解淀粉芽孢桿菌wzz002及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一株新菌株-解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)WZZ002及在催化外消旋Boc-DL-氨基酸酯制備Boc-D-氨基酸酯和Boc-L-氨基酸中的應(yīng)用；本發(fā)明所述酶的區(qū)域選擇性強(qiáng)，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率高，下游分離簡(jiǎn)單，能耗低，環(huán)境污染小，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說(shuō)明】解淀粉芽孢桿菌WZZ002及應(yīng)用 (一）

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種酶法分解外消旋Boc-DL-氨基酸酯制備手性中間體的方法，特別 涉及在解淀粉芽孢桿菌WZZ002(CCTCC M 2013366)產(chǎn)生的酯水解酶作用下進(jìn)行立體選擇性 水解反應(yīng)合成光學(xué)純Boc-D-氨基酸酯和Boc-L-氨基酸的方法。 (二）

【背景技術(shù)】
[0002] N-叔丁氧撰基-D-氨基酸酯（簡(jiǎn)稱Boc-D-氨基酸酯）和N-叔丁氧撰基-L-氨 基酸（簡(jiǎn)稱Boc-L-氨基酸）是一種重要的生化試劑，用于多肽合成和氨基酸保護(hù)單體。 Boc-D-氨基酸酯和Boc-L-氨基酸酯可以通過(guò)化學(xué)水解獲得對(duì)應(yīng)的D-氨基酸和L-氨基 酸。D-氨基酸作為非天然氨基酸，在醫(yī)藥和農(nóng)藥合成，食品，飼料等方面具有廣泛的用途。 其中D-丙氨酸一種重要的醫(yī)藥中間體，廣泛用于醫(yī)藥和食品添加劑等領(lǐng)域，主要用于合成 新型甜味劑阿力甜（L-天門冬酰-N-(2, 2, 4, 4-四甲基-3-硫雜環(huán)丁基）-D-丙氨酰胺）及 某些手性藥物中間體的原料。其中L-正纈氨酸是抗高血壓類藥物培哚普利的重要中間體。 L-2-氨基丁酸是抗癲癇藥物左乙拉西坦的重要中間體。
[0003] 目前,文獻(xiàn)報(bào)道的合成Boc-D-丙氨酸酯通過(guò)D-丙氨酸為底物Boc取代酯化后獲 得。其中D-丙氨酸的合成方法主要是化學(xué)拆分法。化學(xué)拆分工藝途徑存在著收率低、成本 高、步驟繁多、產(chǎn)物純度較低、污染嚴(yán)重等問(wèn)題。而酶法制備D-丙氨酸方法主要有：（1)以化 學(xué)合成的5-甲基海因?yàn)榈孜?，利用海因裂解酶制備；?)化學(xué)合成的乙?；虮揭阴?DL-丙 氨酸為底物，利用氨基?；富蛘咔嗝顾仵；鸱?；(3)以DL-丙氨酸為底物，微生物降解 法；(4)以丙酮酸為底物，利用氨基轉(zhuǎn)移酶制備。目前生物法制備D-丙氨酸存在著酶選擇 性不高，生產(chǎn)成本高，前體底物合成難等問(wèn)題。 (三）


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的是通過(guò)篩選產(chǎn)脂肪酶微生物，提供了一株廉價(jià)高效的產(chǎn)微生物酶菌 株，以外消旋B 0c-DL-氨基酸酯為反應(yīng)底物，催化立體選擇性水解Boc-DL-氨基酸酯中 L-異構(gòu)體從而制備Boc-D-氨基酸酯和Boc-L-氨基酸的方法。
[0005] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0006] 本發(fā)明提供一株新菌株一解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens) WZZ002,保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，郵編430072， 保藏編號(hào)CCTCC M 2013366,保藏日期2013年8月8日。
[0007] 本發(fā)明還涉及一種所述解淀粉芽孢桿菌WZZ002在拆分N-叔丁氧羰基-DL-氨基 酸酯中的應(yīng)用，具體所述的應(yīng)用為：以解淀粉芽孢桿菌WZZ002經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體凍 干后的干菌體為催化劑，以外消旋N-叔丁氧羰基-DL-氨基酸酯（即Boc-DL-氨基酸甲酯） 為底物，于pH值為6?9(優(yōu)選pH值為7.0)的磷酸緩沖液中，在20?50°C (優(yōu)選30°C)下 進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液后處理，獲得N-叔丁氧羰基-D-氨基酸酯（Boc-D-氨 基酸酯）和N-叔丁氧羰基-L-氨基酸（Boc-L-氨基酸）。
[0008] 進(jìn)一步，所述干菌體的質(zhì)量用量為1?50g/L緩沖液，優(yōu)選10?20g/L，所述初始 底物濃度為1?200g/L緩沖液，優(yōu)選50?100g/L。
[0009] 進(jìn)一步，優(yōu)選所述底物為N-叔丁氧羰基-DL-丙氨酸酯（Boc-DL-丙氨酸酯）、N_叔 丁氧羰基-DL-2-氨基丁酸酯（Boc-DL-2-氨基丁酸酯）、N-叔丁氧羰基-DL-正纈氨酸酯 (Boc-DL-正纈氨酸酯）、N-叔丁氧羰基-DL-蛋氨酸酯（Boc-DL-蛋氨酸酯）、N-叔丁氧羰 基-DL-脯氨酸酯（Boc-DL-脯氨酸酯）、N-叔丁氧羰基-DL-絲氨酸酯（Boc-DL-絲氨酸 酯）、N-叔丁氧羰基-DL-亮氨酸酯（Boc-DL-亮氨酸酯）、N-叔丁氧羰基-DL-異亮氨酸酯 (Boc-DL-異亮氨酸酯）、N-叔丁氧羰基-DL-蘇氨酸酯（Boc-DL-蘇氨酸酯）、N-叔丁氧羰 基-DL-色氨酸酯（Boc-DL-色氨酸酯）或N-叔丁氧羰基-DL-苯丙氨酸酯（Boc-DL-苯丙 氨酸酯）。
[0010] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述催化劑按如下方法制備： toon] ⑴斜面培養(yǎng)
[0012] 將解淀粉芽孢桿菌WZZ002接種至斜面培養(yǎng)基，在30°C培養(yǎng)24h，獲得斜面菌 落；斜面培養(yǎng)基終濃度組成：NaN0 33. Og/L，KH2PO4L Og/L，MgSO4 · 7Η20(λ 5g/L，KCKX 5g/L， FeSO4 · 7H200. Olg/L，Boc-DL-丙氨酸酯 10mmol/L，溶劑為去離子水，pH7. 0 ;
[0013] ⑵種子培養(yǎng)
[0014] 將步驟⑴獲得的斜面菌落接種于種子培養(yǎng)基，在30°C、200r/min培養(yǎng)24h，獲 得種子液；種子培養(yǎng)基終濃度組成：蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，酵母膏l(xiāng)g/L，麥芽糖5g/L， NaClO. 5g/L，瓊脂23g/L，溶劑為去離子水，ρΗ7· 0 ;
[0015] ⑶發(fā)酵培養(yǎng)
[0016] 在無(wú)菌條件下，將種子液以體積濃度5?20%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中 (250mL三角瓶，裝液量為50mL)，30°C、200r/min培養(yǎng)24h，獲得發(fā)酵液，將發(fā)酵液離心，棄上 清液，得到解淀粉芽孢桿菌WZZ002濕菌體，將濕菌體懸浮于pH7. 0、0. 2mol/L的磷酸鹽緩沖 液中，攪拌均勻，-40°C條件下冷凍干燥，得到干菌體；發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：蛋白胨5g/L，牛 肉膏5g/L，酵母膏l(xiāng)g/L，MgS0 4lmm〇l/L，溶劑為去離子水，pH7. 0。
[0017] 本發(fā)明所述反應(yīng)液后處理的方法為：轉(zhuǎn)化反應(yīng)完全后，將轉(zhuǎn)化反應(yīng)液過(guò)濾除去菌 體，濾液用有機(jī)溶劑萃?。▋?yōu)選2次），分別獲得有機(jī)相和水相，有機(jī)相減壓蒸餾除去溶劑， 獲得高光學(xué)純度的N-叔丁氧羰基-D-丙氨酸甲酯產(chǎn)品；所述有機(jī)溶劑為正己烷、環(huán)己烷或 乙酸乙酯；水相調(diào)節(jié)pH值至2. 0后（優(yōu)選加鹽酸調(diào)節(jié)），用萃取劑萃取，取萃取后的有機(jī)相 得到Boc-L-氨基酸，所述萃取劑為正己烷、環(huán)己烷或乙酸乙酯。
[0018] 酶活定義為：在30°C下，每分鐘催化水解Iymol的BOC-DL-丙氨酸酯所需的酶 量。酶活測(cè)定條件方法為：取〇. 2g干菌體，向菌體中加入含終濃度5g/L Boc-DL-氨基酸 酯的磷酸緩沖溶液（pH值為7. 0) 10ml，30°C條件下，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm，反應(yīng)20min后，過(guò)濾 除去酶，取濾液用氣相色譜法測(cè)定Boc-D-丙氨酸酯、Boc-L-丙氨酸酯、Boc-D-丙氨酸和 Boc-L-丙氨酸的含量。
[0019] 本發(fā)明以式（I )所示的Boc-DL-氨基酸酯為反應(yīng)底物，在催化劑（即解淀粉芽 孢桿菌WZZ002發(fā)酵培養(yǎng)獲得的干菌體，該干菌體產(chǎn)生微生物酯水解酶）作用下，進(jìn)行選擇 性水解反應(yīng)制得所述的Boc-D-氨基酸酯（II )和Boc-L-氨基酸（III):
[0020]

【權(quán)利要求】
1. 解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)WZZ002,保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保 藏中心，保藏地址：中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，郵編430072,保藏編號(hào)CCTCC M 2013366,保藏日 期2013年8月8日。
2. -種權(quán)利要求1所述解淀粉芽孢桿菌WZZ002在拆分N-叔丁氧羰基-DL-氨基酸酯 中的應(yīng)用。
3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為：以解淀粉芽孢桿菌WZZ002經(jīng) 發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體凍干后的干菌體為催化劑，以外消旋N-叔丁氧羰基-DL-氨基酸酯 為底物，于PH值為6?9的磷酸緩沖液中，在20?50°C下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將反 應(yīng)液后處理，獲得N-叔丁氧撰基-D-氨基酸酯和N-叔丁氧撰基-L-氨基酸。
4. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述干菌體的質(zhì)量用量為1?50g/L緩沖液， 所述底物的初始濃度為1?200g/L緩沖液。
5. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述底物為N-叔丁氧羰基-DL-丙氨酸酯、 N-叔丁氧撰基-DL-2-氨基丁酸酯、N-叔丁氧撰基-DL-正纟顏氨酸酯、N-叔丁氧撰基-DL-蛋 氨酸酯、N-叔丁氧羰基-DL-脯氨酸酯、N-叔丁氧羰基-DL-絲氨酸酯、N-叔丁氧羰基-DL-亮 氨酸酯、N-叔丁氧羰基-DL-異亮氨酸酯、N-叔丁氧羰基-DL-蘇氨酸酯、N-叔丁氧羰 基-DL-色氨酸酯或N-叔丁氧羰基-DL-苯丙氨酸酯。
6. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述催化劑按如下方法制備： (1) 斜面培養(yǎng) 將解淀粉芽孢桿菌WZZ002接種至斜面培養(yǎng)基，在30°C培養(yǎng)24h，獲得斜面菌落； 斜面培養(yǎng)基終濃度組成：NaN033. Og/L，KH2PO4L Og/L，MgSO4 · 7Η20(λ 5g/L，KCKX 5g/L， FeSO4 · 7H200. 01g/L，Boc-DL-丙氨酸酯 10mmol/L，溶劑為去離子水，pH7. 0 ; (2) 種子培養(yǎng) 將步驟⑴獲得的斜面菌落接種于種子培養(yǎng)基，在30°C、200r/min培養(yǎng)24h，獲得 種子液；種子培養(yǎng)基終濃度組成：蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，酵母膏l(xiāng)g/L，麥芽糖5g/L， NaClO. 5g/L，瓊脂23g/L，溶劑為去離子水，ρΗ7· 0 ; (3) 發(fā)酵培養(yǎng) 在無(wú)菌條件下，將種子液以體積濃度5?20%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C、 200r/min培養(yǎng)24h，獲得發(fā)酵液，將發(fā)酵液離心，棄上清液，得到解淀粉芽孢桿菌WZZ002濕 菌體，將濕菌體懸浮于pH7. 0、0. 2mol/L的磷酸鹽緩沖液中，攪拌均勻，冷凍干燥，得到干菌 體；發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，酵母膏l(xiāng)g/L，MgS0 4lmmol/L,溶劑為去離 子水，pH7. 0。
7. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述反應(yīng)液后處理的方法為：轉(zhuǎn)化反應(yīng)完全 后，將轉(zhuǎn)化反應(yīng)液過(guò)濾除去菌體，濾液用有機(jī)溶劑萃取，分別獲得有機(jī)相和水相，有機(jī)相減 壓蒸餾除去溶劑，獲得N-叔丁氧羰基-D-氨基酸酯；所述有機(jī)溶劑為正己烷、環(huán)己烷或乙酸 乙酯；水相調(diào)pH值至2. 0后,用萃取劑萃取,取萃取后的有機(jī)相得到N-叔丁氧羰基-L-氨 基酸，所述萃取劑為正己烷、環(huán)己烷或乙酸乙酯。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK104212738SQ201410380289
【公開(kāi)日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年8月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月4日
【發(fā)明者】鄭建永, 汪釗, 朱勅章, 銀軍 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)