一種枯草芽孢桿菌b51及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種枯草芽孢桿菌B51，保藏編號(hào)為：CGMCCNo.7541，保藏日期為2013年04月28日，其分類命名為枯草芽孢桿菌( Bacillussubtilis )，已保藏在中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。本發(fā)明枯草芽孢桿菌B51對(duì)鐵皮石斛根腐病菌、小麥赤霉病、草莓灰霉病等多種病原真菌具有很好的抑制作用，該拮抗細(xì)菌對(duì)其他植物病害也有很好的防治效果；具有繁殖速度快；能夠人工培養(yǎng)，易于操作，便于生產(chǎn)應(yīng)用；抗逆能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，尤其是對(duì)真菌引起的鐵皮石斛根腐病的防治具有重要意義；培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、容易保存，易于工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。CGMCC No.75412013.04.28
【專利說(shuō)明】一種枯草芽孢桿菌B51及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物保護(hù)領(lǐng)域，尤其涉及一種枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)B51 及其在防治鐵皮石斛根腐病中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，隨著公眾對(duì)食品和環(huán)境中化學(xué)農(nóng)藥安全性的普遍關(guān)注，以及一些危險(xiǎn)性 化學(xué)農(nóng)藥的禁用，促使人們尋求安全有效的植物病害控制新途徑，利用有益微生物防治植 物病害日趨受到重視。它是向被打破了的植物自然生態(tài)系中引入對(duì)植物有益的外源拮抗 菌、或通過(guò)調(diào)節(jié)環(huán)境促使自然的有益微生物群體增長(zhǎng)，并表現(xiàn)出生防活性，通過(guò)微生物之間 的相互作用達(dá)到防病目的。目前，植物病害的生防已成為各國(guó)研究重點(diǎn)。
[0003] 自然界潛在的微生物資源種類豐富，在微生物農(nóng)藥的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)方面有明顯優(yōu)勢(shì)， 因此世界各國(guó)都投入大量的人力和財(cái)力，研究、開(kāi)發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型微生物農(nóng)藥， 并以此帶動(dòng)其他高科技產(chǎn)業(yè)的全面發(fā)展。我國(guó)也把微生物農(nóng)藥的研制和開(kāi)發(fā)列為國(guó)家重點(diǎn) 科技攻關(guān)和高新技術(shù)發(fā)展計(jì)劃，江蘇省政府也把微生物農(nóng)藥創(chuàng)制作為生物農(nóng)業(yè)的一個(gè)重要 組成部分。
[0004] 生物農(nóng)藥（biopesticides)，按照Copping和Menn的定義包含了活體微生物（真 菌、細(xì)菌和病毒），昆蟲(chóng)植病線蟲(chóng)，植物源農(nóng)藥，微生物農(nóng)藥，微生物次生代謝物（抗生素） 等，用于防治各種昆蟲(chóng)和病害；生物農(nóng)藥（特別是微生物農(nóng)藥）具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)人類健 康威脅小，對(duì)環(huán)境較安全，這正是全社會(huì)最關(guān)心的問(wèn)題之一。因此，進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，各國(guó) 政府和植物保護(hù)工作者更加重視生物農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，已成為研究熱點(diǎn)。
[0005] 微生物農(nóng)藥的特性賦予了農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略，為保護(hù)農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境，保障食品 安全提供物質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)支撐；同時(shí)微生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)也是未來(lái)經(jīng)濟(jì)中具有發(fā)展?jié)摿Φ男略?長(zhǎng)點(diǎn)之一。研究微生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展對(duì)于政府部門科學(xué)制定促進(jìn)微生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的政 策體系，實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，促進(jìn)循環(huán)經(jīng)濟(jì)和可持續(xù)社會(huì)發(fā)展戰(zhàn)略，保障我省經(jīng)濟(jì)建設(shè) 和農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的協(xié)調(diào)發(fā)展，以及建設(shè)我省農(nóng)產(chǎn)品安全體系等都將具有十分重要作用。
[0006] 鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo)屬國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物，是中 藥石斛中珍貴品種之一，因表皮呈鐵綠色而得名；其主要成分具有獨(dú)特的保健與藥用價(jià)值， 被道家養(yǎng)生經(jīng)典著作《道臧》譽(yù)為"中華九大仙草之首"。在我國(guó)，自然分布于浙江、安徽、福 建、湖南、廣西、四川和云南等地人跡稀少的，懸崖峭壁背陰處的石縫里，終年飽受云霧雨露 滋潤(rùn)，生長(zhǎng)期為3-5年，自然產(chǎn)量極少。是一種及其名貴、藥食同源的滋陰補(bǔ)品。因其生存 的生態(tài)條件十分特殊、苛刻，自然繁殖率極低，人間難得一見(jiàn)，兼以飽吸天地日月云霧雨露 之精華，有著起死回生的神奇功效，故有"救命仙草"之稱。
[0007] 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和中醫(yī)藥理研究表明，鐵皮石斛有效成分主要為石斛堿、石斛多糖、氨基 酸等生物活性成分，能顯著提高機(jī)體免疫功能，具有滋陰清熱、耐缺氧、抗疲勞、抗衰老、防 治腫瘤、治療糖尿病和萎縮性胃炎等多重功效，對(duì)煙酒、勞累、夜生活、用眼用腦過(guò)度人群及 聲帶撕?jiǎn)≌哂谢謴?fù)作用。
[0008] 但是，盡十多年來(lái)，隨著鐵皮石斛人工栽培面積不斷擴(kuò)大，病蟲(chóng)害發(fā)生普遍，且較 嚴(yán)重，特別是鐵皮石斛根腐病的發(fā)生，有時(shí)會(huì)造成大面積的成片死亡，導(dǎo)致巨大經(jīng)濟(jì)損失， 為此，鐵皮石斛根腐病的防治具有現(xiàn)實(shí)意義。申請(qǐng)者通過(guò)2年多的研究，形成本發(fā)明專利。
[0009] 從保護(hù)生態(tài)環(huán)境和食品安全的角度出發(fā)，鐵皮石斛需要有機(jī)栽培，研制對(duì)人體安 全的微生物制劑來(lái)控制鐵皮石斛病害，已達(dá)到安全食用的目的。也符合生物農(nóng)業(yè)發(fā)展和政 府、社會(huì)與生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 發(fā)明目的：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供 一種對(duì)鐵皮石斛根腐病菌具有拮抗作用的枯草芽孢桿菌B51。
[0011] 本發(fā)明的所要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種枯草芽孢桿菌B51在防治鐵皮 石斛根腐病、草莓根腐病、草莓灰霉菌、草莓炭疽菌和/或小麥赤霉病菌中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明所述解決的第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供了一種枯草芽孢桿菌B51菌劑。技術(shù)方 案：為了解決上述第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：一種枯草芽孢桿菌B51， 其特征在于：保藏編號(hào)為：CGMCC No. 7541，保藏日期為2013年04月28日，其分類命名為 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)，已保藏在中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（簡(jiǎn)稱 CGMCC)。保藏單位地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵 政編碼為100101。
[0013] 為了解決上述第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：
[0014] 本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌B51在防治鐵皮石斛根腐病中的應(yīng)用。
[0015] 所述的枯草芽孢桿菌B51在抑制鐵皮石斛根腐病菌生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
[0016] -種枯草芽孢桿菌B51菌劑，將枯草芽孢桿菌B51接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在 28°C -35°C下發(fā)酵培養(yǎng)48-72小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速120?160轉(zhuǎn)/分，得到的發(fā)酵液作為防治鐵 皮石斛根腐病菌的菌劑。
[0017] 本發(fā)明所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為=IOOOmL蒸餾水，牛肉膏2-5g，蛋白胨5-10g， 氯化鈉 4-5g，pH6.5-7.5。
[0018] 所述的枯草芽孢桿菌B51在抑制草莓根腐病菌生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
[0019] 所述的枯草芽孢桿菌B51在抑制草莓灰霉菌生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
[0020] 所述的枯草芽孢桿菌B51在抑制草莓炭疽菌生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
[0021] 所述的枯草芽孢桿菌B51在抑制小麥赤霉病菌長(zhǎng)中的應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明中所述的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)B51的生理活性特征如下：
[0023] 所述枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)B51在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上菌落 較大，乳白色，直徑一般4-6mm，表面隆起，干燥，有皺褶，邊緣較規(guī)則，菌體桿狀，兩端鈍圓， 具周生鞭毛，大小為1. 57-5. 38X0. 46-0. 65 μ m，平均3. 44X0. 57 μ m ;芽孢兩端生，橢圓 形，大小為 〇· 81-0. 97 X 0· 42-0. 75 μ m，平均 0· 80 X 0· 53 μ m。
[0024] 革蘭氏染色表現(xiàn)為陽(yáng)性；酪蛋白水解、淀粉水解、明膠液化為陽(yáng)性，V. P反應(yīng)可變， 吲哚反應(yīng)陰性；糖類產(chǎn)酸發(fā)酵。
[0025] 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)B51即解淀粉芽孢桿菌的16SrDNA序列如 SEQ ID No. 1所示。將所測(cè)16SrDNA序列通過(guò)BLAST比對(duì)，鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)ο
[0026] 有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：
[0027] (1)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)B51對(duì)多種植物病原菌具有抑制作用，在 拮抗細(xì)菌對(duì)植物病害生物防治中起到非常重要的作用，例如種類和數(shù)量眾多；對(duì)病原菌的 作用方式多樣化；繁殖速度快；能夠人工培養(yǎng)，易于操作，便于生產(chǎn)應(yīng)用；抗逆能力強(qiáng)等優(yōu) 點(diǎn)，尤其是對(duì)真菌引起的鐵皮石斛根腐病的防治具有重要意義；也是保證中藥安全重要手 段。
[0028] (2)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)B51培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、容易保存，易于工業(yè) 化生產(chǎn)，具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0029] 圖Ia枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis)B51的形態(tài)圖；
[0030] 圖Ib為本發(fā)明中枯草芽孢桿菌（B. subtilis)B51芽孢形態(tài)圖（在一端或兩端折 光體）
[0031] 圖2a為本發(fā)明中枯草芽孢桿菌（B. subtilis)B51對(duì)鐵皮石斛根腐病菌（Fusarium proliferatum)的抑制作用；
[0032] 圖2b為本發(fā)明中枯草芽孢桿菌（B. subtilis)B51對(duì)草莓根腐?。‵usarium oxsporum)的抑制作用；
[0033] 圖2c為本發(fā)明中枯草芽孢桿菌（B. subtilis)B51對(duì)草莓灰霉菌（Botrytis cinerea)的抑制作用；
[0034] 圖2d為本發(fā)明中枯草芽孢桿菌（B. subtilis)B51對(duì)膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporiodes)的抑制作用；
[0035] 圖2e為本發(fā)明中枯草芽孢桿菌（B. subtilis)B51對(duì)小麥赤霉病菌（Fusarium asiaticum)的抑制作用；
[0036] 圖3a為本發(fā)明中采用枯草芽孢桿菌（B. subtilis)B51對(duì)鐵皮石斛根腐病的防治 試驗(yàn)；
[0037] 圖3b為本發(fā)明中未采用枯草芽孢桿菌（B. subti lis) B51菌液處理鐵皮石斛（對(duì) 照）。

【具體實(shí)施方式】
[0038] 下面是本發(fā)明的具體實(shí)施例
[0039] 實(shí)施例1 :枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)B51菌劑的制備方法：將枯草芽 孢桿菌（B. subtilis)B51接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，pH6. 5,500mL三角瓶中裝液量為300mL， 28°C -35°C，搖床轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/分，48小時(shí)，得到的發(fā)酵液即為防治鐵皮石斛根腐病的原菌 液。
[0040] 其中發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為=IOOOmL蒸餾水，牛肉膏2g，蛋白胨5g，氯化鈉5g， ρΗ6· 5〇
[0041] 實(shí)施例2 :枯草芽孢桿菌（B. subtilis)B51菌劑的制備方法：將枯草芽孢桿菌Β51 接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，pH7. 5,500mL三角瓶中裝液量為300mL，28°C -35°C，搖床轉(zhuǎn)速160轉(zhuǎn) /分，72小時(shí)，得到的發(fā)酵液即為防治鐵皮石斛根腐病的原菌液。
[0042] 其中發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：1000mL蒸餾水，牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g， ρΗ7· 5。
[0043] 實(shí)施例3 :枯草芽孢桿菌（B. subtilis)B51菌劑的制備方法：將枯草芽孢桿菌Β51 接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，pH 7,500mL三角瓶中裝液量為300mL，28°C -35°C，搖床轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/ 分，55小時(shí)，得到的發(fā)酵液即為防治鐵皮石斛根腐病的原菌液。
[0044] 其中發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：1000mL蒸餾水，牛肉膏3g，蛋白胨8g，氯化鈉5g，pH 7。
[0045] 下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)例詳細(xì)闡述本發(fā)明枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)B51的應(yīng)用。
[0046] 實(shí)驗(yàn)例1 :枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)B51對(duì)鐵皮石斛根腐病菌 (Fusarium proliferatum)、草莓根腐?。‵usarium oxsporum)、草莓灰霉菌（Botrytis cinerea)、草莓炭疽菌（Colletotrichum gloeosporiodes)、小麥赤霉病菌（Fusarium asiaticum)的平板抑菌作用。
[0047] 將用LB斜面活化的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)B51菌株劃線接種于90 mm PDA平板一側(cè)，再將鐵皮石斛根腐病菌、草莓根腐病、草莓灰霉菌、草莓炭疽菌和小麥 赤霉病菌PDA平板培養(yǎng)物用直徑5mm的打孔器打取同質(zhì)同量的菌塊，接種于平板另一側(cè)。 30 土 1°C培養(yǎng)14天和28天，觀察抑菌能力，并記錄抑制帶的寬度（如表1)，實(shí)驗(yàn)效果如圖 2a至圖2e所示。試驗(yàn)結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)B51對(duì)5種病原菌均 有較好的拮抗作用，以占據(jù)培養(yǎng)皿的直徑判斷擬制效果，用無(wú)菌的PDA圓塊作為對(duì)照。
[0048] 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)B51與不同的病原真菌進(jìn)行拮抗實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)28 天后，二者之間的抑制帶會(huì)變小，拮抗帶的寬窄各異（表2)。
[0049] 表I B51對(duì)鐵皮石斛根腐病菌和草莓根腐病原菌14天和28天的抑制作用
[0050]

【權(quán)利要求】
1. 一種枯草芽孢桿菌B51，其特征在于：保藏編號(hào)為：CGMCC No. 7541，保藏日期為2013 年04月28日，其分類命名為枯草芽孢桿菌（ZfeciBiAs ，已保藏在中國(guó)普通微生 物菌種保藏管理中心。
2. 權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌Β51在防治鐵皮石斛根腐病中的應(yīng)用。
3. 權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌Β51在抑制鐵皮石斛根腐病菌生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
4. 一種枯草芽孢桿菌Β51菌劑，其特征在于，將枯草芽孢桿菌Β51接種于發(fā)酵培養(yǎng)基 中，在28°C -35°C下發(fā)酵培養(yǎng)48-72小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速12(Γ160轉(zhuǎn)/分，得到的發(fā)酵液作為防 治鐵皮石斛根腐病菌的菌劑。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的枯草芽孢桿菌Β51菌劑，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方 為：1000 mL蒸餾水，牛肉膏2-5g，蛋白胨5-10g，氯化鈉4-5g，pH6. 5-7. 5。
6. 權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌B51在抑制草莓根腐病菌生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
7. 權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌B51在抑制草莓灰霉菌生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
8. 權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌B51在抑制草莓炭疽菌生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
9. 權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌B51在抑制小麥赤霉病菌長(zhǎng)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK104263673SQ201410385388
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月25日
【發(fā)明者】趙桂華, 席剛俊, 趙楠 申請(qǐng)人:江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院