是以單細(xì)胞傳 代和培養(yǎng)人類胚胎干細(xì)胞。單細(xì)胞更適于標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)技術(shù)，例如計數(shù)、轉(zhuǎn)染等等。
[0027] 例如，Nicolas等提供了一種用于從用慢病毒載體遺傳修飾之后通過熒光激 活細(xì)胞分選法（FACS)分離的單細(xì)胞產(chǎn)生和擴(kuò)增hES細(xì)胞系的方法。Stem Cells and Development(2007)，16(1)，109-118。
[0028] 在另一個例子中，美國專利申請US2005158852公開了一種"用于改良單個人類胚 胎干細(xì)胞的生長和存活的方法。該方法包括下列步驟：獲得單個未分化的HES細(xì)胞；把該單 個未分化細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM)混合以環(huán)繞該細(xì)胞；以及在生長環(huán)境中把該混合物接種 到具有營養(yǎng)培養(yǎng)基的飼養(yǎng)細(xì)胞上"。
[0029] 在另一個例子中，Sidhu，KS et al(Srem Cells Dev. 2006Feb ;15(1) :61-9.) "描 述了三種人類胚胎干細(xì)胞（hESC)克隆hES3. 1、3. 2和3. 3的首次報道，它們通過流式細(xì) 胞術(shù)分選單細(xì)胞制劑來源于親本系hES3。在細(xì)胞分選前后單細(xì)胞制劑的成活力保持> 98%，，。
[0030] 然而，人類胚胎干細(xì)胞以單細(xì)胞傳代和培養(yǎng)引起遺傳異常和多能性損失。培養(yǎng)條 件在多能性和遺傳穩(wěn)定性的維持中是重要的。通常，hES細(xì)胞系的傳代是手動實施的或使 用酶性試劑，例如膠原酶、liberase或分散酶。
[0031] 例如，Draper JS等指出"在五個獨(dú)立的時期三種獨(dú)立的人類胚胎干細(xì)胞系 中存在包括染色體17q增加的核型改變。"（Nat Biotechnol. 2004Jan ;22 (1) :53-4. Epub2003Dec7)〇
[0032] 在另一個例子中，Buzzard等陳述，"我們僅僅檢測到一種核型改變事件......使 用的培養(yǎng)方法可能對我們的結(jié)果具有一些影響，已知我們的方法與大多數(shù)其它小組使用的 那些方法顯然不同。通常在使用破裂的移液管的邊緣首次剖解菌落7天后傳代人類ES細(xì) 胞......沒有細(xì)胞離散的酶或化學(xué)方法合并入該方法。我們推測這可能解釋了在我們手 中的 hES 細(xì)胞的相對細(xì)胞遺傳彈性。"（Nat Biotechnol. 2004Apr ;22 (4) :381-2 ;author reply382)。
[0033] 在另一個例子中，Mitalipova麗等陳述"批量傳代方法......會使非整倍體 細(xì)胞群體在培養(yǎng)中的延長傳代后永生，但是可用于較短的時期（直到至少15代）而不損 害核型......在長期手動繁殖條件繼之以在比手動傳代方法需要更大量的hES細(xì)胞的 實驗中有限量的傳代下維持hES細(xì)胞的正常的核型是可能的，單獨(dú)地，可以提供"。（Nat Biotechnol. 2005Jan ;23(1) :19-20)。
[0034] 在另一個例子中，Heng BC等陳述"結(jié)果顯示第二種流程（使用溫和吸取的胰酶消 化）比第一種流程（使用刮擦的膠原酶處理）對細(xì)胞成活力損害更少。這隨后轉(zhuǎn)變?yōu)楦?的凍融存活率"。（Biotechnology and Applied Biochemistry (2007)，47(1)，33-37)。
[0035] 在另一個例子中，Hasegawa K.等陳述，"我們建立了能夠容忍完全離解的hESC亞 系。這些細(xì)胞顯示出高的再平板接種（r印lating)效率以及高的克隆效率并且它們維持它 們分化成為三種胚層的能力。"（Stem Cells. 2006Dec ;24(12) :2649-60. Epub2006Aug24)。
[0036] 概述
[0037] 本發(fā)明提供了用于已經(jīng)用酶釋放為單細(xì)胞的多能干細(xì)胞的維持、傳代和分化的方 法。尤其是，本發(fā)明提供了用于已經(jīng)釋放為單細(xì)胞的多能干細(xì)胞的維持、傳代和分化，而沒 有隨后的多能性損失，并且沒有染色體異常增加的方法。
[0038] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于分化多能干細(xì)胞的方法，包括下列步驟：
[0039] a)成簇培養(yǎng)多能干細(xì)胞，
[0040] b)釋放該多能干細(xì)胞為單細(xì)胞，
[0041] c)平板接種該單個多能干細(xì)胞到組織培養(yǎng)基質(zhì)上，和
[0042] d)分化該細(xì)胞。
[0043] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于維持多能干細(xì)胞的方法，包括下列步驟：
[0044] a)獲得多能干細(xì)胞，
[0045] b)釋放該多能干細(xì)胞為單細(xì)胞，和
[0046] c)平板接種該單個多能干細(xì)胞到組織培養(yǎng)基質(zhì)上。
[0047] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于傳代多能干細(xì)胞的方法，包括下列步驟：
[0048] a)獲得多能干細(xì)胞簇，
[0049] b)釋放該多能干細(xì)胞為單細(xì)胞，
[0050] c)平板接種該單個多能干細(xì)胞到組織培養(yǎng)基質(zhì)上，
[0051] d)允許該單個多能干細(xì)胞擴(kuò)增，
[0052] e)釋放該單個多能干細(xì)胞，和
[0053] f)平板接種該單個多能干細(xì)胞到新的組織培養(yǎng)基質(zhì)上。
[0054] 附圖簡述
[0055] 圖1 :在MEF條件培養(yǎng)基中1 : 30減少的生長因子MATRIGEL?上生長的H9ccp33 人類ES細(xì)胞的4X放大圖像。
[0056] 圖2 :在分化處理以產(chǎn)生定形內(nèi)胚層之后表達(dá)CXCR4的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。深灰色：在 第45和55代之間的H1細(xì)胞簇（Hlcc)進(jìn)行的六次DE分化實驗的平均值。黑色：用第47 和54代的H1單細(xì)胞（Hlsc)進(jìn)行的兩次DE分化實驗的平均值。白色：在第37和55代之 間的H9細(xì)胞簇（H9cc)進(jìn)行的五次DE分化實驗的平均值。淺灰：在第36和48代之間的H9 單細(xì)胞（H9sc)進(jìn)行的三次DE分化實驗的平均值。誤差條表示重復(fù)實驗的標(biāo)準(zhǔn)差。
[0057] 圖3 :在接觸14或17天的胰腺內(nèi)分泌分化流程之后通過實時PCR進(jìn)行的基因表 達(dá)分析。A.分析第37代的H9單細(xì)胞和細(xì)胞簇。B.延續(xù)Hlp47和H9p37細(xì)胞簇和單細(xì)胞 至胰腺內(nèi)胚層階段。在第14和17天之后Pdxl表達(dá)。對每一數(shù)據(jù)集把未經(jīng)處理細(xì)胞的指 示標(biāo)記的基因表達(dá)設(shè)置為值1。
[0058] 圖4 :在MEF條件培養(yǎng)基中1 : 30減少的生長因子MATRIGEL?上生長的H9scp22 人類ES單細(xì)胞的4X放大圖像。
[0059] 圖5 :通過FACS評估hES細(xì)胞的多能性標(biāo)記表達(dá)。標(biāo)明的標(biāo)記陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù) 列在X軸上。
[0060] 圖6 :以簇傳代38次隨后以單細(xì)胞傳代20次的H9hES單細(xì)胞的染色體分散。
[0061] 圖7 :在定形內(nèi)胚層分化期間H9單細(xì)胞和細(xì)胞簇的比較。在細(xì)胞接觸定形內(nèi)胚層 分化流程之后顯示了 CXCR4陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。對于H9sc-p N = 2而對于H9cc N = 5。 誤差條表示重復(fù)實驗的平均值的標(biāo)準(zhǔn)差。
[0062] 圖8:在H9單細(xì)胞（第22代）分化之后胰腺內(nèi)胚層標(biāo)記的增加。顯示了在11、14 或17天的胰腺內(nèi)分泌分化之后通過實時PCR進(jìn)行的基因表達(dá)分析。第14和17天的值是 一塊六孔板的兩個孔的平均值。
[0063] 圖9 :hES單細(xì)胞可以在MEF上分化。在MEF飼養(yǎng)物上生長并分化為定形內(nèi)胚層的 Hlscp4細(xì)胞的FACS結(jié)果。定形內(nèi)胚層標(biāo)記CXCR4(⑶184)在89%的細(xì)胞中表達(dá)而在未分 化細(xì)胞中為〇% (參見圖5)。
[0064] 圖10 :hES單細(xì)胞（H9scpl8)可以在96孔格式中分化為定形內(nèi)胚層。顯示了 Soxl7 陽性檢測的免疫熒光數(shù)據(jù)。8個孔在實驗的持續(xù)時間中用MEF條件培養(yǎng)基處理:MEF培養(yǎng) 基。8個孔用不含組分的基礎(chǔ)分化培養(yǎng)基處理：無化合物。對每一數(shù)據(jù)條算出8個孔的重 復(fù)實驗數(shù)據(jù)組的平均值?？偣?0個孔各自用Wnt3a或Gsk3b抑制劑處理并對每一數(shù)據(jù)組 算出平均值。誤差條表示每一重復(fù)實驗組的標(biāo)準(zhǔn)差。
[0065] 圖11 :使用hES單細(xì)胞（H9scpl9)的藥效團(tuán)篩選。測試了總共13種實驗小分子 化合物在定形內(nèi)胚層分化流程中替代fct3a的能力。顯示了三種有效的化合物。數(shù)據(jù)組表 示在兩個或更多孔中Soxl7陽性細(xì)胞的平均值。使用以MEF條件培養(yǎng)基或基礎(chǔ)培養(yǎng)基處理 的細(xì)胞作為陰性對照
[0066] 圖12 :評估H9p33hES細(xì)胞簇和單細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)染效率。用8 μ 1 Lipofectamine2000 (Invitrogen，Carlesbad，CA)和 4 或 8 μ g DNA (分別是黑色和灰色條） 把CMV-GFP轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞。
[0067] 圖13 :在MEF上生長然后以簇或單細(xì)胞傳代至MATRIGEL?的HlhES細(xì)胞的相位顯 微照片。用膠原酶從MEF傳代至MATRIGEL?的第37代HlhES細(xì)胞形成具有一些松散分化 的細(xì)胞的分散、高密度的菌落。用Accutase?或TrypLE?傳代一次的HlhES細(xì)胞形成具有 高密度的已分化細(xì)胞的區(qū)塊（pocket)的單細(xì)胞層培養(yǎng)物。
[0068] 圖14 :直接從MEFS傳代至MATRIGEL?的HlhES細(xì)胞以單細(xì)胞自發(fā)地分化。畫面 A :在用Accutase?從MEFs到MATRIGEL?傳代2次之后仍然在群中的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。畫面 B :在用Accutase?從MEF到MATRIGEL?傳代2次之后hES細(xì)胞中的多能性和分化標(biāo)記的 表達(dá)。畫面C :在用Accutase?從MEF到MATRIGEL?傳代2次之后HlhES細(xì)胞的相位顯微 照片。
[0069] 詳述
[0070] 為了公開的清楚，而不是作為限制，把本發(fā)明的詳細(xì)說明分成下列小部分，其描述 或例示本發(fā)明的某些特征、實施方案或應(yīng)用。
[0071] 定義
[0072] 干細(xì)胞是通過它們在單細(xì)胞水平自我更新和分化產(chǎn)生后代細(xì)胞兩種能力定義的 未分化細(xì)胞，包括自我更新祖細(xì)胞、非更新祖細(xì)胞和終末分化細(xì)胞。干細(xì)胞還以它們在體外 分化成為來自多個胚層（內(nèi)胚層、中胚層和外胚層）的多種細(xì)胞譜系的功能性細(xì)胞，以及 在移植之后產(chǎn)生多個胚層的組織和在注射進(jìn)入胚泡之后相當(dāng)大地促成大多數(shù)，如果不是全 部，組織的能力為特征。
[0073] 干細(xì)胞通過它們的發(fā)育潛力分類為：（1)全能的，表示能產(chǎn)生所有胚胎和胚外 細(xì)胞類型；（2)多能的（pluripotent)，表示能產(chǎn)生所有胚胎細(xì)胞類型；（3)多潛能的 (multipotent)，表示能產(chǎn)生一種亞型的細(xì)胞譜系，但是都在一種特定的組織、器官或生理 系統(tǒng)之內(nèi)（例如，造血干細(xì)胞（HSC)可以產(chǎn)生包括HSC(自我更新）、血細(xì)胞限制性寡能祖細(xì) 胞和為血液正常組分的所有細(xì)胞類型和元件（例如血小板）的后代）；(4)寡能的，表示能 產(chǎn)生比多潛能（multipotent)干細(xì)胞更限制性的亞型的細(xì)胞譜系；和（5)偏能的，表示能產(chǎn) 生單一細(xì)胞譜系（例如生精子的干細(xì)胞）。
[0074] 分化是非特化的（"未定型的"）或較少特化的細(xì)胞獲得特化細(xì)胞（例如神經(jīng)細(xì)胞 或肌細(xì)胞）特征的過程。已分化的或分化誘導(dǎo)的細(xì)胞是在細(xì)胞譜系中具有更加特化的（"定 型的"）位置的細(xì)胞。當(dāng)應(yīng)用于分化過程時，術(shù)語"定型的"指的是在分化途徑中進(jìn)行至一 個節(jié)點(diǎn)的細(xì)胞，在正常環(huán)境下，在該節(jié)點(diǎn)，它將繼續(xù)分化成為特定細(xì)胞類型或細(xì)胞類型的亞 型，而不能在正常環(huán)境下分化成為不同的細(xì)胞類型或回復(fù)到較少分化的細(xì)胞類型。脫分化 指的是細(xì)胞回復(fù)到在細(xì)胞譜系中較少特化的（或定型的）位置的過程。如本文使用的，細(xì) 胞譜系規(guī)定了細(xì)胞的遺傳性，即，它來自哪種細(xì)胞和它可以產(chǎn)生什么細(xì)胞。細(xì)胞譜系把細(xì)胞 置于發(fā)育和分化的遺傳圖式中。譜系特異性標(biāo)記指的是與感興趣的譜系的細(xì)胞表型特異性 相關(guān)的特征并且可用于評價未定型細(xì)胞至感興趣的譜系的分化。
[0075] 在培養(yǎng)中多種術(shù)語用于描述細(xì)胞。"維持"通常指的是在易于細(xì)胞生長和/或分裂 的條件下放入生長培養(yǎng)基中的細(xì)胞，其可能或可能不產(chǎn)生更大群的細(xì)胞。"傳代"指的是把 細(xì)胞從一個培養(yǎng)容器移去并在易于細(xì)胞生長和/或分裂的條件下把它們置于第二個培養(yǎng) 容器的過程。
[0076] 特定的細(xì)胞群或細(xì)胞系有時指的是它已經(jīng)傳代的次數(shù)或以其為特征。例如，已經(jīng) 傳代10次的培養(yǎng)細(xì)胞群可以稱為P10培養(yǎng)物。原始培養(yǎng)物，即在從組織的細(xì)胞分離之后的 第一培養(yǎng)物，指定為P0。在第一次繼代培養(yǎng)之后，細(xì)胞被描述為第二培養(yǎng)物（P1或第1代）。 在第二次繼代培養(yǎng)之后，細(xì)胞成為第三培養(yǎng)物（P2或第2代），等等。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以 理解在傳代期間可能有許多次種群加倍；因此培養(yǎng)物種群加倍的數(shù)目大于傳代數(shù)。在傳代 之間的時期細(xì)胞的擴(kuò)增（即種群加倍的數(shù)目）取決于許多因素，包括但不限于接種密度、基 質(zhì)、培養(yǎng)基、生長條件和傳代之間的時間。
[0077] 本文使用的"AFP"或"甲胎蛋白"指的是在肝臟發(fā)育起始時產(chǎn)生的一種抗原。AFP 還可以在胚外細(xì)胞中表達(dá)。
[0078] " β -細(xì)胞譜系"指的是具有轉(zhuǎn)錄因子rox-i和至少一種下列轉(zhuǎn)錄因子陽性基因表 達(dá)的細(xì)胞：NGN-3、Nkx2. 2、Nkx6. 1、NeuroD、Isl-1、HNF-3 β、MAFA、Pax4 和 Pax6。表達(dá) β 細(xì)胞譜系特征標(biāo)記的細(xì)胞包括β細(xì)胞。
[0079] 本文使用的"Brachyury"是一種Τ-框（box)基因家族成員。它是原條和中胚層 細(xì)胞的標(biāo)記。
[0080] 本文使用的"表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征標(biāo)記的細(xì)胞"指的是表達(dá)至少一種下列標(biāo) 記的細(xì)胞：S0X-17、GATA-4、HNF-3 β、GSC、Cerl、Nodal、FGF8、fcachyury、Mix 樣同源框蛋 白質(zhì)40卩40)48、6〇11168〇(161'11^11伍01^5)、01?4、卩6卩17、6八丁八-6、〇父0?4、(：-1(行、0)99或0^2。 表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征標(biāo)記的細(xì)胞包括原條前體細(xì)胞、原條細(xì)胞、中內(nèi)胚層細(xì)胞和定形 內(nèi)胚層細(xì)胞。
[0081] 本文使用的"CD99"指的是登錄號NM_002414的基因編碼的蛋白質(zhì)。
[0082] 本文使用的"表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征標(biāo)記的細(xì)胞"指的是表達(dá)至少一種下列標(biāo) 記的細(xì)胞：PDX-1、HNF-1 β、PTF-1 a、HNF-6或HB9。表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征標(biāo)記的細(xì)胞 包括胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞。
[0083] 本文使用的"表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征標(biāo)記的細(xì)胞"指的是表達(dá)至少一種下列標(biāo) 記的細(xì)胞：NGN-3、NeuroD、Islet-1、PDX-1、NKX6. 1、Pax-4、Ngn-3 或 PTF-la。表達(dá)胰腺內(nèi) 分泌譜系特征標(biāo)記的細(xì)胞包括胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞、胰腺激素表達(dá)細(xì)胞、和胰腺激素分泌細(xì)胞、 和β細(xì)胞譜系的細(xì)胞。
[0084] 本文使用的"CXCR4"指的是基質(zhì)細(xì)胞衍生因子l(SDF-l)受體，又名"LESTR"或 "fusin"。在形成原腸胚過程中的小鼠胚胎中，CXCR4在定形內(nèi)胚層和中胚層中而不是在胚 外內(nèi)胚層中表達(dá)。
[0085] 本文使用的"定形內(nèi)胚層"指的是在原腸胚形成期間具有從外胚層產(chǎn)生的細(xì)胞 特性的細(xì)胞，其形成胃腸道及其衍生物。定形內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)下列標(biāo)記：CXCR4、HNF-3i3、 GATA-4、S0X-17、Cerberus、0TX2、goosecoid、c-Kit、CD99 和 Mixll。
[0086] 本文使用的"胚外內(nèi)胚層"指的是表達(dá)至少一種下列標(biāo)記的細(xì)胞群：S0X_7、AFP和 SPARC。
[0087] "GATA-4"和"GATA-6"是GATA轉(zhuǎn)錄因子家族的成員。該轉(zhuǎn)錄因子家族由TGF- β 信號傳導(dǎo)誘導(dǎo)并有助于早期內(nèi)胚層標(biāo)記的維持。
[0088] 本文使用的"GLUT-2"指的是在許多胎兒和成人組織（包括胰腺、肝、腸、腦和腎） 中表達(dá)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)分子。
[0089] 本文使用的"Goosecoid"或"GSC"指的是在胚孔的背唇中表達(dá)的同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄 因子。
[0090] 本文使用的"Islet-Ι"或"Isl-1"是LIM/同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，在發(fā) 育中的胰腺中表達(dá)。
[0091] 本文使用的"MafA"是在胰腺中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，控制在胰島素生物合成和分泌中 涉及的基因的表達(dá)。
[0092] 本文使用的"標(biāo)記"是在感興趣的細(xì)胞中差異表達(dá)的核酸或多肽分子。在本上下 文中，對于陽性標(biāo)記差異表達(dá)表示增加的水平而對于陰性標(biāo)記其表示減少的水平。與其它 細(xì)胞相比，在感興趣的細(xì)胞中標(biāo)記核酸或多肽的可檢測水平足夠高或低，以致可以使用本 領(lǐng)域已知的多種方法中的任意一種鑒定和將感興趣的細(xì)胞同其它細(xì)胞區(qū)別開來。
[0093] 本文使用的"中內(nèi)胚層細(xì)胞"指的是表達(dá)至少一種下列標(biāo)記的細(xì)胞：⑶48、 eomesodermin (E0MES)、S0X-17、DKK4、HNF-3 β、GSC、FGF17、GATA-6。
[0094] 本文使用的"Nodal"是TGF0蛋白超家族的成員。
[0095] "Oct-4"是P0U結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子的成員并被普遍認(rèn)為是多能干細(xì)胞的標(biāo)志。Oct-4 與多能干細(xì)胞的關(guān)系通過其緊密地限制性表達(dá)到未分化的多能干細(xì)胞表明。當(dāng)分化為體細(xì) 胞譜系時，〇ct-4的表達(dá)迅速消失。
[0096] 本文使用的"胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞"或"胰腺激素表達(dá)細(xì)胞"指的是能夠表達(dá)至少一種 下列激素的細(xì)胞：胰島素、胰高血糖素、生長激素釋放抑制激素和胰多肽。
[0097] 本文使用的"胰腺激素分泌細(xì)胞"指的是能夠分泌至少一種下列激素的細(xì)胞：胰島 素、胰高血糖素、生長激素釋放抑制激素和胰多肽。
[0098] 本文使用的"Pax-4"和"Pax-6"是涉及胰島發(fā)育的胰腺β細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子。
[0099] 本文使用的"rox-i"指的是涉及胰腺發(fā)育的同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子。
[0100] 本文使用的"前-原條細(xì)胞"指的是表達(dá)至少一種下列標(biāo)記的細(xì)胞：Nodal或FGF8。
[0101] 本文使用的"原條細(xì)胞"指的是表達(dá)至少一種下列標(biāo)記的細(xì)胞：Brachyury、Mix樣 同源框蛋白質(zhì)或FGF4。
[0102] 本文使用的"PTF-la "指的是48kD的堿性螺旋-環(huán)-螺旋蛋白，其是三聚體胰腺 轉(zhuǎn)錄因子1 (PTF1)的序列特異性DNA結(jié)合亞基。
[0103] 本文使用的"SPARC"又名"酸性且富含半胱氨酸的分泌蛋白"。
[0104] "SSEA_1"（時期專一的胚胎抗原1)是存在于鼠畸胎癌干細(xì)胞（EC)、鼠和人胚胎生 殖細(xì)胞（EG)和鼠胚胎干細(xì)胞（ES)表面上的糖脂表面抗原。
[0105] "SSEA_3"（時期專一的胚胎抗原3)是存在于人畸胎癌干細(xì)胞（EC)、人胚胎生殖細(xì) 胞（EG)和人胚胎干細(xì)胞（ES)表面上的糖脂表面抗原。
[0106] "SSEA_4"（時期專一的胚胎抗原4)是存在于人畸胎癌干細(xì)胞（EC)、人胚胎生殖細(xì) 胞（EG)和人胚胎干細(xì)胞（ES)表面上的糖脂表面抗原。
[0107] "TRA1-60"是在人畸胎癌干細(xì)胞（EC)、人胚胎生殖細(xì)胞（EG)和人胚胎干細(xì)胞（ES) 表面上表達(dá)的硫酸角質(zhì)素相關(guān)抗原。
[0108] "TRA1-81"是在人畸胎癌干細(xì)胞（EC)、人胚胎生殖細(xì)胞（EG)和人胚胎干細(xì)胞（ES) 表面上表達(dá)的硫酸角質(zhì)素相關(guān)抗原。
[0109] "TRA2-49"是在人畸胎癌干細(xì)胞（EC)和人胚胎干細(xì)胞（ES)表面上表達(dá)的堿性磷 酸酶同工酶。
[0110] 本發(fā)明提供了用于已經(jīng)用酶釋放為單細(xì)胞的多能干細(xì)胞的維持、傳代和分化的方 法。尤其是，本發(fā)明提供了用于已經(jīng)釋放為單細(xì)胞的多能干細(xì)胞的維持、傳代和分化，而沒 有隨后的多能性損失，并且沒有染色體異常增加的方法。
[0111] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于分化多能干細(xì)胞的方法，包括下列步驟：
[0112] a)成簇培養(yǎng)多能干細(xì)胞，
[0113] b)釋放該多能干細(xì)胞為單細(xì)胞，
[0114] c)平板接種該單個多能干細(xì)胞到組織培養(yǎng)基質(zhì)上，和
[0115] d)分化該單個多能干細(xì)胞。
[0116] 可以通過酶處理釋放多能干細(xì)胞簇為單細(xì)胞。酶處理可以用TrypLE? Express， 可選擇地用TrypLE? Select，可選擇地用胰蛋白酶，或者可選擇地用胰蛋白酶/EDTA。
[0117] 酶處理可以是大約2至大約5分鐘?？蛇x擇地，酶處理為大約5分鐘。
[0118] 可以使用從大約0. 5g/L到大約2. 5g/L濃度的酶。
[0119] 在一個實施方案中，可以用TrypLE? EXPRESS釋放多能干細(xì)胞簇為單細(xì)胞。
[0120] 在一個實施方案中，多能干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。在一個替代的實施方案中，胚胎干 細(xì)胞是人的。
[0121] 在一個實施方案中，把釋放的單個多能細(xì)胞平板接種到組織培養(yǎng)基質(zhì)上。基質(zhì)可 以是MATRIGEL?，可選擇地基質(zhì)可以是纖連蛋白，可選擇地基質(zhì)可以是層粘連蛋白，可選擇 地基質(zhì)可以是人血清，或者可選擇地基質(zhì)可以是膠原。
[0122] 在一個實施方案中，把釋放的單個多能細(xì)胞平板接種到三維支持物上。支持物可 以與至少一種促進(jìn)該釋放的單個多能細(xì)胞存活和行使功能的藥物試劑結(jié)合。對本發(fā)明來說 適合使用的支持物材料包括泡沫、海綿、凝膠、水凝膠、紡織品和無紡結(jié)構(gòu)形式的合成和天 然材料。
[0123] 在一個實施方案中組織培養(yǎng)基質(zhì)是MATRIGEL??？梢栽趶拇蠹s1 : 30到大約 1 : 10的稀釋度使用MATRIGEL?。在一個實施方案中，以1 : 10的稀釋度使用MATRIGEL?。
[0124] 單個多能干細(xì)胞可以分化成為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征標(biāo)記的細(xì)胞?？蛇x擇地， 單個多能干細(xì)胞可以分化成為表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征標(biāo)記的細(xì)胞。可選擇地，單個多能 干細(xì)胞可以分化成為表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征標(biāo)記的細(xì)胞。
[0125] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于維持多能干細(xì)胞的方法，包括下列步驟：
[0126] a)獲得多能干細(xì)胞簇，
[0127] b)釋放該多能干細(xì)胞為單細(xì)胞，和
[0128] c)平板接種該單個多能干細(xì)胞到組織培養(yǎng)基質(zhì)上。
[0129] 可以通過酶處理釋放多能干細(xì)胞簇為單細(xì)胞。酶處理可以用TrypLE? Express， 可選擇地用TrypLE? Select，可選擇地用胰蛋白酶，或者可選擇地用胰蛋白酶/EDTA。
[0130] 酶處理可以是大約2至大約5分鐘。可選擇地，酶處理為大約5分鐘。
[0131] 可以使用從大約0. 5g/L到2. 5g/L濃度的酶。
[0132] 在一個實施方案中，可以用TrypLE? Express釋放多能干細(xì)胞簇為單細(xì)胞。
[0133] 在一個實施方案中，多能干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。在一個替代的實施方案中，胚胎干 細(xì)胞是人的。
[0134] 在一個實施方案中，把釋放的單個多能細(xì)胞平板接種到組織培養(yǎng)基質(zhì)上。基質(zhì)可 以是MATRIGEL?，可選擇地基質(zhì)可以是生長因子減少的MATRIGEL?，可選擇地基質(zhì)可以是纖 連蛋白，可選擇地基質(zhì)可以是層粘連蛋白，可選擇地基質(zhì)可以是人血清，或者可選擇地基質(zhì) 可以是膠原。
[0135] 在一個實施方案中，把釋放的單個多能細(xì)胞平板接種到三維支持物上。支持物可 以與至少一種促進(jìn)該釋放的單個多能細(xì)胞存活和行使功能的藥物試劑結(jié)合。對本發(fā)明來說 適合使用的支持物材料包括泡沫、海綿、凝膠、水凝膠、紡織品和無紡結(jié)構(gòu)形式的合成和天 然材料。
[0136] 在一個實施方案中組織培養(yǎng)基質(zhì)是生長因子減少的MATRIGEL??？梢栽趶拇蠹s 1 : 30到大約1 : 10的稀釋度使用生長因子減少的MATRIGEL?。在一個實施方案中，以 1 : 30的稀釋度使用MATRIGEL?。
[0137] 單個多能干細(xì)胞可以分化成為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征標(biāo)記的細(xì)胞?？蛇x擇地， 單個多能干細(xì)胞可以分化成為表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征標(biāo)記的細(xì)胞。可選擇地，單個多能 干細(xì)胞可以分化成為表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征標(biāo)記的細(xì)胞。
[0138] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于傳代多能干細(xì)胞的方法，包括下列步驟：
[0139] a)獲得多能干細(xì)胞簇，
[0140] b)釋放該多能干細(xì)胞為單細(xì)胞，
[0141] c)平板接種該單個多能干細(xì)胞到組織培養(yǎng)基質(zhì)上，
[0142] d)允許該單個多能干細(xì)胞擴(kuò)增，
[0143] e)釋放該單個多能干細(xì)胞，和
[0144] f)平板接種該單個多能干細(xì)胞到新的組織培養(yǎng)基質(zhì)上。
[0145] 可以通過酶處理釋放多能干細(xì)胞簇為單細(xì)胞。酶處理可以用TrypLE? Express， 可選擇地用TrypLE? Select，可選擇地用胰蛋白酶，或者可選擇地用胰蛋白酶/EDTA。
[0146] 酶處理可以是大約2至大約5分鐘。可選擇地，酶處理為大約5分鐘。可以使用 從大約0. 5g/L到2. 5g/L濃度的酶。
[0147] 在一個實施方案中，可以用TrypLE? Express釋放多能干細(xì)胞簇為單細(xì)胞。
[0148] 在一個實施方案中，在細(xì)胞再次經(jīng)受酶傳代到新的組織培養(yǎng)基質(zhì)上以前單個多能 細(xì)胞生長到大約70至80%的密度。使用本發(fā)明的方法，單個多能干細(xì)胞可以傳代一次，或 者它們可以傳代多于一次。
[0149] 在一個實施方案中，多能干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。在一個替代的實施方案中，胚胎干 細(xì)胞是人的。
[0150] 在一個實施方案中，把釋放的單個多能細(xì)胞平板接種到組織培養(yǎng)基質(zhì)上。基質(zhì)可 以是MATRIGEL?，可選擇地，基質(zhì)可以是生長因子減少的MATRIGEL?，可選擇地基質(zhì)可以是 纖連蛋白，可選擇地基質(zhì)可以是層粘連蛋白，可選擇地基質(zhì)可以是人血清或者可選擇地基 質(zhì)可以是I父原。
[0151] 在一個實施方案中，把釋放的單個多能細(xì)胞平板接種到三維支持物上。支持物可 以與至少一種促進(jìn)該釋放的單個多能細(xì)胞存活和行使功能的藥物試劑結(jié)合。對本發(fā)明來說 適合使用的支持物材料包括泡沫、海綿、凝膠、水凝膠、紡織品和無紡結(jié)構(gòu)形式的合成和天 然材料。
[0152] 在一個實施方案中組織培養(yǎng)基質(zhì)是生長因子減少的MATRIGEL??？梢栽趶拇蠹s 1 : 30到大約1 : 10的稀釋度使用生長因子減少的MATRIGEL?。在一個實施方案中，以 1 : 30的稀釋度使用MATRIGEL?。
[0153] 用于多能干細(xì)胞的分離、擴(kuò)增和培養(yǎng)的其它方法
[0154] 多能干細(xì)胞的鑒定
[0155] 多能干細(xì)胞可以表達(dá)時期專一的胚胎抗原（SSEA) 3和4,以及可使用命名 為Tra-1-60和Tra-1-81的抗體檢測的標(biāo)記中的一種或更多種（Thomson et al.， Science282 :1145,1998)。多能干細(xì)胞在體外的分化導(dǎo)致SSEA-4、Tra-l-60和Tra-1-81表 達(dá)（如果存在）的損失以及SSEA-1表達(dá)的增加。未分化的多能干細(xì)胞通常具有堿性磷酸 酶活性，其可以按照廠商（Vector Laboratories,Burlingame Calif)的描述通過用4%多 聚甲醛固定該細(xì)胞然后用Vector Red作為底物顯影來檢測。未分化的多能干細(xì)胞通常還 表達(dá)Oct-4和TERT，通過RT-PCR檢測。
[0156] 增殖的多能干細(xì)胞的另一個需要的表型是分化成為所有三種胚層：內(nèi)胚層、中胚 層和外胚層組織的細(xì)胞的潛力。干細(xì)胞的多能性可以通過，例如注射細(xì)胞進(jìn)重癥聯(lián)合免疫 缺陷（SCID)小鼠，使用4%多聚甲醛固定其形成的畸胎瘤，然后組織學(xué)上檢查它們來自三 種胚層的細(xì)胞類型的證據(jù)來確定。可選擇地，多能性可以通過胚狀體的產(chǎn)生和評價該胚狀 體與三種胚層相關(guān)的標(biāo)記的存在來確定。
[0157] 增殖的多能干細(xì)胞系可以使用標(biāo)準(zhǔn)G顯帶技術(shù)確定核型并與公布的相應(yīng)靈長類 物種核型相比。需要獲得具有"正常核型"的細(xì)胞，其表示細(xì)胞是整倍體的，其中所有人染 色體都存在并且沒有顯著地改變。
[0158] 多能干細(xì)胞的來源
[0159] 可以使用的多能干細(xì)胞類型包括來源于妊娠之后形成的組織，包括胚前期組織 (例如胚泡）、胚胎組織或妊娠期間任何時間（通常但不必然在大約10-12星期妊娠以前） 獲取的胎兒組織的已經(jīng)建立的多能細(xì)胞系。非限制性例子是已經(jīng)建立的人胚胎干細(xì)胞或人 胚胎生殖細(xì)胞系，例如人胚胎干細(xì)胞系H1、H7和H9(WiCell)。還預(yù)期了在上述細(xì)胞最初建 立或穩(wěn)定化期間本公開的組合物的用途，在該種情況下來源細(xì)胞可以是直接從來源組織獲 取的原始多能細(xì)胞。從已經(jīng)在沒有飼養(yǎng)物的情況下培養(yǎng)的多能干細(xì)胞群獲取的細(xì)胞也是合 適的。突變型人胚胎干細(xì)胞系，例如BG01v(BresaGen，Athens，GA)也是合適的。
[0160] 在一個實施方案中，按照Thomson等的描述制備人胚胎干細(xì)胞。（美國專利號 5, 843, 780 ；Science282 ：1145,1998 ；Curr. Top. Dev. Biol. 38 ：133ff. , 1998 ；Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92 :7844,1995)。
[0161] 多能干細(xì)胞的培養(yǎng)
[0162] 在一個實施方案中，多能干細(xì)胞通常在以多種方式支持該多能干細(xì)胞的飼養(yǎng)細(xì)胞 層上培養(yǎng)?？蛇x擇地，多能干細(xì)胞在基本上不含飼養(yǎng)細(xì)胞，但是仍然支持多能干細(xì)胞不經(jīng)受 相當(dāng)大的分化的增殖的培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)。使用以先前培養(yǎng)另一種細(xì)胞類型為條件的培養(yǎng)基 支持不分化的在無飼養(yǎng)物培養(yǎng)物中多能干細(xì)胞的生長。可選擇地，使用化學(xué)成分確定的培 養(yǎng)基支持不分化的在無飼養(yǎng)物培養(yǎng)物中多能干細(xì)胞的生長。
[0163] 例如，Reubinoff 等（Nature Biotechnologyl8 :399_4〇4(2〇00))和 Thompson 等 (Science6Novemberl998 :Vol. 282. no. 5391，ρρ· 1145-1147)公開了使用小鼠胚胎成纖維 細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞層從人胚泡的多能干細(xì)胞系的培養(yǎng)。
[0164] Richards 等（Stem Cells21 :546_556, 2003)評估了一組 11 種不同的人類成人、 胎兒和新生兒飼養(yǎng)細(xì)胞層支持人類多能干細(xì)胞培養(yǎng)的能力。Richards等陳述："在成體皮 膚成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)物上培養(yǎng)的人類胚胎干細(xì)胞系保留了人類胚胎干細(xì)胞形態(tài)并且仍然是 多能的"。
[0165] US20020072117公開了產(chǎn)生在無飼養(yǎng)物培養(yǎng)中支持靈長類動物多能干細(xì)胞生長的 培養(yǎng)基的細(xì)胞系。使用的細(xì)胞系是從胚胎組織獲得的或從胚胎干細(xì)胞分化的間充質(zhì)細(xì)胞和 成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞系。US20020072117還公開了該細(xì)胞系作為初始飼養(yǎng)細(xì)胞層的用途。
[0166] 在另一個例子中，Wang等（Stem Cells23 :1221_1227,2005)公開了在來源于人類 胚胎干細(xì)胞的飼養(yǎng)細(xì)胞層上人類多能干細(xì)胞長期生長的方法。
[0167] 在另一個例子中，Stojkovic 等（Stem Cells2005 23 :306-314,2005)公開了來源 于人類胚胎干細(xì)胞自發(fā)分化的飼養(yǎng)細(xì)胞系統(tǒng)。
[0168] 在另一個例子中，Miyamoto 等（Stem Cells22 :433-440, 2004)公開了從人胎盤處 獲得的飼養(yǎng)細(xì)胞的來源。
[0169] Amit等（Biol. R印rod68 :2150-2156,2003)公開了來源于人包皮的飼養(yǎng)細(xì)胞層。
[0170] 在另一個例子中，Inzunza等（Stem Cells23 :544-549,2005)公開了來自人生后 包皮成纖維細(xì)胞的飼養(yǎng)細(xì)胞層。
[0171] US6642048公開了在無飼養(yǎng)物培養(yǎng)中支持靈長類動物多能干（pPS)細(xì)胞生長的培 養(yǎng)基，以及可用于生產(chǎn)這樣的培養(yǎng)基的細(xì)胞系。US6642048陳述："本發(fā)明包括從胚胎組織 獲得的或從胚胎干細(xì)胞分化的間充質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞系。在本公開中描述和例示 了取得上述細(xì)胞系，加工培養(yǎng)基和使用該條件培養(yǎng)基生長干細(xì)胞的方法。"
[0172] 在另一個例子中，W02005014799公開了用于哺乳動物細(xì)胞維持、增殖和分化的條 件培養(yǎng)基。W02005014799陳述："根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的培養(yǎng)基以鼠科動物細(xì)胞，尤其是那些稱 為MMH(Met鼠科動物肝細(xì)胞）的已分化且永生化的轉(zhuǎn)基因肝細(xì)胞的細(xì)胞分泌活性為條件。"
[0173] 在另一個例子中，Xu等（Stem Cells22 :972_980,2004)公開了從已經(jīng)遺傳修飾以 過表達(dá)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的人類胚胎干細(xì)胞衍生物獲得的條件培養(yǎng)基。
[0174] 在另一個例子中，US20070010011公開了維持多能干細(xì)胞的化學(xué)成分確定的培養(yǎng) 基。
[0175] -種可供選擇的培養(yǎng)系統(tǒng)使用補(bǔ)充有能夠促進(jìn)胚胎干細(xì)胞增殖的生長因子的 無血清培養(yǎng)基。例如，Cheon 等（BioReprod DOI :10. 1095/biolreprod. 105. 046870， 0ctoberl9, 2005)公開了一種無飼養(yǎng)物、無血清的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中胚胎干細(xì)胞在補(bǔ)充有能夠 觸發(fā)胚胎干細(xì)胞自我更新的不同生長因子的非條件血清替換（SR)培養(yǎng)基中維持。
[0176] 在另一個例子中，Levenstein 等（Stem Cells24 :568_574,2006)公開了在沒有成 纖維細(xì)胞或條件培養(yǎng)基的情況下，使用補(bǔ)充有bFGF的培養(yǎng)基長期培養(yǎng)人類胚胎干細(xì)胞的 方法。
[0177] 在另一個例子中，US20050148070公開了在沒有血清和成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞的確 定成分培養(yǎng)基中培養(yǎng)人類胚胎干細(xì)胞的方法，該方法包括：在包含白蛋白、氨基酸、維生素、 礦物質(zhì)、至少一種轉(zhuǎn)鐵蛋白或轉(zhuǎn)鐵蛋白代替物、至少一種胰島素或胰島素代替物的培養(yǎng)基 中培養(yǎng)干細(xì)胞，該培養(yǎng)基基本上不含哺乳動物胎兒血清并且包含至少大約l〇〇ng/ml的能 夠活化成纖維細(xì)胞生長因子信號傳導(dǎo)受體的成纖維細(xì)胞生長因子，其中該生長因子從并非 僅僅是成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的來源提供，在沒有飼養(yǎng)細(xì)胞或條件培養(yǎng)基的情況下該培養(yǎng)基支 持干細(xì)胞以未分化的狀態(tài)增殖。
[0178] 在另一個例子中，US20050233446公開了一種用于培養(yǎng)干細(xì)胞的確定成分培養(yǎng)基， 包括未分化的靈長類動物原始干細(xì)胞。在溶液中，該培養(yǎng)基與培養(yǎng)的干細(xì)胞相比基本上是 等滲的。在給定的培養(yǎng)中，特定的培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及支持該原始干細(xì)胞基本上未 分化的生長所必需的量的bFGF、胰島素和抗壞血酸。
[0179] 在另一個例子中，US6800480陳述，"在一種實施方案中，提供了一種用于以基本上 未分化的狀態(tài)生長靈長類動物來源的原始干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基，其包括有效支持靈長 類動物來源的原始干細(xì)胞生長的低滲透壓、低內(nèi)毒素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。該基礎(chǔ)培養(yǎng)基與有效 支持靈長類動物來源的原始干細(xì)胞生長的營養(yǎng)血清以及選自飼養(yǎng)細(xì)胞和來源于飼養(yǎng)細(xì)胞 的細(xì)胞外基質(zhì)組分的基質(zhì)組合。該培養(yǎng)基還包括非必需氨基酸、抗氧化劑、以及選自核苷和 丙酮酸鹽的第一生長因子。"
[0180] 在另一個例子中，US20050244962陳述："在一個方面本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)靈長 類動物胚胎干細(xì)胞的方法。在基本上不含哺乳動物胎兒血清（優(yōu)選還基本上不含任何動物 血清）和有從并非僅僅是成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的來源提供的成纖維細(xì)胞生長因子的培養(yǎng)物 中培養(yǎng)干細(xì)胞。在一種優(yōu)選的形式中，通過添加足夠的成纖維細(xì)胞生長因子使以前需要來 維持干細(xì)胞培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層不必要。"
[0181] 在另一個例子中，W02005065354公開了一種基本上無飼養(yǎng)物和無血清的確定成分 的、等滲的培養(yǎng)基，包括：a)基礎(chǔ)培養(yǎng)基；b)足夠支持基本上未分化的哺乳動物干細(xì)胞生長 的量的bFGF ;c)足夠支持基本上未分化的哺乳動物千細(xì)胞生長的量的胰島素；和d)足夠 支持基本上未分化的哺乳動物干細(xì)胞生長的量的抗壞血酸。
[0182] 在另一個例子中，W02005086845公開了一種用于維持未分化的干細(xì)胞的方法，所 述方法包括使干細(xì)胞接觸足夠維持該細(xì)胞未分化狀態(tài)的量的轉(zhuǎn)化生長因子β (TGFi3)家 族蛋白質(zhì)成員、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF)家族蛋白質(zhì)成員或煙酰胺（NIC)足夠的時間以 獲得需要的結(jié)果。
[0183] 可以把多能干細(xì)胞平板接種到合適的培養(yǎng)基質(zhì)上。在一個實施方案中，合適的培 養(yǎng)基質(zhì)是細(xì)胞外基質(zhì)組分，例如來源于基底膜或可以形成粘著分子受體-配體對的一部分 的那些。在一個實施方案中，合適的培養(yǎng)基質(zhì)是MATRIGEL?(Becton Dickenson) oMATRIGEL? 是來自Engelbreth-Holm-Swarm腫瘤細(xì)胞的可溶制劑，其在室溫下是凝膠以形成重建的基 底膜。
[0184] 作為替換物其它細(xì)胞外基質(zhì)組分和組分混合物是合適的。取決于增殖的細(xì)胞類 型，這可以包括單獨(dú)的或以不同組合的層粘連蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖、內(nèi)功素、硫酸乙酰 肝素等等。
[0185] 可以以合適的分布和在有促進(jìn)細(xì)胞存活、增殖和保留需要的特性的培養(yǎng)基的情況 下把多能干細(xì)胞平板接種到基質(zhì)上。所有這些特性得益于小心注意接種分布并且本領(lǐng)域技 術(shù)人員能夠容易地確定。
[0186] 合適的培養(yǎng)基可以由下列組分組成，例如Dulbecco ' s改進(jìn)的Eagle ' s培 養(yǎng)基（DMEM)、Gibco#l 1965-092 ;Knockout Dulbecco ' s 改進(jìn)的 Eagle ' s 培養(yǎng)基（K0 DMEM)、Gibco#10829-018 ;Ham，s F12/50 % DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基；200mM L-谷氨酰胺、 Gibco#15039-027 ;非必需氨基酸溶液、Gibcolll40-050 ;β-巰基乙醇、Sigma#M7522 ;人類 重組堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF)、Gibco#13256-029。
[0187] 多能干細(xì)胞的分化
[0188] 在本發(fā)明的一個實施方案中，在培養(yǎng)中多能干細(xì)胞增殖，同時維持它們的多能性。 細(xì)胞隨時間的多能性改變能夠通過檢測與多能性相關(guān)的標(biāo)記的表達(dá)水平的改變而確定。可 選擇地，多能性改變能夠通過檢測與分化相關(guān)的標(biāo)記或與另一種細(xì)胞類型相關(guān)的標(biāo)記的表 達(dá)水平的改變而監(jiān)測。
[0189] 在一個替代的實施方案中，多能干細(xì)胞在培養(yǎng)中增殖然后以促進(jìn)它們分化成為另 一種細(xì)胞類型的方式處理。其它細(xì)胞類型可以是表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征標(biāo)記的細(xì)胞。可 選擇地，該細(xì)胞類型可以是表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征標(biāo)記的細(xì)胞。可選擇地，該細(xì)胞類型可 以是表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征標(biāo)記的細(xì)胞。可選擇地，該細(xì)胞類型可以是表達(dá)β細(xì)胞譜系 特征標(biāo)記的細(xì)胞。
[0190] 根據(jù)本發(fā)明的方法處理的多能干細(xì)胞可以通過本領(lǐng)域任何合適的方法分化成為 多種其它細(xì)胞類型。例如，根據(jù)本發(fā)明的方法處理的多能干細(xì)胞可以分化成為神經(jīng)細(xì)胞、心 臟細(xì)胞、肝細(xì)胞、等等。
[0191] 例如，根據(jù)本發(fā)明的方法處理的多能干細(xì)胞可以根據(jù)W02007030870中公開的方 法分化成為神經(jīng)祖細(xì)胞和心肌細(xì)胞。
[0192] 在另一個例子中，根據(jù)本發(fā)明的方法處理的多能干細(xì)胞可以根據(jù)美國專利 6, 458, 589中公開的方法分化成為肝細(xì)胞。
[0193] 表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征標(biāo)記的細(xì)胞的形成
[0194] 多能干細(xì)胞可以通過本領(lǐng)域的任何方法分化成為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征標(biāo)記 的細(xì)胞。
[0195] 例如，多能干細(xì)胞可以根據(jù) D' Amour et al，Nature Biotechnology23, 1534-1541 (2005)中公開的方法分化成為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征標(biāo)記的細(xì)胞。
[0196] 例如，多能干細(xì)胞可以根據(jù) Shinozaki et al，Developmentl31，1651-1662 (2004) 中公開的方法分化成為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征標(biāo)記的細(xì)胞。
[0197] 例如，多能干細(xì)胞可以根據(jù)McLean et al，Stem Cells25, 29-38 (2007)中公開的 方法分化成為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征標(biāo)記的細(xì)胞。
[0198] 例如，多能干細(xì)胞可以根據(jù) D ' Amour et al，Nature Biotechnology24, 1392-1401 (2006)中公開的方法分化成為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征標(biāo)記的細(xì)胞。
[0199] 定形內(nèi)胚層譜系特征標(biāo)記選自 S0X17、GATA4、Ηη?·-3β、GSC、Cerl、Nodal、FGF8、 Brachyury、Mix 樣同源框蛋白質(zhì)、FGF4CD48、eomesodermin(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、 CXCR4、C-Kit、⑶99和0TX2。適合在本發(fā)明使用的是表達(dá)至少一種定形內(nèi)胚層譜系特征標(biāo) 記的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個方面，表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征標(biāo)記的細(xì)胞是原條前體細(xì)胞。在 一個替代的方面，表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征標(biāo)記的細(xì)胞是中內(nèi)胚層細(xì)胞。在一個替代的方 面，表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征標(biāo)記的細(xì)胞是定形內(nèi)胚層細(xì)胞。
[0200] 表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征標(biāo)記的細(xì)胞的形成
[0201] 多能干細(xì)胞可以通過本領(lǐng)域的任何方法分化成為表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征標(biāo)記 的細(xì)胞。
[0202] 例如，多能干細(xì)胞可以根據(jù) D ' Amour et al，Nature Biotechnology24, 1392-1401 (2006)中公開的方法分化成為表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征標(biāo)記的細(xì)胞。
[0203] 胰腺內(nèi)胚層譜系特征標(biāo)記選自Pdxl、HNF-1 β、PTFla、HNF-6、HB9和PR0X1。適合 在本發(fā)明使用的是表達(dá)至少一種胰腺內(nèi)胚層譜系特征標(biāo)記的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個方面， 表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征標(biāo)記的細(xì)胞是胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞。
[0204] 表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系標(biāo)記的細(xì)胞的形成
[0205] 多能干細(xì)胞可以通過本領(lǐng)域的任何方法分化成為表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征標(biāo)記 的細(xì)胞。
[0206] 例如，多能干細(xì)胞可以根據(jù) D ' Amour et al，Nature Biotechnology24, 1392-1401 (2006)中公開的方法分化成為表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征標(biāo)記的細(xì)胞。
[0207] 例如，多能干細(xì)胞可以通過Nature Biotechnology24,1392-1401 (2006)中公開的 方法分化成為表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征標(biāo)記的細(xì)胞。
[0208] 例如，多能干細(xì)胞可以通過 D' Amour et al，Nature Biotechnology，2006 中公 開的方法分化成為表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征標(biāo)記的細(xì)胞。
[0209] 胰腺內(nèi)分泌譜系特征標(biāo)記選自 NGN-3、NeuroD、Islet-1、Pdx-1、NKX6. 1、Pax-4、 Ngn-3和PTF-1 α。在一個實施方案中，胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞能夠表達(dá)至少一種下列激素：胰島 素、胰高血糖素、生長激素釋放抑制激素和胰多肽。適合在本發(fā)明使用的是表達(dá)至少一種胰 腺內(nèi)分泌譜系特征標(biāo)記的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個方面，表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征標(biāo)記的細(xì) 胞是胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞。該胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞可以是胰腺激素表達(dá)細(xì)胞?？蛇x擇地，該胰腺內(nèi) 分泌細(xì)胞可以是胰腺激素分泌細(xì)胞。
[0210] 在本發(fā)明的一個方面，該胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞是表達(dá)β細(xì)胞譜系特征標(biāo)記的細(xì)胞。 表達(dá)β細(xì)胞譜系特征標(biāo)記的細(xì)胞表達(dá)Pdxl和至少一種下列轉(zhuǎn)錄因子：NGN-3、Nkx2. 2、 他叉6.1、他111'〇〇、181-1、!1即-3 0、麻?4、？314和？316。在本發(fā)明的一個方面，表達(dá)0細(xì)胞 譜系特征標(biāo)記的細(xì)胞是β細(xì)胞。
[0211] 三維支持物
[0212] 對本發(fā)明來說適合使用的支持材料包括泡沫、海綿、凝膠、水凝膠、紡織品和無 紡結(jié)構(gòu)形式的合成和天然材料，其已經(jīng)用于體外和體內(nèi)重建或再生生物組織，以及遞送 趨化性試劑以誘導(dǎo)組織生長，適于在本發(fā)明的方法的實踐中使用。參見，例如，在美國專 利5, 770, 417、美國專利6, 022, 743、美國專利5, 567, 612、美國專利5, 759, 830、美國專 利6, 626, 950、美國專利6, 534, 084、美國專利6, 306, 424、美國專利6, 365, 149、美國專利 6, 599, 323、美國專利6, 656, 488、美國公布申請2004/0062753Α1、美國專利4, 557, 264和美 國專利6, 333, 029中公開的材料。
[0213] 為了形成與藥物試劑結(jié)合的支持物，可以在形成支持物之前把藥物試劑與聚合物 溶液混合。可選擇地，可以把藥物試劑包被到制造的支持物上，優(yōu)選在有藥物載體的情況 下。藥物試劑可以以液體、細(xì)碎的固體或任何其它適當(dāng)?shù)奈锢硇问酱嬖??？蛇x擇地，可以把 賦形劑加入該支持物以改變藥物試劑的釋放速度。在一個替代的實施方案中，支持物與至 少一種抗炎的藥物化合物結(jié)合，例如在美國專利6, 509, 369中公開的化合物。
[0214] 支持物可以與至少一種抗凋亡的藥物化合物結(jié)合，例如在美國專利6, 793, 945中 公開的化合物。
[0215] 支持物也可以與至少一種纖維化抑制劑藥物化合物結(jié)合，例如在美國專利 6, 331，298中公開的化合物。
[0216] 支持物還可以與至少一種能夠增強(qiáng)血管發(fā)生的藥物化合物結(jié)合，例如在美國公布 申請2004/0220393和美國公布申請2004/0209901中公開的化合物。
[0217] 支持物也可以與至少一種免疫抑制藥物化合物結(jié)合，例如在美國公布申請 2004/0171623中公開的化合物。
[0218] 本發(fā)明通過下列實施例進(jìn)一步說明，但不受其限制。 實施例
[0219] 實施例1
[0220] 以細(xì)胞簇傳代和維持hESC
[0221] 在絲裂霉素 C滅活的原始小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF)上維持人類胚胎干細(xì)胞系HI 和H9。在重復(fù)傳代過程中把hES細(xì)胞從MEF飼養(yǎng)物轉(zhuǎn)換到MATRIGEL?。
[0222] 組織培養(yǎng)皿的MATRIGEL?包被：在4 °C解凍生長因子減少的 MATRIGEL?(Becton_Dickinson，Bedford，Mass.)然后在冷的 DMEM/F12(Invitrogen, Carlsbad, CA)中1 : 30稀釋。把足夠覆蓋的體積加入每個6cm皿（2ml)或六孔板的每個 孔（1ml)，并且在室溫孵育lhr。平板在幾小時之內(nèi)使用或者在4°C存儲最多2星期。
[0223] 人類胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)：通過在含lmg/ml膠原酶IV(Sigma_Aldrich，St. Louis，M0) 的DMEM/F12中孵育10分鐘，隨后用吸量管刮擦從飼養(yǎng)層收獲未分化的人類胚胎干細(xì)胞集 落（H9和H1)。在lOOOrpm離心4分鐘沉淀細(xì)胞團(tuán)并且用2ml吸量管溫和地分散沉淀以破 裂集落為細(xì)胞小簇。在補(bǔ)充有 bFGF(8ng/ml;R&D Systems，Minneapolis，MN)的 MEF-CM 中 把這些細(xì)胞簇接種到MATRIGEL?包被的皿上，在5ml生長培養(yǎng)基中每6cm皿50-150集落。 每日更換培養(yǎng)基。在MEF-CM中的MATRIGEL TM上的集落變大并且當(dāng)它們占有 70-80%表面 區(qū)域時傳代，大約每3-4天。集落中的hES細(xì)胞具有高的核質(zhì)比例并具有顯著的核仁，與飼 養(yǎng)物上維持的hES細(xì)胞相似（圖1)。已分化的細(xì)胞相當(dāng)于培養(yǎng)中總細(xì)胞的少于5%。
[0224] 對于在MATRIGEL?上的MEF-CM中的細(xì)胞的常規(guī)傳代，細(xì)胞在含lmg/ml膠原酶IV 的DMEM/F12中孵育直至60分鐘并且通過強(qiáng)烈的DMEM/F12流刮擦從皿移走。沉淀、分散細(xì) 胞，并以1 : 3或1 : 4的比例接種。
[0225] 實施例2
[0226] 人類胚胎干細(xì)胞以單細(xì)胞傳代：酶評估
[0227] 為了容易處理hES細(xì)胞，傳代技術(shù)可以使用需要較短孵育時間并且不包括刮擦步 驟的其它酶溶液。另外，用膠原酶以細(xì)胞簇傳代細(xì)胞不允許接種的細(xì)胞的數(shù)值定量。許多 酶溶液可以用來在一個快速的步驟中釋放單細(xì)胞。通過下列實驗鑒定引起最少細(xì)胞損壞并 且不阻礙細(xì)胞附著或細(xì)胞生長的快速作用的酶。
[0228] 在六孔皿中以簇生長的人類胚胎干細(xì)胞H9p33細(xì)胞用下列酶孵育；TrypLE? Express、TrypLETMSelect、胰蛋白酶/EDTA(0·05%)或胰蛋白酶（0·25%)，于36°C2分鐘。 除胰蛋白酶之外的所有酶在2分鐘之內(nèi)釋放細(xì)胞。于36°C在5分鐘之后完成用胰蛋白酶 的釋放。以200, 000細(xì)胞/孔再接種細(xì)胞進(jìn)MATRIGEL?包被的六孔平板并允許擴(kuò)增三天。 人類胚胎干細(xì)胞還用膠原酶以簇傳代（30分鐘孵育）并在MATRIGEL?包被的孔上以1 : 5 稀釋度再接種，與計數(shù)的TrypLE? Express細(xì)胞相似。三天之后，通過TrypLE? Express5 分鐘孵育釋放hESC。用0.01%臺盼藍(lán)孵育細(xì)胞然后計數(shù)（表I)。對于測試的所有酶緊接 著釋放之后的細(xì)胞成活力大于98%。使用膠原酶的人類胚胎干細(xì)胞傳代是標(biāo)準(zhǔn)傳代方法。 三天培養(yǎng)之后，TrypLE? Select和TrypLE? Express兩者產(chǎn)生的回收細(xì)胞計數(shù)與膠原酶相 似。胰蛋白酶/EDTA和胰蛋白酶在維持細(xì)胞附著/生長上效果顯著較差。TrypLE? Select 和TrypLE? Express是評估的最好的酶并且在時程實驗，實施例3中進(jìn)一步測試。
[0229] 實施例3
[0230] 人類胚胎干細(xì)胞以單細(xì)胞傳代：酶暴露時間的優(yōu)化
[0231] TrypLE? Select和TrypLE? Express證明是測試的所有酶中最佳的。為了確定 這些酶與hES細(xì)胞的理想孵育時間，TrypLE? Select和TrypLE? Express與H9p34hESC簇 在37°C孵育2分鐘或10分鐘。細(xì)胞從孔移走、計數(shù)并通過離心沉淀。把200, 000細(xì)胞/孔 的等分試樣接種進(jìn)六孔平板。細(xì)胞生長三天隨后用TrypLE? Express釋放并在有0.01 % 臺盼藍(lán)的情況下計數(shù)。
[0232] 對于兩種酶的兩種孵育時間細(xì)胞成活力均大于98%。表III表明接種36hrs之后 回收的細(xì)胞數(shù)目/孔。用TrypLE? Express傳代的細(xì)胞在三天之后達(dá)到初始的接種密度。 這表明接種之后大多數(shù)細(xì)胞不重新附著；然而，附著的細(xì)胞能夠增殖和擴(kuò)增。假如一旦附 著，細(xì)胞以相同的速率擴(kuò)增，這些數(shù)據(jù)證明用TrypLE? Express處理2分鐘產(chǎn)生最好的附著 率。然后在所有隨后的實驗中把2分鐘的TrypLE? Express處理用于產(chǎn)生單細(xì)胞。
[0233] 實施例4
[0234] 人類胚胎干細(xì)胞單細(xì)胞和細(xì)胞簇分化為定形內(nèi)胚層
[0235] 胚胎干細(xì)胞可以分化為多種細(xì)胞譜系。以單細(xì)胞傳代的人類ES細(xì)胞對幫助細(xì)胞 輸入定量和容易處理提供了顯著的改進(jìn)。確定了這些單個hES細(xì)胞分化的能力。
[0236] 細(xì)胞簇和單細(xì)胞的接種：在減少的生長因子MATRIGEL?上的H9或H1細(xì)胞簇6cm 平板與2ml含膠原酶（lmg/ml)的DMEM : F12在37°C孵育直至60分鐘。通過吸取和刮擦 移去細(xì)胞并以900rpm離心4分鐘。然后把細(xì)胞簇接種進(jìn)1 : 15或1 : 30減少的生長因 子MATRIGEL?包被的六孔板。該傳代方法產(chǎn)生接種細(xì)胞簇（cc)?？蛇x擇地，在減少的生長 因子MATRIGEL?上的H9或H1細(xì)胞簇的6cm平板與TrypLE? Express (2ml)在37°C孵育5 分鐘并通過吸取分散。在以900rpm離心4分鐘之后，把細(xì)胞接種進(jìn)1 : 10減少的生長因 子MATRIGEL?包被的六孔板并稱為單細(xì)胞（sc)。
[0237] 定形內(nèi)胚層分化：把大約60至70%融合的H9和Hlsc和cc培養(yǎng)物暴露于補(bǔ)充 有 0· 5% FBS、10ng/ml Wnt3a(R&D Systems)和 100ng/ml 活化素 A(AA ;R&D Systems)的 DMEM : F12培養(yǎng)基2天，隨后用補(bǔ)充有2% FBS和lOOng/ml活化素 A的DMEM/F12培養(yǎng)基 處理另外的三天。
[0238] 通過FACS分析培養(yǎng)物的CXCR4、⑶99和⑶9表達(dá)以及通過實時PCR分析S0X-17、 S0X-7、甲胎蛋白（AFP)、CXCR4、Brychyury(Bry)、goosecoid(GSC)、HNF-3P 和 GATA4。AFP 和S0X-7被認(rèn)為是內(nèi)臟內(nèi)胚層標(biāo)記，而GATA4、HNF-3 β和S0X-17代表定形內(nèi)胚層標(biāo)記，以 及GSC、Bry和CXCR4代表原條的標(biāo)記。按照觀察到的產(chǎn)生的CXCR4陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，單細(xì) 胞以與細(xì)胞簇相似的程度分化至DE (圖2)。
[0239] 實施例5
[0240] hES單細(xì)胞和細(xì)胞簇分化為胰腺內(nèi)胚層
[0241] 還測試了在改進(jìn)的 Novocell (Baetge，EE et al.，Nature Biotechnology (2006), 24 (11)，1392-1401.)公布的流程之后的進(jìn)一步分化以確定hES單細(xì)胞的分化能力。在實施 例4中描述的DE流程之后細(xì)胞進(jìn)一步分化為胰腺內(nèi)胚層。
[0242] 胰腺內(nèi)胚層分化：使用來自實施例4的細(xì)胞簇和單細(xì)胞兩者，一個H9(p37)DE實 驗進(jìn)一步分化為胰腺內(nèi)胚層。在定形內(nèi)胚層流程完成之后，細(xì)胞與含F(xiàn)GF10(50ng/ml ;R&D Systems)、sonic hedgehog 抑制劑、KAAD 環(huán)王巴明（cyclopamine) (2.5uM;Sigma-Aldrich) 和2%FBS的DMEM : F12培養(yǎng)基孵育3天。接著，細(xì)胞與含F(xiàn)GF10(50ng/ml)、KAAD環(huán)王巴明 (2. 5uM)、視黃酸（luM ;Sigma-Aldrich)和 1% B27(Invitrogen)的 DMEM-低葡萄糖孵育另 外的三天。接著，細(xì)胞與含Exendin4 (50ng/ml ;Sigma_Aldrich)、DAPT (luM ;Calbiochem)和 1% B27的DMEM-低葡萄糖孵育另外的三天。對于每種細(xì)胞類型，從六孔板的一個孔獲取RNA 樣品然后通過實時PCR在該步驟分析胰腺標(biāo)記Pdxl、Nkx6. l、Nkx2. 2、Pax4、NeuroD、HNF3b、 Ptfla、膜島素和 AFP。使用包含 50ng/ml，HGF、IGF(R&D Systems)，和 Exendin4 (50ng/ml), 和1% B27的CMRL培養(yǎng)基（Invitrogen)繼續(xù)分化三天。在該時期重復(fù)相同胰腺內(nèi)胚層標(biāo) 記的評估。來自相同系的未經(jīng)處理的hES細(xì)胞的RNA樣品與處理的樣品平行經(jīng)受實時PCR。 把處理的樣品針對未經(jīng)處理的對照組標(biāo)準(zhǔn)化為1的倍數(shù)改變。監(jiān)測并在單細(xì)胞和細(xì)胞簇之 間比較Pdxl表達(dá)。在單細(xì)胞和細(xì)胞簇之間胰腺內(nèi)胚層標(biāo)記表達(dá)的誘導(dǎo)是相當(dāng)?shù)模▓D3)。 因此，hES單細(xì)胞具有與hES細(xì)胞簇相似的固有的分化能力。
[0243] 實施例6
[0244] hES細(xì)胞以單細(xì)胞傳代
[0245] hES細(xì)胞以單細(xì)胞傳代可以幫助擴(kuò)大培養(yǎng)的能力和易于制造過程。
[0246] 單細(xì)胞產(chǎn)生和傳代的描述：H9細(xì)胞如上所述在MATRIGEL?上以簇生長。在第38 代，6cm平板的H9細(xì)胞在37°C與2ml TrypLE? Express孵育5分鐘。在DMEM : F12中重 懸浮細(xì)胞并以900rpm離心4分鐘。以1 : 4比例再接種細(xì)胞到1 : 30生長因子減少的 MATRIGEL?包被的平板上。大約5次傳代之后，在再接種之前計數(shù)細(xì)胞并以14, 000細(xì)胞/ cm2的密度平板接種。以每4天的間隔繼續(xù)傳代和按該密度再接種。因為由單細(xì)胞產(chǎn)生，細(xì) 胞保持致密結(jié)構(gòu)但是從未形成緊密的簇（比較圖1和圖4)。
[0247] 實施例7
[0248] hES單細(xì)胞多能性的分析
[0249] 對于任何傳代技術(shù)hES細(xì)胞多能性的維持是必須的。因此，在使用TrypLE? Express多次傳代之后評估了單細(xì)胞的多能性。
[0250] FACS多能性分析：H9單細(xì)胞以簇培養(yǎng)38次傳代隨后以單細(xì)胞16次傳代，包括一 個深低溫保藏凍融。然后通過FACS分析細(xì)胞多能性標(biāo)記的表達(dá)。利用與TrypLE? Express 溶液孵育5分鐘從培養(yǎng)平板移走粘附細(xì)胞。釋放的細(xì)胞在DMEM : F12培養(yǎng)基中重懸浮并 通過離心回收，隨后在由PBS中的2% BSA(Sigma-Aldrich，St. Louis，M0)、0· 05%疊氮化 鈉組成的染色緩沖液中洗滌和重懸浮。視情況，使用〇. 1% T-球蛋白（Sigma)溶液對細(xì) 胞進(jìn)行Fc受體封閉15分鐘。等分試樣（大約105細(xì)胞）如表III中指出的與藻紅蛋白 (phycoerythirin，PE)或別藻藍(lán)蛋白（allophycocyanin，APC)綴合的單克隆抗體（每10 6 細(xì)胞5μ 1抗體）或者與非綴合的原始抗體一起孵育。對照包括適當(dāng)同種型匹配的抗體、未 染色的細(xì)胞和僅僅用二級綴合抗體染色的細(xì)胞。所有與抗體的孵育在4°C進(jìn)行30分鐘，之 后用染色緩沖液洗滌細(xì)胞。用非綴合原始抗體染色的樣品與二級綴合PE或APC標(biāo)記的抗 體在4°C孵育另外的30分鐘。使用的二級抗體的列表參見表III。沉淀洗滌的細(xì)胞并在染 色緩沖液中重懸浮，然后使用FACS陣列（BD Biosciences)儀鑒定細(xì)胞表面分子，收集至少 10, 000個事件。hESC膠原酶傳代的Hlp40和H9scpl6具有相當(dāng)?shù)亩嗄苄缘鞍踪|(zhì)表達(dá)型（圖 5)。
[0251] 實施例8
[0252] 人類胚胎干細(xì)胞單細(xì)胞核型穩(wěn)定性分析
[0253] 經(jīng)過多次傳代hES單細(xì)胞的核型應(yīng)該仍然是穩(wěn)定的。H9單細(xì)胞以簇培養(yǎng)38次傳 代隨后以單細(xì)胞多次傳代。通過標(biāo)準(zhǔn)G顯帶核型分析（Cell Line Genetics,Madison,WI) 確定H9細(xì)胞的核型。評估了總共20個G顯帶的細(xì)胞并且通過FISH(熒光原位雜交）分析 了 200個間期核。在這些分析的細(xì)胞中沒有發(fā)現(xiàn)染色體畸變。細(xì)胞遺傳學(xué)分析顯示這些細(xì) 胞具有正常數(shù)目的常染色體和最常見的46的染色體數(shù)目。在第13代和第20代實施H9單 細(xì)胞的核型分析。第20代的細(xì)胞經(jīng)受了一次深低溫保藏凍融事件。第13和20代的細(xì)胞 是核型正常的（圖6)。
[0254] 實施例9
[0255] hES單細(xì)胞和hES細(xì)胞簇分化為定形內(nèi)胚層
[0256] 對于最后的效用，以單細(xì)胞傳代的hES細(xì)胞必須保持它們的分化潛力。單細(xì)胞經(jīng) 受如下定形內(nèi)胚層流程。用TrypLE? Express多次傳代之后的H9細(xì)胞（sc-p)用TrypLE? Express從傳代的單細(xì)胞（第6和21代）釋放（sc)到MATRIGEL?(1 : 10稀釋）上以分 化。把大約60至70%融合的H9sc單細(xì)胞層暴露于補(bǔ)充有0. 5%FBS、10ng/ml Wnt3a和 100ng/ml活化素 A的DMEM : F12培養(yǎng)基2天，隨后用補(bǔ)充有2% FBS和100ng/ml活化素 A的DMEM/F12培養(yǎng)基處理另外的三天。
[0257] 在第5天，通過FACS分析細(xì)胞的CXCR4、⑶99和⑶9表達(dá)以及通過實時PCR分 析 SOX-17、S0X-7、甲胎蛋白（AFP)、CXCR4、Brychyury (Bry)、gooscecoid (GSC)、HNF-3 β 和 GATA4。AFP和S0X-7被認(rèn)為是內(nèi)臟內(nèi)胚層標(biāo)記，而GATA4、HNF-3 0和S0X-17代表定形內(nèi) 胚層標(biāo)記，并且GSC、Bry和CXCR4代表原條的標(biāo)記。多次傳代的單細(xì)胞（第6和21代）保 持它們分化為DE的能力，與細(xì)胞簇（第36-55代）相似（圖7)。
[0258] 實施例10
[0259] hES單細(xì)胞分化為胰腺內(nèi)胚層
[0260] 依附下列步驟細(xì)胞進(jìn)一步分化為胰腺內(nèi)胚層；與含F(xiàn)GF10 (50ng/ml)、sonic hedgehog抑制劑、KAAD環(huán)王巴明（2. 5uM)和2%FBS的DMEM : F12培養(yǎng)基孵育三天，隨后 與含F(xiàn)GF10(50ng/ml)、KAAD環(huán)王巴明（2. 5uM)、視黃酸（luM)和1% B27的DMEM-低葡萄糖 孵育三天。在第11天進(jìn)行細(xì)胞的評估。一些培養(yǎng)物在含Exendin4(50ng/ml)、DAPT(luM) 和1 % B27的DMEM-低葡萄糖中繼續(xù)處理三天。在第14天，通過實時PCR分析樣品的胰腺 標(biāo)記Pdxl、Nkx6. l、Nkx2. 2、？&14、恥111'〇0、!1即313、？丨打3、胰島素和4--。一些培養(yǎng)物使用包 含50ng/ml，HGF、IGF、和Exendin4、和1% B27的CMRL培養(yǎng)基繼續(xù)分化另外的三天。在在 第17天末重復(fù)相同胰腺內(nèi)胚層標(biāo)記的評估。胰腺內(nèi)胚層標(biāo)記Nkx2. 2、NeuroD、HNF6、HNF3b 主要在第14和17天末表達(dá)。Pdxl表達(dá)在每一處理時期逐漸增加（圖8)。
[0261] 實施例11
[0262] 在MEF飼養(yǎng)物上分化hES單細(xì)胞
[0263] 為了達(dá)到hES細(xì)胞最佳分化為胰腺內(nèi)胚層，定形內(nèi)胚層群必須是最大的。當(dāng)前，在 MEF飼養(yǎng)物上生長hES產(chǎn)生最高可達(dá)到水平的定形內(nèi)胚層和胰腺內(nèi)胚層。為了確定hES單細(xì) 胞是否能夠達(dá)到這個目標(biāo)，把Hlscp4以14, 000細(xì)胞/cm2接種到MEF飼養(yǎng)物上。細(xì)胞在包 含含 20% Knock-out Serum Replacement (Invitrogen)、lX 非必需氨基酸（invitrogen)、 8ng/ml bFGF、ImM L-谷氨酰胺和lmM2-巰基乙醇溶液的DMEM-F12的ES細(xì)胞培養(yǎng)基中生 長。7天后細(xì)胞達(dá)到60-70%融合，把定形內(nèi)胚層流程應(yīng)用于該細(xì)胞。特別地，每孔100ul添 加含100ng/ml活化素 A、10ng/ml Wnt3a和0.5%FBS的DMEM : F12培養(yǎng)基2天，隨后用含 100ng/ml活化素 A和2% FBS的DMEM : F12培養(yǎng)基處理3天。然后用TrypLE? Express 移去細(xì)胞并且通過FACS分析細(xì)胞的CXCR4、⑶99和⑶9表達(dá)（圖9)。多于90%的細(xì)胞表 達(dá)CXCR4和⑶99。少于8%的細(xì)胞表達(dá)⑶9,像期望的那樣。如通過CXCR4陽性細(xì)胞數(shù)目確 定的，在MEF飼養(yǎng)物上接種單個H1細(xì)胞改進(jìn)了定形內(nèi)胚層分化。
[0264] 實施例12
[0265] 在96孔板中分化hES單細(xì)胞
[0266] 以簇傳代hES細(xì)胞的一個常見困難是它們難以定量并且不以勻速生長。單細(xì)胞具 有可以生長為融合的單細(xì)胞層并且可以在傳代之前計數(shù)以為了實驗?zāi)康拇_保相等接種的 優(yōu)點(diǎn)。這些屬性是成功的篩選確認(rèn)的先決條件。
[0267] 把hES H9scpl8以14,000細(xì)胞/cm2的密度接種進(jìn)用1 : 30生長因子減少的 MATRIGEL?包被的Packard View96孔板（Perkin-Elmer)。細(xì)胞在MEF條件培養(yǎng)基中生 長3到4天然后使用DE分化流程處理。40孔的亞組用標(biāo)準(zhǔn)流程（含10ng/ml Wnt3a、 100ng/ml活化素 A和(λ 5% FBS的DMEM : F12, 2天）處理。40孔的第二亞組用GSK3b抑 制劑 IX(100nM;EMD Chemicals，La Jolla，CA)代替 Wnt3a 處理。這繼之以用含 lOOng/ ml活化素 A和2%FBS的DMEM : F12處理兩個亞組3天。在培養(yǎng)的最后，用4%多聚甲 醛在室溫下固定細(xì)胞20分鐘，用PBS洗滌3次，然后在100ul PBS中存儲過夜。用0. 5% Triton X-lOO(Sigma-Aldrich)在室溫下透化處理細(xì)胞20分鐘或者在4°C處理5分鐘，然 后用PBS洗漆3次并用含4%雞血清（Invitrogen-Gibco，Carlesbad，CA)的PBS室溫下 封閉30分鐘。稀釋一級抗體（山羊抗hSoxl7(R&D Systems)并以1 : 100稀釋度添加到 4%雞血清中，室溫下lhr。在PBS中1 : 200稀釋二級抗體，Alexa Fluor488雞抗山羊 IgG (Invitrogen-Molecular Probes, Carlesbad，CA)并在用 PBS洗漆 3 次之后加入到細(xì)胞。 為 了復(fù)染細(xì)胞核，把 5μ M Draq5 (Alexis Platform，LSufelfirigen, Switzerland)加入細(xì) 胞，室溫下5分鐘。用PBS洗滌細(xì)胞一次并保留在100 μ 1/孔PBS中用于成像以確定已分 化的DE細(xì)胞數(shù)目。在IN CelllOOO分析器（GE Healthcare ;Piscataway，NJ)上讀取平板 的孔到孔細(xì)胞數(shù)目定量和Soxl7染色。用Wnt3a處理產(chǎn)生每孔最高數(shù)量的細(xì)胞核，在孔之 間很少變異（圖10)。用Gsk3 0抑制劑處理顯示弱的細(xì)胞成活力。明顯地，Wnt3a處理允 許單個ES細(xì)胞在96孔規(guī)格以穩(wěn)固的和可再生的方式形成DE。
[0268] 實施例13
[0269] 使用hES單細(xì)胞的篩選試驗
[0270] 在證明單細(xì)胞適于96孔規(guī)格的接種和分化之后，確定了用新化合物處理的靈敏 度。hES H9scpl9以14, 000細(xì)胞/cm2的密度接種進(jìn)用1 : 30生長因子減少的MATRIGEL? 包被的96孔板中。細(xì)胞在MEF條件培養(yǎng)基中生長3-4天然后在DE分化實驗中處理。以1 或3 μ Μ的濃度一式三份地測試了總共13種新化合物，在DE分化流程中代替Wnt3a的小分 子抑制劑。把包含Wnt3a(10ng/ml)或Gsk3b抑制劑IX(100nM)的孔用作陽性對照。所有 分化孔用含單一化合物加上l〇〇ng/ml活化素 A和0. 5% FBS的DMEM : F12處理2天隨后 在沒有化合物的情況下用含l〇〇ng/ml活化素 A和2%FBS的DMEM : F12處理2天。在該 流程的最后，如上面實施例11中描述的固定、透化處理、封閉和染色細(xì)胞以確定Soxl7表達(dá) 和細(xì)胞核。然后在IN CelllOOO分析器上讀取平板。該篩選表明在DE分化流程中H9scp21 對13種化合物中的3種以類似于Wnt3a的方式作出反應(yīng)（圖11)?；衔顰在1 μ Μ較低 的劑量有效而化合物Β和C在1和3μΜ兩者都有效。在有效處理范圍（大于60% Soxl7 陽性細(xì)胞）中，孔之間的標(biāo)準(zhǔn)差都是小的。因此，單細(xì)胞通過篩選技術(shù)鑒定新化合物的能力 是穩(wěn)定的。
[0271] 實施例14
[0272] 單個hES細(xì)胞在滾瓶中的擴(kuò)增
[0273] 為了易于規(guī)模擴(kuò)大用于制造目的，hES細(xì)胞需要容易地擴(kuò)增為大的數(shù)量。當(dāng)前，膠 原酶處理以傳代hES細(xì)胞不適于在滾瓶或振蕩器燒瓶中的擴(kuò)大。重復(fù)地以單細(xì)胞擴(kuò)增和生 長的HES細(xì)胞具有均勻地粘附到不同表面的能力。在該實施例中，測試了滾瓶作為潛在的 擴(kuò)大容器。H9scpl9以14, 000細(xì)胞/cm2接種進(jìn)1 : 30減少的生長因子MATRIGEL?包被的 480cm2滾瓶（6. 7 X 106細(xì)胞；Corning, Acton, ΜΑ)。用每瓶100ml體積的MEF條件培養(yǎng)基 來維持細(xì)胞，每2天更換。對于24hrs瓶設(shè)置為20rev/hr而對于剩余時間增至60rev/hr。 經(jīng)過4天評價期細(xì)胞均勻地粘附到滾瓶并且顯著地擴(kuò)增。使用TrypLE? Express移去細(xì)胞 并計數(shù)?；厥沼嫈?shù)表明獲得了每瓶13X106細(xì)胞，表明與原始接種相比發(fā)生了最少的細(xì)胞 加倍。我們估計少于一半的最初接種的細(xì)胞附著到滾瓶，暗示在滾瓶中發(fā)生了更大的實際 細(xì)胞擴(kuò)增。這證明以單細(xì)胞傳代的hES細(xì)胞可以在自動化滾瓶系統(tǒng)中擴(kuò)增。將實施進(jìn)一步 的實驗以確定隨同多能性的維持一起的擴(kuò)增率。
[0274] 實施例15
[0275] 單個hES細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
[0276] 把DNA引入細(xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞類型是有用的特征。DNA可以包含表達(dá)載體或 報告基因以易于區(qū)別或允許細(xì)胞的選擇。已經(jīng)證明hES細(xì)胞難以在簇中轉(zhuǎn)染。然而，hES單 細(xì)胞可以更加適于轉(zhuǎn)染技術(shù)。
[0277] 用TrypLE? Express傳代H9p33細(xì)胞并以20, 000細(xì)胞/cm2接種到1 : 30減少的 生長因子MATRIGEL?包被的平板上。用膠原酶傳代H9p33細(xì)胞并從一個6cm平板接種進(jìn)用 1 : 30減少的生長因子MATRIGEL?包被的六孔板的一個孔。3天之后，用CMV-GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞， 其中6--在01^病毒啟動子下在所有細(xì)胞中表達(dá)。特別地，在25(^10?^-11^1培養(yǎng)基中稀 釋 2 或 4 μ g DNA 并且在 250 μ 1 Opti-MEM 中加入 8ul Lipofectamine2000 (Invitrogen)。 室溫下5分鐘之后合并混合物。在加入2ml MEF條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞之前合并的試劑 在室溫下孵育20分鐘。其后每24小時用MEF條件培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。3天之后，用4%多 聚甲醛在室溫下固定細(xì)胞20分鐘然后用PBS洗滌兩次并在PBS中4°C保存過夜。為了復(fù)染 細(xì)胞核，把5μ M Draq5 (Alexis Platform)加入細(xì)胞，室溫下5分鐘。用PBS洗滌細(xì)胞一次 并保存在lml/孔PBS中用于在IN Cell 1000分析器上成像以確定轉(zhuǎn)染效率（圖12)。HES 單細(xì)胞在轉(zhuǎn)染效率上顯示出為hES簇兩倍的改進(jìn)。因此，hES單細(xì)胞具有改進(jìn)的轉(zhuǎn)染能力 并且更容易遺傳修飾。隨著最佳化，也許使用其它轉(zhuǎn)染方法或試劑，可能實現(xiàn)單細(xì)胞ES細(xì) 胞轉(zhuǎn)染更加引人注目的改進(jìn)。
[0278] 實施例16
[0279] 在飼養(yǎng)細(xì)胞層上培養(yǎng)的hES細(xì)胞簇轉(zhuǎn)變?yōu)樵诩?xì)胞外基質(zhì)上培養(yǎng)的單個hES細(xì)胞需 要除去飼養(yǎng)細(xì)胞
[0280] 使用酶，例如胰蛋白酶、重組胰蛋白酶（TrypLE?)或Accutase?(無脊椎動物來源 的胰蛋白酶樣酶）的哺乳動物細(xì)胞傳代是當(dāng)前在研究和生產(chǎn)裝置中原代和永生化細(xì)胞系 兩者細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)。這些酶產(chǎn)生同質(zhì)的單細(xì)胞懸浮液，其可以以適于在高通量規(guī)格384 孔板或多升規(guī)模可變的（scaleable)培養(yǎng)容器的多種裝置中平板接種的可重復(fù)的方式計 數(shù)、分析、操作和傳代。
[0281] 考慮到單細(xì)胞傳代的明顯優(yōu)點(diǎn)，對開發(fā)以單細(xì)胞傳代人類胚胎干細(xì)胞的方法有相 當(dāng)大的興趣。然而，當(dāng)前最好的使用人類胚胎干細(xì)胞的實際操作要求細(xì)胞通過手動破裂或 使用維持胚胎細(xì)胞簇的酶（膠原酶或中性蛋白酶）傳代來以簇傳代。在這個領(lǐng)域過去的研 究已經(jīng)產(chǎn)生了可以在飼養(yǎng)物（Cellartis SCEDTM461系）上以單細(xì)胞傳代的細(xì)胞的產(chǎn)生，或 使用Accutase?從膠原酶傳代的簇到MATRIGEL?上的單細(xì)胞的單細(xì)胞的產(chǎn)生（R. Bajpai et al.，2008)。
[0282] 在此是開發(fā)單細(xì)胞傳代方法以使用TrypLE?或Accutase?在成批傳代方法中把 hES細(xì)胞直接從飼養(yǎng)物帶到matrigel的嘗試。結(jié)果表明使用TrypLE?或Accutase?成批 傳代把基于簇形式飼養(yǎng)物的傳代的hES細(xì)胞直接帶到MATRIGEL?而沒有MATRIGEL?上基于 簇的膠原酶傳代的中間步驟是無效的，這歸因于已分化細(xì)胞群的出現(xiàn)，因此較少可能產(chǎn)生 同質(zhì)的和穩(wěn)固的hES細(xì)胞培養(yǎng)物。
[0283] 結(jié)果
[0284] 努力把hES細(xì)胞從基于飼養(yǎng)物的培養(yǎng)轉(zhuǎn)移到無飼養(yǎng)物的培養(yǎng)，我們傳代了已經(jīng)在 hESC培養(yǎng)基中由MEF飼養(yǎng)層支持并在六孔板的10cm2孔上生長了 5天的H1第37代hES細(xì) 胞。細(xì)胞使用TrypLE?、Accutase?或lmg/ml的膠原酶傳代。
[0285] 在添加酶到細(xì)胞之前，我們吸出了耗費(fèi)的培養(yǎng)基，添加1ml PBS (無 Ca2+，或Mg2+) 到每個孔，吸出，然后添加 lml室溫的酶（膠原酶、Accutase?或TrypLE?)。Accutase?或 TrypLE?達(dá)到室溫之后以存儲濃度使用。膠原酶從-80°C冰箱移出，解凍，與9ml DMEM/F12 混合，無菌過濾，并在使用之前達(dá)到室溫。
[0286] 37°C下在酶中孵育細(xì)胞lOmin。10分鐘的處理之后Accutase?或TrypLE?使所有 細(xì)胞完全從皿中升起（lift)。10分鐘的孵育之后膠原酶沒有升起細(xì)胞，因此在10分鐘的 孵育之后使用l〇ml玻璃吸量管刮擦細(xì)胞。把含2% Probumin的lml DMEM-F12加入每個孔 并將孔中合并的總體積轉(zhuǎn)入50ml無菌錐形管，確保升起和懸浮盡可能多的細(xì)胞。
[0287] 以200Xg離心細(xì)胞5分鐘隨后另外用2% Probumin洗滌和以200Xg離心5分 鐘。然后在MEF條件培養(yǎng)基中重懸浮細(xì)胞并以1比3. 5的比例平板接種到MATRIGEL?(在 DMEM中1 : 30稀釋）包被的T25燒瓶上，然后置于37°C，5% C02的濕潤孵育箱中。
[0288] 通過使用改進(jìn)的Neubauer血-細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)來計算細(xì)胞數(shù)量。用Accutase? 升起的細(xì)胞具有3. 8百萬細(xì)胞/10cm2孔的密度。用TrypLE?升起的細(xì)胞具有3. 7百萬細(xì)胞 /10cm2孔的密度。由于集落形式膠原酶不能通過血細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)?？紤]到1比3. 5的分 流比，我們以2. 72百萬細(xì)胞/T25燒瓶或108, 000細(xì)胞/cm2的接種密度平板接種Accutase 處理的細(xì)胞，以2. 65百萬細(xì)胞/T25燒瓶或105, 000細(xì)胞/cm2的接種密度平板接種TrypLE? 處理的細(xì)胞。我們假定以相似的密度（105, 000至108, 000細(xì)胞/cm2)接種膠原酶處理的 孔，因為在酶處理之前孔與孔之間hES密度沒有看得出的差異。一個另外的燒瓶用膠原酶 升起的細(xì)胞平板接種以用于在下次傳代中計數(shù)的目的。
[0289] 每日更換補(bǔ)充有16 μ g/ml bFGF的MEF條件培養(yǎng)基維持細(xì)胞4天。培養(yǎng)4天之后 培養(yǎng)物融合，并且單細(xì)胞處理的hES細(xì)胞形成了具有偶見成纖維細(xì)胞區(qū)塊（pocket)的hES 細(xì)胞單細(xì)胞層，而簇傳代的hES細(xì)胞形成大的集落形式簇的hES細(xì)胞（圖13)。然后這些細(xì) 胞再次傳代。
[0290] 如先前描述的，37°C下在酶中孵育細(xì)胞lOmin。10分鐘的處理之后Accutase?或 TrypLE?使細(xì)胞從塑料和MATRIGEL?中升起。膠原酶沒有升起細(xì)胞，因此細(xì)胞在37°C進(jìn)一 步孵育總計45分鐘。用Accutase?升起另外的膠原酶燒瓶。然后用改進(jìn)的Neubauer血細(xì) 胞計數(shù)器計數(shù)單細(xì)胞。
[0291] 酶孵育之后把含2% Probumin的2ml DMEM-F12加入每個燒瓶，從燒瓶中上下吸 取總體積（?4ml) 5-10次以便懸浮盡可能多的細(xì)胞。然后把懸浮液轉(zhuǎn)入50ml錐形管并以 200 Xg離心5min。然后在補(bǔ)充有16 μ g/ml bFGF的MEF條件培養(yǎng)基中重懸浮細(xì)胞，然后以 1 : 4的比例平板接種到用1 : 30 MATRIGEL?預(yù)包被的T25燒瓶。
[0292] Accutase?傳代的細(xì)胞培養(yǎng)4天之后具有總計5. 6百萬細(xì)胞（223, 000細(xì)胞/cm2) 的密度，TrypLE?傳代的細(xì)胞培養(yǎng)4天之后具有總計5. 05百萬細(xì)胞（202, 000細(xì)胞/cm2)的 密度，而膠原酶傳代的細(xì)胞培養(yǎng)4天之后具有總計3. 45百萬細(xì)胞（138, 000細(xì)胞/cm2)的 密度?？紤]到細(xì)胞以1 : 4的比例傳代，對于Accutase?傳代以58, 000細(xì)胞/cm2的密度 平板接種細(xì)胞，對于TrypLE?傳代是51，000細(xì)胞/cm2,和35, 000細(xì)胞/cm2。
[0293] 然后生長細(xì)胞另外6天，每日更換補(bǔ)充有16ng/ml bFGF的MEF條件培養(yǎng)基。用膠 原酶傳代的細(xì)胞形成密集的同質(zhì)細(xì)胞的大的集落并且已分化的/成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞是稀 少的，而用Accutase?或TrypLE?傳代的細(xì)胞生長非常緩慢，隨著時間停止生長或長滿可能 由分化中的hES細(xì)胞形成的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞（圖14)。
[0294] 這些結(jié)果暗示從飼養(yǎng)物到無飼養(yǎng)物（MATRIGEL?)培養(yǎng)轉(zhuǎn)換的使用手動傳代或支 持簇形式傳代的酶（膠原酶或中性蛋白酶）的中間階段對使細(xì)胞在啟動單細(xì)胞傳代之前適 應(yīng)MATRIGEL?上的無飼養(yǎng)物培養(yǎng)是最好的。
[0295] 遍及本文件引用的出版物在此通過引用全文并入。盡管本發(fā)明的多個方面已經(jīng)在 上面通過參考實施例和優(yōu)選方案說明了，將理解本發(fā)明的范圍不是通過上述說明而是通過 在專利法的原理下適當(dāng)解釋的下列權(quán)利要求限定。
【權(quán)利要求】
1. 用于維持多能干細(xì)胞的方法，包括下列步驟： (a) 獲得多能干細(xì)胞簇； (b) 在MEF條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述多能干細(xì)胞簇； (c) 用酶釋放該多能干細(xì)胞為單細(xì)胞；和 (d) 平板接種該單個多能干細(xì)胞到組織培養(yǎng)基質(zhì)上，所述組織培養(yǎng)基質(zhì)包含細(xì)胞外基 質(zhì)以及bFGF或者成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基； 其中所述酶為絲氨酸蛋白酶；引起最少細(xì)胞損壞；并且以約0.5 g/Ι至2.5 g/Ι的濃度 存在； 其中所述酶用于培養(yǎng)細(xì)胞2分鐘；并且 其中在釋放細(xì)胞后細(xì)胞成活力增強(qiáng)并且沒有獲得染色體異常。
2. 用于維持多能干細(xì)胞的方法，包括下列步驟： (a) 獲得多能干細(xì)胞簇； (b) 在MEF條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述多能干細(xì)胞簇； (c) 用酶釋放該多能干細(xì)胞為單細(xì)胞；和 (d) 平板接種該單個多能干細(xì)胞到組織培養(yǎng)基質(zhì)上，所述組織培養(yǎng)基質(zhì)包含細(xì)胞外基 質(zhì)以及MEF條件培養(yǎng)基； 其中所述酶為絲氨酸蛋白酶；引起最少細(xì)胞損壞；并且以約0.5 g/Ι至2.5 g/Ι的濃度 存在； 其中所述酶用于培養(yǎng)細(xì)胞2-5分鐘；并且 其中在釋放細(xì)胞后細(xì)胞成活力增強(qiáng)并且沒有獲得染色體異常。
【文檔編號】C12N5/0735GK104250632SQ201410379925
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2008年6月30日 優(yōu)先權(quán)日:2007年7月1日
【發(fā)明者】S.內(nèi)爾遜 申請人:生命掃描有限公司