Susd2蛋白作為標(biāo)記物的用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了SUSD2蛋白作為標(biāo)記物的用途，具體為SUSD2蛋白作為標(biāo)記物在鑒定、篩選或分選胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞和/或新生的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞中的應(yīng)用；以及編碼所述SUSD2蛋白的前體蛋白的mRNA作為標(biāo)記物在鑒定膜腺內(nèi)分泌iu體細(xì)胞和/或新生的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞中的應(yīng)用。本發(fā)明通過分析人多能干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化來源的胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞的基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SUSD2基因在胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞及新生的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞中富集表達(dá)，而且其編碼的蛋白為細(xì)胞膜上的受體蛋白，以該蛋白作為標(biāo)記物可以用于鑒定、篩選或分選胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞及新生的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞，對研究各發(fā)育階段的胰腺相關(guān)細(xì)胞具有重<要意義。
【專利說明】SUSD2蛋白作為標(biāo)記物的用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及SUSD2蛋白作為標(biāo)記物的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 人多能干細(xì)胞來源的胰腺beta細(xì)胞能夠為糖尿病特別是I型糖尿病的細(xì)胞替代 治療提供充足的供體胰島細(xì)胞來源。此外，人多能干細(xì)胞向胰腺beta細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化 也能夠為研究人胰腺發(fā)育過程提供一個體外研究模型。通過模擬體內(nèi)發(fā)育過程，人多能干 細(xì)胞向胰腺beta細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化主要包括以下幾個分步階段：胚內(nèi)內(nèi)胚層、腸管、前腸 后部、胰腺內(nèi)胚層和胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞。其中，胰腺內(nèi)胚層階段的細(xì)胞為混雜細(xì)胞，通常包括 胰腺前體細(xì)胞、胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞以及新生的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞等。目前主要通過胰腺發(fā) 育相關(guān)基因的表達(dá)來指征細(xì)胞命運。胰腺前體細(xì)胞主要由相關(guān)基因如I 3DXU HNF1B、S0X9、 NKX6. 1、HNF6等基因的表達(dá)來指征。胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞最主要的一個標(biāo)記基因是NGN3， 但由于其瞬時表達(dá)特征，通常會結(jié)合其下游基因如NKX2. 2、NEUR0D1等基因的表達(dá)以及 CHR0M0GRANIN A、INSULIN、GLUCAGON等內(nèi)分泌相關(guān)基因的不表達(dá)來指征胰腺內(nèi)分泌前體細(xì) 胞命運。雖然這些標(biāo)記基因的表達(dá)雖然可以用來指征特定細(xì)胞的命運，但是由于其都為轉(zhuǎn) 錄因子或分泌蛋白等，通常定位于胞漿或細(xì)胞核內(nèi)，因而無法利用這些蛋白的表達(dá)來分離 純化特定的細(xì)胞類群特別是人胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞和新生的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞，從而對其分 子特征進(jìn)行更為詳細(xì)的研究。
[0003] 目前，人多能干細(xì)胞能夠通過定向誘導(dǎo)分化得到胰腺前體細(xì)胞，但是這類細(xì)胞在 體外向功能成熟的胰腺beta細(xì)胞的分化效率低。雖然，將人多能干細(xì)胞來源的胰腺前體細(xì) 胞移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)后，能夠得到功能成熟的胰島細(xì)胞，但是由于胰腺前體細(xì)胞具 有一定的增殖能力，其致瘤性限制了其向臨床運用的推廣。相較于胰腺前體細(xì)胞，功能成熟 的胰腺beta細(xì)胞是更為理想的供體細(xì)胞來源。但如何在體外將胰腺前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化成 為功能成熟的胰腺beta細(xì)胞大大限制了糖尿病細(xì)胞替代治療方案的實現(xiàn)，而在胰腺前體 細(xì)胞向胰腺beta細(xì)胞分化的過程中，正確的胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞的高效誘導(dǎo)分化的實現(xiàn) 是最為首要的一步。通過對小鼠等模式動物的研究，大大促進(jìn)了對胰腺beta細(xì)胞發(fā)育過程 的了解，這些研究對指導(dǎo)體外胰腺beta細(xì)胞的定向分化起了決定性的作用。盡管如此，針 對胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞命運特化、不同內(nèi)分泌細(xì)胞之間的命運選擇的研究仍然較少，此外， 人與小鼠等模式動物之間也存在一定的物種差異性，因此，如果能夠找到相關(guān)分子標(biāo)記來 直接分離特定發(fā)育階段的胰腺相關(guān)細(xì)胞進(jìn)行研究的話，能夠大大加快體外功能成熟的胰腺 beta細(xì)胞的獲得。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個目的是提供一種分選或輔助分選待測細(xì)胞群體中的胰腺內(nèi)分泌前 體細(xì)胞或新生的內(nèi)分泌細(xì)胞的方法。
[0005] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：檢測待測細(xì)胞群體中的細(xì)胞是否表達(dá)SUSD2 基因，若某些細(xì)胞表達(dá)SUSD2基因，則某些細(xì)胞為或候選為胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞或新生的 內(nèi)分泌細(xì)胞；若某些細(xì)胞不表達(dá)SUSD2基因，則某些細(xì)胞不為或候選不為胰腺內(nèi)分泌前體 細(xì)胞或新生的內(nèi)分泌細(xì)胞；；
[0006] 所述SUSD2基因的核苷酸序列為序列表中序列2。
[0007] 上述方法中，所述檢測待測細(xì)胞群體中的細(xì)胞是否表達(dá)SUSD2基因是通過檢測待 測細(xì)胞群體中的細(xì)胞是否含有SUSD2基因表達(dá)的蛋白，所述檢測待測細(xì)胞群體中的細(xì)胞是 否含有SUSD2基因表達(dá)的蛋白的方法為如下1)或2)或3) :
[0008] 1)免疫熒光抗體法檢測，采用抗體為抗SUSD2單抗；
[0009] 2)流式分析檢測，采用抗體為抗SUSD2單抗；
[0010] 3)磁珠分選，采用抗體為抗SUSD2單抗。
[0011] 上述方法中，所述待測細(xì)胞為胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞。
[0012] 上述方法中，所述胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞為人源胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞。
[0013] 本發(fā)明另一個目的是通過分析胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞的基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SUSD2基因在胰 腺分泌前體細(xì)胞及新生的分泌細(xì)胞中富集表達(dá)，即該基因表達(dá)的SUSD2蛋白為兩者的分子 記。
[0014] 基于上述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了 SUSD2蛋白作為標(biāo)記物在鑒定、篩選或分選胰腺內(nèi) 分泌前體細(xì)胞和/或新生的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞中的應(yīng)用，所述SUSD2蛋白的氨基酸序列如序 列1所示。
[0015] 所述 SUSD2 蛋白在 NCBI 的登錄號為（NCBI Reference Sequence) :ΝΡ_062547· 1。
[0016] 所述新生的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞：在人多能干細(xì)胞向胰腺beta細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的 過程中，產(chǎn)生的一群激素（包括 Insulin，Glucagon，Ghrelin，Pancreatic Polypeptide， Somatostatin等）陽性的細(xì)胞，這一群細(xì)胞通常是多激素共表達(dá)的，與成熟的胰腺內(nèi)分泌 細(xì)胞相比功能并不成熟。在體內(nèi)發(fā)育過程中，所述新生的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞主要是指胚胎發(fā) 育時期功能并不成熟的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞。
[0017] 本發(fā)明還提供了能夠與所述SUSD2蛋白特異性結(jié)合的抗體在制備鑒定、篩選或分 選胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞和/或新生的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞試劑中的應(yīng)用。
[0018] 所述SUSD2蛋白是基因 SUSD2表達(dá)的蛋白，它既不是轉(zhuǎn)錄因子，也不是分泌蛋白， 而是位于細(xì)胞膜上的受體蛋白。
[0019] 通過免疫熒光抗體法檢測待測細(xì)胞是否含有SUSD2蛋白，從而確定待測細(xì)胞是否 為胰腺分泌前體細(xì)胞或新生的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞。
[0020] 所述的抗體可以是完整的抗體分子、嵌合抗體、單鏈抗體、雙特異性抗體、抗體重 鏈、抗體輕鏈、重鏈和輕鏈的同二聚體和異二聚體，以及抗原結(jié)合片段和衍生物。完整的抗 體分子可以是多抗或單抗，優(yōu)選為單抗。
[0021] 如上所述，一般可以通過免疫熒光抗體法檢測SUSD2蛋白，所述抗體或抗該抗體 的二抗需攜帶相應(yīng)的熒光標(biāo)識。
[0022] 所述胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞和新生的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞是指胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞中的一 群細(xì)胞，在適當(dāng)條件下能夠產(chǎn)生功能成熟的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞。
[0023] 所述的人胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞主要是指人多能干細(xì)胞向胰腺beta細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化 過程中胰腺內(nèi)胚層階段的細(xì)胞，或新鮮分離的及經(jīng)離體培養(yǎng)的相應(yīng)發(fā)育階段的人胚胎胰腺 組織細(xì)胞，主要包括胰腺前體細(xì)胞、胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞以及新生的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞，本發(fā) 明的主要目的在于從胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞群中篩選或分選胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞以及新生的胰 腺內(nèi)分泌細(xì)胞。
[0024] 所述胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞的來源包括：1、人多能干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化獲得；2、從分離 的人胚胎胰腺組織獲?。?、分離的人胚胎胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后的細(xì)胞。
[0025] 所述篩選或分選的方法主要采用免疫磁珠分離法或流式分選法。
[0026] SUSD2基因表達(dá)過程中首先轉(zhuǎn)錄成mRNA，然后再翻譯成SUSD2蛋白前體蛋白，再經(jīng) 過加工后產(chǎn)生成熟的SUSD2蛋白。
[0027] 基于以上原因，本發(fā)明還提供了編碼所述SUSD2蛋白的前體蛋白的mRNA作為標(biāo)記 物在鑒定胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞和/或新生的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞中的應(yīng)用。
[0028] 本發(fā)明又提供了能夠與mRNA特異性結(jié)合的引物、探針或它們的互補鏈在制備鑒 定胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞和/或新生的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞試劑中的應(yīng)用。
[0029] 所述引物可以是擴增整個mRNA的引物，也可以是擴增mRNA特征區(qū)域的引物，所述 探針是識別mRNA特定區(qū)域的核苷酸，一般攜帶標(biāo)識。
[0030] 根據(jù)實施例的記載，本發(fā)明提供了一對具體擴增所述mRNA的引物，如下所示：
[0031] 上游引物：GGCACCGCCAACACCTCA
[0032] 下游引物：GCGTGGGCAGCGACTTGA。
[0033] 所述鑒定的方法可以采用熒光定量PCR。
[0034] 本發(fā)明通過分析內(nèi)胚層細(xì)胞的基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SUSD2基因在胰腺分泌前體細(xì)胞及 新生的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞中富集表達(dá)，而且其編碼的蛋白為細(xì)胞膜上的受體蛋白，以該蛋白 作為標(biāo)記物可以用于鑒定、篩選或分選胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞及新生的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞，對 研究各發(fā)育階段的胰腺相關(guān)細(xì)胞具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0035] 圖1為人多能干細(xì)胞定向分化產(chǎn)生胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞。（a)人多能干細(xì)胞向胰腺 beta細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化示意圖；(b)免疫熒光染色檢測分化第四階段末胰腺內(nèi)胚層相關(guān)蛋 白及標(biāo)記NGN3基因的綠色熒光蛋白（EGFP)的表達(dá)的染色圖。
[0036] 圖2為流式分析法鑒定胰腺內(nèi)胚層中的NGN3-EGFP+細(xì)胞為胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞 或新生的內(nèi)分泌細(xì)胞的結(jié)果圖。（a)流式分析法檢測胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞中NGN3-EGFP及NGN3， NKX2. 2, NEUR0D1，CHR0M0GRANIN A(CHGA)等胰腺內(nèi)分泌相關(guān)蛋白的表達(dá)；(b)流式分析法 檢測胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞中NGN3-EGFP與胰腺前體細(xì)胞標(biāo)記蛋白Η)Χ1的表達(dá)，表明NGN3-EGFP+ 細(xì)胞低表達(dá)或不表達(dá)胰腺前體相關(guān)蛋白roxi。
[0037] 圖3為mRNA測序分析分選獲得的NGN3-EGFP+細(xì)胞、NGN3-EGFP-細(xì)胞中胰腺相關(guān) 基因的表達(dá)情況，表明NGN3-EGFP+的胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞及新生的內(nèi)分泌細(xì)胞群相對富 集膜腺內(nèi)分泌相關(guān)基因的表達(dá)。
[0038] 圖4為免疫有關(guān)染色檢測SUSD2和NGN3-EGFP的共染情況，說明SUSD2可以用來 標(biāo)記人多能干細(xì)胞分化來源的NGN3-EGFP+細(xì)胞。
[0039] 圖5為流式分析檢測人多能干細(xì)胞來源的胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞中SUSD2及胰腺發(fā)育 相關(guān)蛋白的表達(dá)情況分析圖，說明SUSD2可用于標(biāo)記體外分化得到的胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞 及新生的內(nèi)分泌細(xì)胞。（a)流式分析檢測胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞中SUSD2及胰腺內(nèi)分泌相關(guān)蛋白 NGN3，NKX2. 2，NEUR0D1，CHR0M0GRANIN A(CHGA)等的表達(dá)情況；(b)流式分析檢測胰腺內(nèi)胚 層細(xì)胞中SUSD2與胰腺前體細(xì)胞相關(guān)蛋白roxi的表達(dá)。
[0040] 圖6為RT-QPCR鑒定流式分選獲得的SUSD2+細(xì)胞，SUSD2-細(xì)胞及未分選的胰腺 內(nèi)胚層細(xì)胞中胰腺發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)情況，表明SUSD2+細(xì)胞相對富集胰腺內(nèi)分泌前體 細(xì)胞相關(guān)基因及胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，相對低表達(dá)胰腺前體細(xì)胞相關(guān)基因的表 達(dá)，證明SUSD2標(biāo)記的是胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞和/或新生的內(nèi)分泌細(xì)胞。
[0041] 圖7為SUSD2抗體用于磁珠分選來富集胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞及新生的胰腺內(nèi)分 泌細(xì)胞。（a)流式分析檢測用SUSD2抗體對體外分化獲得的胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞進(jìn)行磁珠分選 所富集的SUSD2+細(xì)胞、SUSD2-細(xì)胞中胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞及胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的標(biāo)記蛋白 NKX2. 2的表達(dá)，說明SUSD2抗體用于磁珠分選能夠高效富集NKX2. 2+胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞 及新生的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞。（b)對磁珠分選獲得的SUSD2+細(xì)胞、SUSD2-細(xì)胞及未分選的胰 腺內(nèi)胚層細(xì)胞進(jìn)行延長培養(yǎng)后，免疫組化檢測胰腺前體及胰腺內(nèi)分泌相關(guān)蛋白的表達(dá)，表 明SUSD2+細(xì)胞能夠大量產(chǎn)生內(nèi)分泌細(xì)胞，證明其為內(nèi)分泌前體細(xì)胞或新生的內(nèi)分泌細(xì)胞； (c)將磁珠分選獲得的SUSD2+細(xì)胞、SUSD2-細(xì)胞移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，19周后對移植 物免疫熒光染色，檢測胰腺內(nèi)分泌相關(guān)蛋白的表達(dá)，表明SUSD2+細(xì)胞能夠產(chǎn)生多種類型的 胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞，而SUSD2-細(xì)胞主要產(chǎn)生導(dǎo)管樣細(xì)胞，證明SUSD2富集的是胰腺內(nèi)分泌前 體細(xì)胞或新生的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞。
[0042] 圖8為SUSD2能夠用于標(biāo)記人胚胎來源的胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞及新生的胰腺內(nèi)分 泌細(xì)胞。（a)免疫組化檢測胚胎胰腺組織及成體胰腺組織中SUSD2與胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞 相關(guān)蛋白、胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞相關(guān)蛋白的共表達(dá)，表明SUSD2僅在胚胎胰腺組織中的胰腺內(nèi) 分泌前體或內(nèi)分泌細(xì)胞中表達(dá)。（b)免疫熒光檢測胚胎胰腺組織中SUSD2與胰腺內(nèi)分泌相 關(guān)蛋白及胰腺導(dǎo)管相關(guān)蛋白的表達(dá)。
[0043] 圖9為SUSD2能夠用于富集人胚胎來源的胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞及新生的胰腺內(nèi)分 泌細(xì)胞。

【具體實施方式】
[0044] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所 用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。SUSD2基因如序列2所示，編碼的 蛋白的氨基酸序列為序列1。
[0045] 實施例1、SUSD2作為胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞標(biāo)記基因的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用
[0046] -、SUSD2作為修飾過人多能干細(xì)胞分化得到的胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞標(biāo)記基因
[0047] 1. 1、胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞的獲得
[0048] 將 EGFP 基因（NC_013179. 1 (3313. .4126))通過同源重組（Ngn3 contig編號：ΝΤ_030059· 13,位于Chromosome 10，左側(cè)同源臂在基因組中的位 置：71325654-71332154 ;右側(cè)同源臂在基因組中的位置：71332158-71467568)離體的人多 能干細(xì)胞系Hl (WiCell Research Institute，NIH編號為WA01)，得到修飾后細(xì)胞的人多能 干細(xì)胞系NGN3-EGFP。將其按15% -20%接種到細(xì)胞培養(yǎng)液I，培養(yǎng)1天；再直接換用細(xì)胞 培養(yǎng)液Π ，培養(yǎng)1-2天；再直接換用細(xì)胞培養(yǎng)液III，培養(yǎng)1天；繼續(xù)直接換用細(xì)胞培養(yǎng)液 IV，培養(yǎng)2天；直接換用細(xì)胞培養(yǎng)液V，培養(yǎng)1天；直接換用細(xì)胞培養(yǎng)液VI，培養(yǎng)3天；直接 換用細(xì)胞培養(yǎng)液VII，培養(yǎng)4天；直接換用細(xì)胞培養(yǎng)液VIII，培養(yǎng)4-6天；直接換用細(xì)胞培養(yǎng) 液IX，培養(yǎng)4-6天，得到胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞。
[0049] 通過免疫熒光抗體法檢測該階段細(xì)胞群體中胰腺內(nèi)胚層相關(guān)的多個標(biāo)識轉(zhuǎn)錄因 子的表達(dá)情況。
[0050] 檢測NKX2. 2的抗體是鼠來源的單抗（該抗體購自DSHB，產(chǎn)品目錄號為74. 5A5); 檢測roxi的是山羊來源的多抗（該抗體購自R&D Systems，產(chǎn)品目錄號為AF2419);檢測 EGFP的是雞來源的多抗（該抗體購自Abeam，產(chǎn)品目錄號為AB13970);檢測NGN3的抗體是 綿羊來源的多抗（該抗體購自R&D System，產(chǎn)品目錄號為AF3444)。
[0051] 所有抗體均為非直標(biāo)抗體，檢測中分別用Jackson ImmunoResearch公司購來的抗 體復(fù)染=Alexa Fluor 488標(biāo)記的驢來源的抗山羊的多抗（產(chǎn)品目錄號為705-545-147); Cyanine Cy3標(biāo)記的驢來源的抗山羊的多抗（產(chǎn)品目錄號為705-165-147) ;Cyanine Cy3標(biāo) 記的驢來源的抗綿羊的多抗（產(chǎn)品目錄號為715-165-147) Alexa Fluor 488標(biāo)記的驢來源 的抗小鼠的多抗（產(chǎn)品目錄號為715-545-151) ;Cyanine Cy3標(biāo)記的驢來源的抗小鼠的多 抗（產(chǎn)品目錄號為715-165-151) ;Alexa Fluor 488標(biāo)記的驢來源的抗雞的多抗（產(chǎn)品目 錄號為 703-545-155)。
[0052] 結(jié)果如圖1所示，該階段獲得的細(xì)胞中，部分細(xì)胞表達(dá)roxi這一胰腺前體的標(biāo)記 蛋白（圖1(b)中的A);另一部分細(xì)胞表達(dá)NGN3-EGFP，兩者幾乎不共染（圖1(b)中的B); NGN3-EGFP+細(xì)胞表達(dá)胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞標(biāo)識轉(zhuǎn)錄因子NGN3或者早期階段內(nèi)分泌細(xì)胞相 關(guān)蛋白NKX2. 2、CHR0M0GRANIN A(CHGA)等（圖1(b)中的C和D);說明獲得的細(xì)胞為胰腺 內(nèi)胚層階段的細(xì)胞，其中存在NGN3-EGFP標(biāo)記的胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞或者新生的內(nèi)分泌細(xì) 胞。
[0053] 上述采用的培養(yǎng)液配方如下：
[0054] 細(xì)胞培養(yǎng)液I按照如下方法配制得到：將Essential 8培養(yǎng)基、和Y27632混合，得 到細(xì)胞培養(yǎng)液I，其中Essential 8培養(yǎng)基和Y27632的配比為Iml :10 μ mol。
[0055] 細(xì)胞培養(yǎng)液II為Essential 8培養(yǎng)基。
[0056] 細(xì)胞培養(yǎng)液III按照如下方法配制得到：將DMEM/F12培養(yǎng)基，BSA，rmWnt3A和 ActivinA混合，得到細(xì)胞培養(yǎng)液III，其中DMEM/F12培養(yǎng)基，BSA，rmWnt3A和ActivinA的 配比為：1ml :0· Ig :25ng :120ng。
[0057] 細(xì)胞培養(yǎng)液IV按照如下方法配制得到：將DMEM/F12培養(yǎng)基，BSA和ActivinA 混合，得到細(xì)胞培養(yǎng)液IV，其中DMEM/F12培養(yǎng)基，BSA和ActivinA的配比為：1ml :0. Ig : 120ng〇
[0058] 細(xì)胞培養(yǎng)液V按照如下方法配制得到：將DMEM/F12培養(yǎng)基，BSA，ActivinA和 Wnt-C59混合，得到細(xì)胞培養(yǎng)液V，其中DMEM/F12培養(yǎng)基，BSA，ActivinA和Wnt-C59的配比 為：1ml :0· Ig :120ng :50nmol〇
[0059] 細(xì)胞培養(yǎng)液VI按照如下方法配制得到：將DMEM/F12培養(yǎng)基，B27 supplement without VitaminA，KGF和SB525334混合，得到細(xì)胞培養(yǎng)液VI，其中DMEM/F12培養(yǎng)基，B27 supplement without VitaminA，KGF 和 SB525334 的配比為：1ml :10 μ I :50ng:l μ mol。
[0060] 細(xì)胞培養(yǎng)液VII按照如下方法配制得到：將DMEM-H培養(yǎng)基，B27 suppIement， all-trans retinoic acid，NOGGIN和 SANT-I 混合，得到細(xì)胞培養(yǎng)液 VII，其中 DMEM-H培養(yǎng) 基，B27 supplement，all-trans retinoic acid，NOGGIN和 SANT-1 的配比為：1ml :10μ 1 : 2 μ mol :250ng :0·25 μ mol〇
[0061] 細(xì)胞培養(yǎng)液VIII按照如下方法配制得到：將DMEM-H培養(yǎng)基，B27 supplement without VitaminA，NOGGIN 和 TPB((2S，5S)-(E，E)-8-(5-(4-(trifluoromethyl) phenyl)_2, 4_pentadienoylamino)benzolactam)混合，得到細(xì)胞培養(yǎng)液 VIII，其中 DMEM-H 培養(yǎng)基，B27 supplement without VitaminA，NOGGIN 和 TPB 的配比為：1ml : 10 μ I :250ng : 50nmol〇
[0062] 細(xì)胞培養(yǎng)液IX按照如下方法配制得到：將DMEM-H培養(yǎng)基，Β27 suppIement without VitaminA，N0GGIN，human LIF和 Alk5 inhibitor II 混合，得到細(xì)胞培養(yǎng)液VIII, 其中 DMEM-H 培養(yǎng)基，B27 supplement without VitaminA，NOGGIN 和 TPB 的配比為：1ml : 10 μ I :250ng : IOng : 1 μ mol。
[0063] 1. 2、流式分析鑒定NGN3-EGFP+細(xì)胞是否為胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞或新生的內(nèi)分泌 細(xì)胞
[0064] 將上述得到的胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞用BD FACS Aria IIu進(jìn)行流式分析，得到 NGN3-EGFP+(含有胰腺內(nèi)分泌前體來源的細(xì)胞群體）、NGN3-EGFP-(不含有胰腺內(nèi)分泌前體 來源的細(xì)胞群體）兩群細(xì)胞，EGFP為FLl通道。
[0065] 通過胞內(nèi)流式分析檢測NGN3-EGFP+和NGN3-EGFP-群體中是否含有胰腺內(nèi)分泌前 體細(xì)胞的多個標(biāo)識轉(zhuǎn)錄因子或分泌蛋白。
[0066] 檢測NKX2. 2的抗體是鼠來源的單抗（該抗體購自DSHB，產(chǎn)品目錄號為74. 5A5); 檢測NGN3的抗體是綿羊來源的多抗（該抗體購自R&D Systems，產(chǎn)品目錄號為AF3444)和 小鼠來源的單抗（該抗體購自DSHB，產(chǎn)品目錄號為F25A1B3);檢測NEUR0D1的是山羊來源 的多抗（該抗體購自R&D Systems，產(chǎn)品目錄號為AF2746);檢測Η)Χ1的是山羊來源的多抗 (該抗體購自R&D Systems，產(chǎn)品目錄號為AF2419);檢測CHR0M0GRANIN A的是兔來源的多 抗（該抗體購自中杉金橋，產(chǎn)品目錄號為ZA-0507)。
[0067] 所有抗體均為非直標(biāo)抗體，檢測中分別用Jackson ImmunoResearch公司購來的抗 體復(fù)染。Alexa Fluor 488標(biāo)記的驢來源的抗山羊的多抗（產(chǎn)品目錄號為705-545-147); Alexa Fluor 488標(biāo)記的驢來源的抗小鼠的多抗（產(chǎn)品目錄號為715-545-151)，Alexa Fluor 647標(biāo)記的驢來源的抗小鼠的多抗（產(chǎn)品目錄號為715-605-151) ;Alexa Fluor488 標(biāo)記的山羊來源的抗小鼠抗原亞型1的多抗（產(chǎn)品目錄號為115-545-205)，Alexa Fluor 647標(biāo)記的山羊來源的抗小鼠的多抗（產(chǎn)品目錄號為115-605-205) ;Alexa Fluor488標(biāo)記 的山羊來源的抗小鼠抗原亞型2b的多抗（產(chǎn)品目錄號為115-545-207)，Alexa Fluor 647 標(biāo)記的山羊來源的抗小鼠抗原亞型2b的多抗（產(chǎn)品目錄號為115-605-207) ;Alexa Fluor 488標(biāo)記的驢來源的抗兔的多抗（產(chǎn)品目錄號為711-545-152)。
[0068] 結(jié)果如圖2所示，NGN3-EGFP+(含有胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞或新生的內(nèi)分泌細(xì)胞）群 體中有NKX2. 2、NGN3、CHR0M0GRANIN A(CHGA)的表達(dá)，而不表達(dá)或低表達(dá)胰腺前體相關(guān)基因 PDXl，表明該細(xì)胞群的確主要為胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞或新生的內(nèi)分泌細(xì)胞。
[0069] NGN3-EGFP-群體中無 NKX2. 2、CHR0M0GRANIN A (CHGA)、GFP 的表達(dá)，主要高表達(dá)胰 腺前體相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子roXl，有極少部分細(xì)胞表達(dá)NGN3或NEUR0D1，表明該細(xì)胞群主要為胰 腺前體細(xì)胞或非胰腺細(xì)胞類型細(xì)胞。
[0070] L 3、NGN3-EGFP+細(xì)胞群富集SUSD2的表達(dá)
[0071] I) RNA測序顯示SUSD2在NGN3-EGFP+細(xì)胞群里富集表達(dá)
[0072] 用 QIAGEN 的 RNeay Plus Mini Kit 對上述 2 獲得的 NGN3-EGFP+ 細(xì)胞以及 NGN3-EGFP-細(xì)胞進(jìn)行提取，各獲得2 μ g的總mRNA。將得到的mRNA純化后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到 單鏈cDNA。用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase)對得 到的單鏈cDNA的3'端加上poly A尾巴。將cDNA擴增12個PCR循環(huán)之后，用Illumina Paired-End DNA Sample Prep Kit進(jìn)行cDNA文庫的構(gòu)建。然后用 Illumina Hiseq2000對其 進(jìn)行測序。用Tophat軟件將測序結(jié)果（raw reads)和人參考基因組（the human reference genome，NCBI Build 37, hgl9)進(jìn)行比對，通過將配對序列（Mapping reads)和 NCBI 的參 考數(shù)據(jù)庫（RefSeq Genes hgl9)進(jìn)行正向或反向匹配后重建轉(zhuǎn)錄組。通過計算所有基因 的表達(dá)豐度，并將其用RPKM進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化以后，下列標(biāo)準(zhǔn)來判斷一個基因在NGN3-EGFP+與 NGN3-EGFP-細(xì)胞之間差異表達(dá)的顯著性：1)表達(dá)倍比關(guān)系（fold change)大于2或小于 0. 5 ;2)P值小于0. 05。采用R軟件的熱圖軟件包（heatmap package)對獲得的數(shù)據(jù)基于 RPKM采用IoglO進(jìn)行熱圖分析。利用差異基因表達(dá)（Differential Gene Expression, DGE) 進(jìn)行GO分析。
[0073] 結(jié)果如圖3所示，相較于NGN3-EGFP-細(xì)胞，NGN3-EGFP+細(xì)胞富集表達(dá)胰腺內(nèi)分泌 相關(guān)基因 NGN3、NEUR0D1、NKX2. 2、PAX4、ARX等，低表達(dá)胰腺前體細(xì)胞相關(guān)基因 H)X1、HNF1B、 HNF6等，說明分選獲得的NGN3-EGFP+細(xì)胞是胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞及新生的內(nèi)分泌細(xì)胞。
[0074] NGN3-EGFP+細(xì)胞富集表達(dá)SUSD2(NR02212)，表達(dá)倍比關(guān)系是2. 30,說明從mRNA水 平上，SUSD2基因（序列2)可以作為鑒定待測細(xì)胞是否為胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞或新生的胰 腺內(nèi)分泌細(xì)胞的標(biāo)志。下一步鑒定SUSD2基因表達(dá)的蛋白是否也是同樣的情況。
[0075] 2)免疫熒光抗體法驗證SUSD2能夠標(biāo)記NGN3-EGFP+細(xì)胞群
[0076] 對上述2獲得的NGN3-EGFP+細(xì)胞以及NGN3-EGFP-細(xì)胞用免疫熒光抗體法檢測 EGFP和SUSD2的表達(dá)。
[0077] 檢測EGFP的是雞來源的多抗（該抗體購自Abeam，產(chǎn)品目錄號為AB13970);檢測 SUSD2的是鼠來源的單抗（該抗體購自BioLegend，產(chǎn)品目錄號為327401)。
[0078] 所有抗體均為非直標(biāo)抗體，檢測中分別用Jackson ImmunoResearch公司購來的抗 體復(fù)染。Cyanine Cy3標(biāo)記的驢來源的抗小鼠的多抗（產(chǎn)品目錄號為715-165-151) ;Alexa Fluor 488標(biāo)記的驢來源的抗雞的多抗（產(chǎn)品目錄號為703-545-155)。
[0079] 結(jié)果如圖4所示，免疫組化結(jié)果顯示，SUSD2的表達(dá)與NGN3-EGFP完全吻合，且在 NGN3-EGFP-細(xì)胞中不表達(dá)，即在NGN3-EGFP+細(xì)胞中富集表達(dá)；說明SUSD2可以用來鑒定或 標(biāo)記NGN3-EGFP+細(xì)胞，即胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞或新生的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞所組成的混合細(xì) 胞群。
[0080] 二、SUSD2作為人多能干細(xì)胞分化得到的胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞標(biāo)記基因
[0081] 2. 1、胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞的獲得
[0082] 將離體的人多能干細(xì)胞系NGN3-EGFP按照I. 1的方法，分化得到胰腺內(nèi)胚層細(xì) 胞；
[0083] 2. 2、流式分析檢測SUSD2基因的表達(dá)及胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞標(biāo)記基因 NKX2. 2、 NEUROD1的表達(dá)
[0084] 將上述2. 1得到的胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞通過流式分析法檢測SUSD2基因編碼蛋白的表 達(dá)，按照BD Biosciences購來的細(xì)胞固定/通透試劑盒（產(chǎn)品目錄號為554714)進(jìn)行，將上 述2. 1得到的胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞固定后使用對應(yīng)抗體和SUSD2直標(biāo)抗體（小鼠來源的PE標(biāo)記 的抗SUSD2的單抗（購自BioLegend，產(chǎn)品目錄號為327406);以及小鼠來源的APC標(biāo)記單 抗（購自BioLegend,產(chǎn)品目錄號為327408)。小鼠來源的未標(biāo)記的單抗（購自BioLegend, 產(chǎn)品目錄號為327401))染色，之后再用熒光二抗復(fù)染。用流式分選儀進(jìn)行分析。
[0085] 檢測NKX2. 2的抗體是鼠來源的單抗（該抗體購自DSHB，產(chǎn)品目錄號為74. 5A5); 檢測NGN3的抗體是綿羊來源的多抗（該抗體購自R&D Systems，產(chǎn)品目錄號為AF3444)和 小鼠來源的單抗（該抗體購自DSHB，產(chǎn)品目錄號為F25A1B3);檢測NEUR0D1的是山羊來源 的多抗（該抗體購自R&D Systems，產(chǎn)品目錄號為AF2746);檢測Η)Χ1的是山羊來源的多抗 (該抗體購自R&D Systems，產(chǎn)品目錄號為AF2419);檢測CHR0M0GRANIN A的是兔來源的多 抗（該抗體購自中杉金橋，產(chǎn)品目錄號為ZA-0507)。
[0086] 二抗購自Jackson ImmunoResearch :Alexa Fluor 488標(biāo)記的驢來源的抗山羊的 多抗（產(chǎn)品目錄號為705-545-147) ;Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊來源的抗小鼠抗原亞型 2b的多抗（產(chǎn)品目錄號為115-545-207)，Alexa Fluor 647標(biāo)記的山羊來源的抗小鼠抗原 亞型2b的多抗（產(chǎn)品目錄號為115-605-207) ;Alexa Fluor 488標(biāo)記的驢來源的抗兔的多 抗（產(chǎn)品目錄號為711-545-152) ;Alexa Fluor 488標(biāo)記的驢來源的抗雞的多抗（產(chǎn)品目 錄號為 703-545-155)。
[0087] 結(jié)果圖如圖5所示，在第四階段第0天的時候，NGN3陽性或弱陽性的細(xì)胞并不表達(dá) SUSD2或NEUR0D1，弱表達(dá)NKX2. 2。在第四階段第1天，分別有80%、93% and88%的SUSD2+ 細(xì)胞表達(dá)NGN3，NKX2. 2和NEUR0D1。這表明絕大部分SUSD2+細(xì)胞同時表達(dá)NGN3、NKX2. 2和 NEUROD1，說明這一群SUSD2+細(xì)胞具有內(nèi)分泌前體細(xì)胞特征。在第四階段第4天的時候，大 部分SUSD2+細(xì)胞表達(dá)NKX2. 2或CHR0M0GRANIN A(CHGA)，并不表達(dá)NGN3,說明在該時期這 群SUSD2+/NGN3-的細(xì)胞具有內(nèi)分泌細(xì)胞的特征。此外，SUSD2+細(xì)胞持續(xù)低表達(dá)或不表達(dá)胰 腺前體的標(biāo)記Η)Χ1。說明SUSD2可以用來標(biāo)記胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞及其子代內(nèi)分泌細(xì)胞。
[0088] 在整個分化過程中，盡管存在部分SUSD2-細(xì)胞表達(dá)胰腺內(nèi)分泌相關(guān)蛋白NGN3、 NKX2. 2等，絕大部分SUSD2-細(xì)胞不表達(dá)這些胰腺內(nèi)分泌相關(guān)蛋白，而表達(dá)胰腺前體相關(guān)蛋 白PDX1，說明SUSD2-細(xì)胞主要包含胰腺前體細(xì)胞或非胰腺細(xì)胞類型細(xì)胞（圖5)。
[0089] 上述結(jié)果表明，SUSD2+細(xì)胞為胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞或新生的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞，進(jìn) 一步證明，SUSD2基因編碼蛋白的表達(dá)可以鑒定細(xì)胞是否為目的細(xì)胞。
[0090] 2. 3、SUSD2+細(xì)胞的mRNA水平上檢測用流式分選獲得了 SUSD2-細(xì)胞和SUSD2+細(xì) 胞，用定量PCR技術(shù)分析了這兩群細(xì)胞及未分選的胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞的基因表達(dá)情況。采用 Power SYBR? Master Mix試劑盒進(jìn)行定量PCR(購自Life Technologies,產(chǎn)品目錄號為 4367659)，擴增引物見表1，內(nèi)參引物為GAPDH，具體操作參見說明書。
[0091] 表1為擴增引物
[0092]

【權(quán)利要求】
1. 一種分選或輔助分選待測細(xì)胞群體中的胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞或新生的胰腺內(nèi)分泌 細(xì)胞的方法，包括如下步驟：檢測待測細(xì)胞群體中的細(xì)胞是否表達(dá)SUSD2基因，若某些細(xì)胞 表達(dá)SUSD2基因，則某些細(xì)胞為或候選為胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞或新生的內(nèi)分泌細(xì)胞；若某 些細(xì)胞不表達(dá)SUSD2基因，則某些細(xì)胞不為或候選不為胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞或新生的內(nèi)分 泌細(xì)胞； 所述SUSD2基因的核苷酸序列為序列表中序列2。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述檢測待測細(xì)胞群體中的細(xì)胞是否表 達(dá)SUSD2基因是通過檢測待測細(xì)胞群體中的細(xì)胞是否含有SUSD2基因表達(dá)的蛋白，所述檢 測待測細(xì)胞群體中的細(xì)胞是否含有SUSD2基因表達(dá)的蛋白的方法為如下1)或2)或3): 1) 免疫熒光抗體法檢測，采用抗體為抗SUSD2單抗； 2) 流式分析檢測，采用抗體為抗SUSD2單抗； 3) 磁珠分選，采用抗體為抗SUSD2單抗。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述待測細(xì)胞為胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞為人源胰 腺內(nèi)胚層細(xì)胞。 5. SUSD2蛋白或其編碼基因或編碼所述SUSD2蛋白的前體蛋白的mRNA作為標(biāo)記物在鑒 定、篩選或分選胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞和/或新生的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞中的應(yīng)用； 所述SUSD2蛋白的氨基酸序列為序列表中序列1所示； 所述SUSD2蛋白編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列2所示。
6. 能夠與所述SUSD2蛋白特異性結(jié)合的抗體在制備鑒定、篩選或分選胰腺內(nèi)分泌前體 細(xì)胞和/或新生的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞試劑中的應(yīng)用。
7. 如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于：所述抗體攜帶熒光標(biāo)記；所述抗體為單抗。
8. 如權(quán)利要求6或7所述的應(yīng)用，其特征在于：所述應(yīng)用為從胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞中篩選 或分選胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞和/或新生的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞； 所述篩選或分選的方法為免疫磁珠分離法及流式細(xì)胞分選法； 所述鑒定的方法為免疫熒光抗體法及流式細(xì)胞分析法。
9. 能夠與編碼所述SUSD2蛋白的前體蛋白的mRNA特異性結(jié)合的引物對、探針或它們的 互補鏈在制備鑒定胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞和/或新生的內(nèi)分泌細(xì)胞試劑中的應(yīng)用。
10. 如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述引物對由序列表中序列3所示的單鏈 DNA分子和序列表中序列4所不的單鏈DNA分子組成。
【文檔編號】C12Q1/68GK104215768SQ201410386506
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年8月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月7日
【發(fā)明者】鄧宏魁, 劉海松, 朱迪聰, 楊歡, 梁振 申請人:北京大學(xué), 北京大學(xué)深圳研究生院, 北京瑞普晨創(chuàng)科技有限公司