與黃瓜白粉病抗性主效qtl共分離的ssr分子標記的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了三個與黃瓜白粉病抗性主效QTL共分離的SSR分子標記,分別命名為SSR-N1、SSR-N2和SSR-N3。SSR-N1的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示;SSR-N2的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示;SSR-N3的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。本發(fā)明的三個SSR分子標記都具有高穩(wěn)定性,可以簡便、快速地應用于黃瓜苗期白粉病抗性單株的輔助篩選,為白粉病抗性的分子標記輔助育種奠定了基礎,這將大大加快黃瓜白粉病抗性分子育種的進程。同時,這些共分離的分子標記也為黃瓜白粉病抗性主效QTL的克隆奠定基礎。
【專利說明】與黃瓜白粉病抗性主效QTL共分離的SSR分子標記
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程技術,具體涉及與黃瓜白粉病抗性主效QTL共分離的SSR分 子標記。
【背景技術】
[0002] 黃瓜(Cucumis sativus L.)為葫蘆科(Cucurbitaceae)甜瓜屬一年生草本蔓生 攀緣植物。黃瓜作為世界十大重要的蔬菜作物之一,也是我國主栽蔬菜作物之一,占全國蔬 菜面積的10%左右。黃瓜不僅作為重要的蔬菜作物歷來備受育種家的重視,并且黃瓜染色 體數目較少2n = 2x = 14,基因組較小,特別在2009年,黃瓜基因組的成功測序為黃瓜作為 葫蘆科的模式植物進行分子生物學研究提供了極大便利。
[0003] 在黃瓜生產中,面臨許多疾病的危害,其中白粉病是最為嚴重的病害之一。黃瓜 白粉病是由專性寄生菌(Podosphaera xanthii)引起的真菌病害,能在整個黃瓜生育期發(fā) 病,主要危害葉片,嚴重時可危害莖蔓,特別是在生長中后期發(fā)病嚴重,使植株提早拉秧,造 成嚴重的產量損失。田間施藥,造成農藥殘留,影響果實品質,危及食品安全,并且會污染環(huán) 境。長期施藥還會促進白粉病菌生理小種產生抗性,從而增加防治難度,增加種植戶生產 成本。培育抗病的黃瓜品種是解決白粉病危害的最好方法。常規(guī)的抗病育種耗時長,需要 經過多代雜交和回交過程;病害發(fā)生和環(huán)境條件密切相關,需要專門的病圃進行接種鑒定; 這些都增加了培育黃瓜抗病品種的難度。
[0004] 分子育種可以大大加快育種進程,顯著縮短育種周期?,F代生物技術的迅猛發(fā)展, 為抗病育種開辟了新的途徑,利用生物技術培育抗病品種已成為目前的熱點。分子育種的 前提是獲得相關性狀的功能基因或與其緊密連鎖的分子標記。利用分子標記分析體系,在 遺傳群體上鑒定抗病遺傳規(guī)律,同時結合分子標記遺傳連鎖圖譜,定位和克隆白粉病抗性 基因,研究其功能和抗性的分子調控機制,可以為黃瓜抗性基因的分子標記輔助育種及分 子設計育種提供理論依據。利用與抗病基因緊密連鎖的分子標記,開展分子標記輔助選擇 育種,可將多個抗病基因整合到一個品種,顯著提高育種效率,縮短育種時間,而且大幅度 提高了抗病的力度和持久性,這對于培育出滿足種植者需求的黃瓜抗病新品種具有重要意 義。
[0005] 雖然葫蘆科作物黃瓜白粉病的發(fā)生比較普遍和嚴重,但是關于其白粉病抗性基因 定位的研究相對較薄弱,尚未找到與白粉病抗性基因/QTL共分離的標記,更不用說基因的 克隆及抗性分子機制的研究,目前停留在主效基因/QTL定位的階段。由于諸多報道表明 黃瓜白粉病抗性由多個隱性基因控制,研究者對其進行了 QTL的分析。2006年,Sakata等 利用97株黃瓜抗感組合的重組自交系群體,首次定位了黃瓜抗白粉病性狀的QTL ;在4個 連鎖群上檢測到6個與溫度相關的QTL,其中在LGII上的一個主效QTL在20°C和26°C下 均表現出抗性。Liu等(2008a)利用黃瓜高感白粉病自交系S94和高抗白粉病自交系S06 構建的F 2 : 3家系進行了 QTL定位,共檢測到5個白粉病抗性QTL,分布于連鎖群1、2、5上, 單個QTL的貢獻率介于3. 4%?45%之間;還通過這兩親本構建的重組自交系共檢測到4 個白粉病抗性QTL,分別位于連鎖群1、2、4、6上,單個QTL的貢獻率介于5. 2%?21. 0%之 間(Liu et al.,2008b)。沈_平(2009)應用 ISSR(inter_simple sequence repeats)和 SRAP(sequence_related amplified polymorphism)標記技術,以高感白粉病黃瓜品種D8和 高抗白粉病黃瓜品種JIN5的F2群體檢測到控制黃瓜白粉病抗性的2個QTL,均位于第3連 鎖群上,貢獻率為7.6%和13.5%。張圣平等(2011)以1(8(抗?。‐1(18(感病)組合的& 和F 2 : 3家系為研究對象,共檢測到4個白粉病抗性的QTL。最近,Fukino等(2013)利用重 組自交系檢測到9個QTL,分別位于染色體1、3、4、5、6上,單個QTL的貢獻率介于5 %?44% 之間,其中4個位點的效應通過剩余雜合體(residual heterozygous lines,RHLs)得到了 證實。He等(2013)利用F2 : 3家系對黃瓜下胚軸、子葉和真葉的白粉抗性同時進行了 QTL 分析,結果在1、3、4、5號染色體上檢測到6個QTL,單個QTL的貢獻率介于6. 1%?74. 5% 之間;其中2個主效QTL位于5號染色體的40 cM的區(qū)間內,解釋21. 0-74. 5%的貢獻率, 下胚軸抗性QTL對黃瓜白粉抗性起到了最重要的作用。
[0006] 上述多數研究表明,黃瓜對白粉病的抗性由多個基因共同作用,而且抗性基因表 現為隱性效應,這些因素增加了抗病基因精細定位和分離的難度。由于黃瓜白粉病對黃瓜 生產影響很大,對黃瓜白粉病抗性基因的研究很多,但是目前尚未有該抗病基因克隆和分 子機制研究的報道,已獲得的連鎖標記遺傳距離較遠,不利于分子標記輔助育種的開展,阻 礙了抗病品種分子育種的進程。因此,尋找與黃瓜白粉病抗性基因/QTL緊密連鎖、共分離 的分子標記,對其進行精細定位、分離與克隆,這不但能夠為其抗病分子育種提供良好的技 術支撐,也為揭開黃瓜白粉病抗性的分子機制奠定基礎。
【發(fā)明內容】
[0007] 本發(fā)明的目的,在于克服QTL定位難度大的問題,提供三個與黃瓜白粉病抗性 主效QTL pm5.1共分離的共顯性SSR分子標記。本發(fā)明利用BSA(Bulked Segregant Analysis)和QTL定位法,找到一個控制白粉病抗性的主效QTL。為了精細定位此主效QTL, 我們構建了含主效QTL的染色體片段代換系(Chromosome Segment Substitution Lines, CSSL)及其回交分離群體。通過精細定位及標記的開發(fā),得到三個與黃瓜白粉病抗性主效 QTL共分尚的SSR標記,以便分子標記輔助育種體系的建立。本發(fā)明的分子標記可簡便、快 速、高通量地應用于育種實踐。
[0008] 本發(fā)明是通過以下技術方案實現的:
[0009] -個與黃瓜白粉病抗性主效QTL共分離的SSR分子標記,命名為SSR-N1,其核苷酸 序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0010] 上述SSR-N1由上游引物SSR-N1-F和下游引物SSR-N1-R PCR擴增得到,所述上游 引物SSR-N1-F的序列為5'-CCACAACAGCAGAAGGCTAACA-3',所述下游引物SSR-N1-R的序列 為 5' -CCAATGGGTTGATAGAGGGAGA-3'。
[0011] 一個與黃瓜白粉病抗性主效QTL共分離的SSR分子標記,命名為SSR-N2,其核苷酸 序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0012] 上述SSR-N2由上游引物SSR-N2-F和下游引物SSR-N2-R PCR擴增得到,所述上游 引物SSR-N2-F的序列為5' -CTTCATTGTTGATTTCCAGGC-3',所述下游引物SSR-N2-R的序列 為 5, -TGTTACGACCTATAACCACAAAAT-3,。
[0013] 一個與黃瓜白粉病抗性主效QTL共分離的SSR分子標記,命名為SSR-N3,其核苷酸 序列如SEQ IDN0. 3所示。
[0014] 上述SSR-N3由上游引物SSR-N3-F和下游引物SSR-N3-R PCR擴增得到,所述上游 引物SSR-N3-F的序列為5'-GAAGATGCATCGAATTGAAACA-3',所述下游引物SSR-N3-R的序列 為 5' -ATGATGTCCCAACTTATCCAAA-3'。
[0015] 本發(fā)明用BSA和QTL定位法,利用&群體找到一個控制白粉病抗性的主效QTL。 為了精細定位此主效QTL,利用不斷回交的方法構建了含主效QTL的染色體片段代換系 (Chromosome Segment Substitution Lines,CSSL)及其回交分離群體。通過對回交分離 群體BC^,BC2F2的抗性鑒定分析,白粉病抗性已變?yōu)閱蚊系聽栆蜃舆z傳,即由單基因控制, 抗性為隱性遺傳。通過精細定位,抗性基因定位到標記UW065021與UW065094之間,物理距 離170kb。通過黃瓜基因組序列,在其中間開發(fā)SSR標記,最后得到三個與黃瓜白粉病抗性 主效QTL共分離的SSR標記,分別被命名為SSR-N1,SSR-N2, SSR-N3。本專利發(fā)明的3個共 分離SSR分子標記為共顯性標記,能夠區(qū)分純合體和雜合體,將有利于白粉病抗性育種的 分子標記輔助體系的建立,可簡便、快速、高通量地應用于育種實踐。
[0016] 與現有技術相比,本發(fā)明具有如下有益效果:常規(guī)傳統的抗病育種耗時長,需要經 過多代雜交和回交過程;病害發(fā)生和環(huán)境條件密切相關,需要專門的病圃進行接種鑒定; 這些都增加了培育黃瓜抗病品種的難度。由于白粉病菌為專性寄生菌,抗性鑒定需要接種, 且發(fā)病后植株容易死掉;而且白粉病抗性基因多表現為隱性效應,常規(guī)方法回交育種需要 回交一代后再自交一代來確認抗性基因的滲入,這些因素都增加了白粉病抗性育種的周期 和難度。本發(fā)明的共分離SSR分子標記為共顯性,可在黃瓜苗期鑒定植株,并能夠區(qū)分純合 子和雜合子,回交滲入過程中省去了每代自交的步驟,用分子標記來跟蹤抗性基因,既省時 也準確,所以可用于黃瓜白粉病抗性的分子標記輔助育種,大大加速黃瓜白粉病抗性育種 的進程。同時共分離標記也將促進白粉病抗性QTL/基因的克隆,從而為揭示白粉病抗性形 成的分子機制奠定基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017] 圖1是分子標記SSR-N1的聚丙烯酰胺凝膠電泳效果;
[0018] 圖2是分子標記SSR-N2的聚丙烯酰胺凝膠電泳效果;
[0019] 圖3是分子標記SSR-N3的聚丙烯酰胺凝膠電泳效果。
[0020] 圖中所示,S1001為抗病親本;S05為感病親本;Fi代表兩親本雜交后代;R和S分 別代表BC 2F2回交分離群體中隨機挑選的抗病和感病植株的檢測結果。
【具體實施方式】
[0021] 一、黃瓜白粉病抗性主效QTL/基因的鑒定
[0022] 1.群體構建與抗性鑒定
[0023] 初步的抗性QTL定位用的是F2群體,抗病親本是S1003,感病親本是S1001,它們 都屬于華北類型的黃瓜自交系。兩親本雜交產生的匕代自交產生F 2代群體。白粉病抗性 鑒定所使用的菌種是從上海交通大學溫室發(fā)病的黃瓜植株上分離得到的。隨機選擇148株 F2代個體在苗期進行抗性鑒定。從感病幼苗上采集純化的白粉病菌,用無菌水制成孢子懸 浮液,調至濃度為1X 105個· mL'在黃瓜第三片真葉剛展開時把調配好的孢子懸浮液均 勻噴到真葉上,以不成水滴狀為準。接種培養(yǎng)12d后調查發(fā)病情況。植株的發(fā)病情況根據 Morishita等(2003)劃分為5個等級。0級和1級視為抗病,2級以上視為感病。
[0024] 根據發(fā)病調查,S1003為高抗,S1001為高感,Fi為感病,偏向于感病親本;F2群體 抗病性呈現雙峰分布,且發(fā)病趨勢偏向于感病,中間類型較少,說明存在隱性的主效基因控 制白粉的抗病性。
[0025] 2. BSA法和QTL分析確定主效基因的染色體位置
[0026] 因此我們采取BSA法先對抗性主效基因所在的染色體區(qū)域進行了分析。從F2分 離群體中分別隨機選取高抗和高感個體各10株,建立抗、感基因池。用780對在染色體上 平均分布的SSR引物對兩個親本及兩個基因池進行篩選。
[0027] 551?反應體系為基因組0嫩30叩,引物0.2 4 111〇1/1,20(^111〇1/1(1階138,2臟〇1/1 MgC12,lyl 10XPCR reactions buffer,0.5U TaqDNA聚合酶,總反應體系為 lOyLPCR擴 增程序為:94°C 5min ;35 個循環(huán):94°C 30s,55-60°C 30s,72°C 30s ;72°C 5min。擴增產物用 6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,電泳緩沖液為1XTBE,45W恒功率,電泳1. 5h-2h。
[0028] 電泳后進行銀染。銀染方法為:將帶膠的玻璃板放入固定液中,在搖床上輕輕 搖動至指示劑顏色褪去,其中固定液的組成為:冰醋酸、無水乙醇、蒸餾水的體積比為 1 : 10 : 100;用超純水洗lmin-3min;將沖洗后的膠板放入染色液中搖動半小時,其中染 色液的組分為2g/L硝酸銀;將染色后的膠板放入超純水中漂洗5s后放入裝有顯影液的塑 料盒中,輕輕搖動至條帶清晰,放入自來水中沖洗3min ;室溫下干燥,干燥后拍照,其中顯 影液是在1L蒸餾水中加入15g NaOH和3ml甲醛混勻得到的。
[0029] 通過BSA篩選,在第五染色體長臂末端的連續(xù)7個SSR標記在池間表現為多態(tài)性, 因此白粉病抗性主效基因位于這個區(qū)域內。為了進一步確定抗性主效基因的位置,我們進 行了 QTL分析。從黃瓜7條染色體上平均的選擇了 73個多態(tài)性SSR標記對148株F2代個 體進行了電泳分析。使用JoinMap 3. 0構建連鎖圖譜,其中L0D > 5. 0,采用Kosambi函數 將重組率轉化為遺傳圖距。將F2群體單株三個葉片等級的均值作為植株抗病的病情指數 進行QTL作圖。QTL分析使用QTL Cartographer 2. 5,采用復合區(qū)間作圖法(CM)進行QTL 作圖。通過QTL分析的結果,在第五染色體的長臂末端找到一個主效QTL pm5. 1,這與BSA 法得出的位置吻合,因此我們確定這個位置存在一個控制白粉病抗性的主效QTL。
[0030] 二、回交分離群體的構建和主效QTL的精細定位
[0031] 由于親本S1003與S1001都為華北類型黃瓜,親緣關系近,多態(tài)性標記少,因此構 建回交分離群體時采用了高感白粉病的歐洲溫室類型黃瓜自交系S05作為供體親本。結合 MAS通過多代回交后自交,構建了僅主效QTL pm5. 1區(qū)域分離的回交群體BQFpBCA。分 別對2個BC^群體(114株,480株)和BC2F2群體(483株)的抗性鑒定,抗、感比例經過 卡方分析符合1 : 1和1 : 3,因此,抗性QTL已經轉化為單孟德爾因子,即單基因控制,且 抗病為隱性遺傳。通過主效QTL區(qū)域已開發(fā)的分子標記對這1074個單株進行連鎖分析,結 果將抗病基因精細定位到SSR標記UW065021與UW065094之間,物理距離170kb。通過黃瓜 基因組序列,在其中間開發(fā)了 15對SSR標記,結果只有3對在親本間有多態(tài)性,即本發(fā)明的 三個分子標記SSR-N1,SSR-N2, SSR-N3。通過群體連鎖分析,最后得出這三個SSR分子標記 與黃瓜白粉病抗性主效QTL共分離,即群體的抗病植株帶型全部和抗病親本帶型一致,而 感病植株帶型全部為感病親本或者Fi的帶型。
[0032] 圖1是分子標記SSR-N1的聚丙烯酰胺凝膠電泳效果,圖2是分子標記SSR-N2的 聚丙烯酰胺凝膠電泳效果,圖3是分子標記SSR-N3的聚丙烯酰胺凝膠電泳效果。
[0033] 序列表 <110>上海交通大學 <120>與黃瓜白粉病抗性主效QTL共分離的SSR分子標記 <160> 9 <2101 <211>284 <212> DNA <213> 黃瓜(Cacwmii swfL.) <4001 ccacaacagc agaaggctaa cacatagaga gagagagaga gagagagraa gag^pgagt 60 aaatagtgaa gtaaiattaa ^caactgca catcaattca tcacaattga mmmma, 120 aattccatcc atcaagattt aaattcaaac aaaggatgta tatagtggtc acagtatttg 180 agtatacctt cttgttggga gttgacttaa aaggtcaatc ^aaactcca tgaacctctc 240 acaatacaaa atacaagcat tgtctccctc tatcaaccca ttgg 284 <210>2 <21I> 196 <212>DNA <213> H/R (Cucumis sativrn L.) <400> 2 cttcattgtt g 講 ttceagg ?mgwtgMg 棚aagMMW 踢纖g?Ml? g變翁iittu $0 ttaatgtalg tatttgatat gtatatgtgt gtgtgtggag acttttaagt agaagtttat 120 caaatttctc ntaaciaca tectcaacg gttagatgtt gcactaagtg attattttgtg 180 gttataggtc gtaaca 196 <210>3 <2tl>274 <212> DNA <213>^f M. ( Cucumis sativrn L.) <400 3 ga^atgcat cgaattgaaa cattttcatt aagacataca atgacatata ttcgttaaga 60 taacttetM taa^tcgaa gttoggtgta atttgtpga ttgtaaattg ttaaategat 120 tatataatag agttgtcatc gtagtacttc attaaiatta tataatatta atgacagaga 180
[0034] ctaaattgaa atatatatat ataatatoaa gttcaaaatt acaaatcaac atatatattc 240 ccataagata actttggata agttgggaca teat 274 <210>4 <211>22 <212> DNA <2]3>人工序列 <400>4 ccacaacagc ag^gctm ca 22 <210>5 <211>22 <212> DNA <213>人工序列 <400>5 ccaatgggtt gatagaggga ga 22 <210>6 <211>2i <212〉DNA <213>人工序列 <400>6 ctlcattgttgattteeaggc 21 <210 7 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <400 7 t^tacgacc tataaccaca aaat 24 <210 8 <211>22 <212>DNA
[0035] <213>人工序列 <400>8 ga^atgcat cgaattgaaa ca 22 <210>9 <211>22 <212>DNA <213>人工序列 <400> 9 atgatgtccc aacttatcca aa 22
【權利要求】
1. 一個與黃瓜白粉病抗性主效QTL共分離的SSR分子標記,命名為SSR-N1,其核苷酸 序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 根據權利要求1所述的與黃瓜白粉病抗性主效QTL共分尚的SSR分子標記,其特征 在于,所述SSR-N1由上游引物SSR-N1-F和下游引物SSR-N1-R PCR擴增得到,所述上游引 物SSR-N1-F的序列為5'-CCACAACAGCAGAAGGCTAACA-3',所述下游引物SSR-N1-R的序列為 5' -CCAATGGGTTGATAGAGGGAGA-3'。
3. -個與黃瓜白粉病抗性主效QTL共分離的SSR分子標記,命名為SSR-N2,其核苷酸 序列如SEQ IDN0. 2所示。
4. 根據權利要求3所述的與黃瓜白粉病抗性主效QTL共分尚的SSR分子標記,其特征 在于,所述SSR-N2由上游引物SSR-N2-F和下游引物SSR-N2-R PCR擴增得到,所述上游引 物SSR-N2-F的序列為5' -CTTCATTGTTGATTTCCAGGC-3',所述下游引物SSR-N2-R的序列為 5' -TGTTACGACCTATAACCACAAAAT-3'。
5. -個與黃瓜白粉病抗性主效QTL共分離的SSR分子標記,命名為SSR-N3,其核苷酸 序列如SEQ ID NO. 3所示。
6. 根據權利要求5所述的與黃瓜白粉病抗性主效QTL共分尚的SSR分子標記,其特征 在于,所述SSR-N3由上游引物SSR-N3-F和下游引物SSR-N3-R PCR擴增得到,所述上游引 物SSR-N3-F的序列為5'-GAAGATGCATCGAATTGAAACA-3',所述下游引物SSR-N3-R的序列為 5' -ATGATGTCCCAACTTATCCAAA-3'。
【文檔編號】C12N15/11GK104152446SQ201410382306
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月6日 優(yōu)先權日:2014年8月6日
【發(fā)明者】蔡潤, 聶京濤, 潘俊松, 何歡樂, 楊俊俊, 彭佳林 申請人:上海交通大學