一種snp分子標(biāo)記及hrm法進行豬肉dna溯源法
【專利摘要】本發(fā)明屬于食品【技術(shù)領(lǐng)域】，提供豬肉DNA溯源的SNPs分子標(biāo)記，同時提供利用HRM法進行豬肉DNA溯源的方法。本發(fā)明提供了10個SNP分子標(biāo)記，彼此間相互獨立，基因雜合度均至少是0.4，適合作為豬肉溯源的SNPs分子標(biāo)記。本發(fā)明通過HRM法即高分辨率熔解曲線分析方法獲得10個SNP分子標(biāo)記，再由所獲得的有效SNPs位點組成一個豬肉的SNPs信息組，進而進行豬肉DNA溯源。本發(fā)明基于SNPs分子標(biāo)記采用的HRM法進行豬肉DNA溯源具有簡單、快捷、低成本的特點，10個SNPs分子標(biāo)記穩(wěn)定廣泛的存在于豬基因組DNA中，有助于DNA溯源技術(shù)的大規(guī)模推廣。
【專利說明】-種SNP分子標(biāo)記及HRM法進行豬肉DNA溯源法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及豬肉DNA溯源的SNP分子標(biāo)記即單核苷酸多態(tài)性 標(biāo)記，具體涉及利用HRM法即高分辨率熔解曲線分析方法進行豬肉DNA溯源的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著人們生活水平的提高，食品的安全性越來越受到人們的關(guān)注。肉制品作為人 類食物中蛋白質(zhì)的主要來源，其安全性自然也備受關(guān)注，溯源技術(shù)越來越成為肉品安全保 障和監(jiān)管的重要手段。
[0003] 肉類食品溯源的技術(shù)方法有很多，如標(biāo)簽溯源技術(shù)、虹膜溯源技術(shù)和DNA溯源技 術(shù)等。與其他溯源技術(shù)相比，DNA溯源技術(shù)具有易分型、便于規(guī)?；詣踊瘷z測等優(yōu)點。它 不僅可以對活體動物進行溯源，還可以對胴體分割后的每一塊肉，甚至是經(jīng)過加工后的熟 肉進行溯源，能夠真正的做到從生產(chǎn)到餐桌的全程溯源?？梢源蟠髲娀块T的肉品質(zhì) 量安全監(jiān)管，提供有用的信息處理食品安全應(yīng)急事件，將有助于社會的穩(wěn)定。
[0004] DNA溯源技術(shù)的產(chǎn)生源于DNA的遺傳與變異。它是通過分析特定的DNA分子標(biāo)記， 獲得動物個體的DNA指紋圖譜從而達到鑒別個體、品種或是物種的目的。本研究選取了第 三代分子標(biāo)記--SNPs標(biāo)記（單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記）。目前，國內(nèi)外相關(guān)的研究中，對于 SNPs標(biāo)記的檢測，主要采用兩種方法，RFLP-PCR法和TaqMan探針法。但是RFLP-PCR法檢 測時間長，TaqMan探針法檢測費用高的缺點，這成為了 DNA溯源技術(shù)廣泛應(yīng)用的一個障礙。 因此，若能找到一種簡單、快捷、低成本的檢測方法，來代替這兩種檢測方法，將有助于DNA 溯源技術(shù)的大規(guī)模推廣。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中，豬肉DNA溯源方法操作復(fù)雜，檢測周期長，成 本高等問題，通過HRM法即高分辨率熔解曲線分析方法檢測取自豬肉的SNPs分子標(biāo)記，達 到快速準(zhǔn)確檢測豬肉來源的目的。
[0006] 本發(fā)明的目的通過以下方法獲得
[0007] 本發(fā)明提供一種用于豬肉DNA溯源的SNP分子標(biāo)記，分別為：
[0008] SNP1 :序列如SEQ ID NO. 1所示，等位基因突變位點為：A/G ;
[0009] SNP2 :序列如SEQ ID N0. 2所示，等位基因突變位點為：C/T ;
[0010] SNP3 :序列如SEQ ID N0. 3所示，等位基因突變位點為：C/G ;
[0011] SNP4 :序列如SEQ ID N0. 4所示，等位基因突變位點為：A/G
[0012] SNP5 :序列如SEQ ID N0. 5所示，等位基因突變位點為：C/T
[0013] SNP6 :序列如SEQ ID N0. 6所示，等位基因突變位點為：A/G
[0014] SNP7 :序列如SEQ ID N0. 7所示，等位基因突變位點為：A/G
[0015] SNP8 :序列如SEQ ID N0. 8所示，等位基因突變位點為：A/G
[0016] SNP9 :序列如SEQ ID N0. 9所示，等位基因突變位點為：A/G
[0017] SNP10 :序列如SEQ ID NO. 10所示，等位基因突變位點為：A/G
[0018] 序列表中的η分別代表各個分子標(biāo)記的突變位點。
[0019] 本發(fā)明還提供一種利用HRM法進行豬肉DNA溯源的方法，包括如下步驟：
[0020] 1)從已發(fā)表文獻或NCBI中選取SNPs位點，其中，SNPs位點應(yīng)滿足以下要求：Α.任 意相鄰的SNP間的距離> 1Mb，保證SNPs間相互獨立，不存在連鎖現(xiàn)象；Β.任意SNP位點與 其他SNP位點不存在任何關(guān)聯(lián)；3) SNP側(cè)翼序列不存在任何變異；
[0021 ] 2)取豬肉、豬血或豬毛發(fā)樣品彡299個，提取其DNA ;
[0022] 3)根據(jù)選取的SNPs位點，設(shè)計引物，利用HRM法對每個樣品進行SNPs位點基因型 分析；計算出每個單核苷酸多態(tài)性SNP的等位基因頻率及雜合度；
[0023] 4)記錄每一樣品的SNPs位點信息；
[0024] 5)后期，選擇的步驟2)中的豬有問題，將有問題的豬肉按照步驟2)到4)的方法， 對作為DNA溯源的SNPs位點進行檢測；
[0025] 6)將步驟5)得到的SNPs位點信息與步驟4)中記錄的信息進行對比；
[0026] 7)根據(jù)溯源標(biāo)記的SNPs的特征信息追溯豬肉來源。
[0027] 其中，步驟 1)中選擇的文獻為 Rohrer G A, Freking B A, Nonneman D. Single nucleotide polymorphisms for pig identification and parentage exclusion[J]. Animal Genetics, 2007, 38(3):253-258.
[0028] SNPs位點均為豬DNA基因組中的突變位點；豬肉、豬血或者豬毛的樣品均取自不 同豬體，即每頭豬身上要么取豬肉要么取豬血要么取豬毛發(fā)，豬樣品均取自江蘇淮安蘇食 屠宰場。當(dāng)然，本發(fā)明所用的豬肉樣品的來源并無限制，任何需要進行跟蹤溯源的豬肉都可 以作為檢測樣品，記錄其SNPs位點信息，從而對豬肉樣品進行溯源追蹤，檢測其質(zhì)量。
[0029] 利用HRM法對每個樣品進行SNPs位點基因型分析指的是利用設(shè)計好的測序引物 在實時熒光PCR擴增儀上進行熒光PCR擴增，通過獲得的熔解曲線，進行分析從而得到每個 樣品的每個SNP位點的基因型。本發(fā)明只提供10個SNP位點，即每個樣品將獲得10個SNP 位點的基因型。
[0030] 步驟6)中的SNPs位點信息指的是該豬肉樣品中，在步驟1)中選擇的10個SNP 位點上的基因型。
[0031] 3.上述2提供的利用HRM法進行豬肉DNA溯源的方法，其中，步驟3)中所用引物 分別為：
[0032] SNP1 :上游引物 snpl-f 如 SEQ ID N0. 11 所示；下游引物 snpl-r 如 SEQ ID N0. 12 所示；
[0033] SNP2 :上游引物 snp2-f 如 SEQ ID Ν0· 13 所示；下游引物 snp2-r 如 SEQ ID Ν0· 14 所示；
[0034] SNP3 :上游引物 snp3-f 如 SEQ ID Ν0· 15 所示；下游引物 snp3-r 如 SEQ ID Ν0· 16 所示；
[0035] SNP4 :上游引物 snp4-f 如 SEQ ID Ν0· 17 所示；下游引物 snp4-r 如 SEQ ID Ν0· 18 所示；
[0036] SNP5 :上游引物 snp5-f 如 SEQ ID Ν0· 19 所示；下游引物 snp5-r 如 SEQ ID Ν0· 20 所示；
[0037] SNP6 :上游引物 snp6-f 如 SEQ ID NO. 21 所示；下游引物 snp6-r 如 SEQ ID NO. 22 所示；
[0038] SNP7 :上游引物 snp7-f 如 SEQ ID NO. 23 所示；下游引物 snp7-r 如 SEQ ID NO. 24 所示；
[0039] SNP8 :上游引物 snp8-f 如 SEQ ID NO. 25 所示；下游引物 snp8-r 如 SEQ ID NO. 26 所示；
[0040] SNP9 :上游引物 snp9-f 如 SEQ ID NO. 27 所示；下游引物 snp9-r 如 SEQ ID NO. 28 所示；
[0041] SNP10 :上游引物 snpl〇-f 如 SEQ ID NO. 29 所示；下游引物 snpl〇-r 如 SEQ ID NO. 30所示。
[0042] 4.上述3提供的利用HRM法進行豬肉DNA溯源的方法，其中，步驟3)中進行SNPs 位點基因型分析時，反應(yīng)條件為：95°C熱啟動反應(yīng)lOmin ;95°C反應(yīng)10s，touchdown程序 20s，72°C反應(yīng)20s，20s末收集單個熒光，共進行40個循環(huán)；95°C反應(yīng)lmin，60°C反應(yīng)2min， 同時收集熒光信號，1個循環(huán)；60_95°C讀取熔解曲線，20次/°C。
[0043] touchdown程序又叫遞減程序。
[0044] 5.上述4提供的利用HRM法進行豬肉DNA溯源的方法，其中，步驟3)中touchdown 程序為：
[0045] SNP1 :64°C -56°C，每個循環(huán)下降 0· 5°C ;
[0046] SNP2 :65°C -56°C，每個循環(huán)下降 0· 5°C ;
[0047] SNP3 :65°C -56°C，每個循環(huán)下降 0· 5°C ;
[0048] SNP4 :64°C -54°C，每個循環(huán)下降 0· 5°C ;
[0049] SNP5 :65°C -56°C，每個循環(huán)下降 0· 5°C ;
[0050] SNP6 :64°C -54°C，每個循環(huán)下降 0· 5°C ;
[0051] SNP7 :64°C -54°C，每個循環(huán)下降 0· 5°C ;
[0052] SNP8 :62°C -52°C，每個循環(huán)下降 0· 5°C ;
[0053] SNP9 :64°C -54°C，每個循環(huán)下降 0· 5°C ;
[0054] SNP10 :62°C -52°C，每個循環(huán)下降 0· 5°C ;
[0055] 6.上述5提供的利用HRM法進行豬肉DNA溯源的方法，其中，步驟3)中計算每個 單核苷酸多態(tài)性SNP的公式為

【權(quán)利要求】
1. 一種用于豬肉DNA溯源的SNP分子標(biāo)記，其特征在于：SNP分子標(biāo)記為： SNP1 :序列如SEQ ID NO. 1所示，等位基因突變位點為：A/G ; SNP2 :序列如SEQ ID NO. 2所示，等位基因突變位點為：C/T ; SNP3 :序列如SEQ ID NO. 3所示，等位基因突變位點為：C/G ; SNP4 :序列如SEQ ID NO. 4所示，等位基因突變位點為：A/G SNP5 :序列如SEQ ID NO. 5所示，等位基因突變位點為：C/T SNP6 :序列如SEQ ID NO. 6所示，等位基因突變位點為：A/G SNP7 :序列如SEQ ID NO. 7所示，等位基因突變位點為：A/G SNP8 :序列如SEQ ID NO. 8所示，等位基因突變位點為：A/G SNP9 :序列如SEQ ID NO. 9所示，等位基因突變位點為：A/G SNP10 :序列如SEQ ID NO. 10所示，等位基因突變位點為：A/G。
2. -種利用HRM法進行豬肉DNA溯源的方法，特征在于：包括如下步驟： 1) 從已發(fā)表文獻或NCBI中選取SNPs位點，其中，SNPs位點應(yīng)滿足以下要求：A.任意 相鄰的SNP間的距離> 1Mb，保證SNPs間相互獨立，不存在連鎖現(xiàn)象；B.任意SNP位點與其 他SNP位點不存在任何關(guān)聯(lián)；C. SNP側(cè)翼序列不存在任何變異； 2) 取豬肉、豬血或豬毛發(fā)樣品彡299個，提取其DNA; 3) 根據(jù)選取的SNPs位點，設(shè)計引物，利用HRM法對每個樣品進行SNPs位點基因型分 析；計算出每個單核苷酸多態(tài)性SNP的等位基因頻率及雜合度； 4) 記錄每一樣品的SNPs位點信息； 5) 后期，選擇的步驟2)中的豬有問題，將有問題的豬肉按照步驟2)到4)的方法，對作 為DNA溯源的SNPs位點進行檢測； 6) 將步驟5)得到的SNPs位點信息與步驟4)中記錄的信息進行對比； 7) 根據(jù)溯源標(biāo)記的SNPs的特征信息追溯豬肉來源。
3. 權(quán)利要求2所述的利用HRM法進行豬肉DNA溯源的方法，特征在于：步驟3)中所用 引物分別為： SNP1 :上游引物snpl-f如SEQ ID NO. 11所示；下游引物snpl-r如SEQ ID NO. 12所 示； SNP2:上游引物snp2-f如SEQ ID NO. 13所示；下游引物snp2-r如SEQ ID NO. 14所 示； SNP3:上游引物snp3-f如SEQ ID NO. 15所示；下游引物snp3-r如SEQ ID NO. 16所 示； SNP4:上游引物snp4-f如SEQ ID NO. 17所示；下游引物snp4-r如SEQ ID NO. 18所 示； SNP5:上游引物snp5-f如SEQIDN(λl9所示；下游引物snp5-r如SEQIDN(λ20所 示； SNP6:上游引物snp6-f如SEQIDN0·21所示；下游引物snp6-r如SEQIDN0·22所 示； SNP7:上游引物snp7-f如SEQ ID NO. 23所示；下游引物snp7-r如SEQ ID NO. 24所 示； SNP8:上游引物snp8-f如SEQ ID NO. 25所示；下游引物snp8-r如SEQ ID NO. 26所 示； SNP9:上游引物snp9-f如SEQ ID NO. 27所示；下游引物snp9-r如SEQ ID NO. 28所 示； SNP10 :上游引物 snpl〇-f 如 SEQ ID NO. 29 所示；下游引物 snpl〇-r 如 SEQ ID NO. 30 所示。
4. 權(quán)利要求3所述的利用HRM法進行豬肉DNA溯源的方法，特征在于：步驟3)中進 行SNPs位點基因型分析時，反應(yīng)條件為：95°C熱啟動反應(yīng)lOmin ;95°C反應(yīng)10s，touchdown 程序20s，72°C反應(yīng)20s，20s末收集單個熒光，共進行40個循環(huán)；95°C反應(yīng)lmin，60°C反應(yīng) 2min，同時收集熒光信號，1個循環(huán)；60-95°C讀取熔解曲線，20次/°C。
5. 權(quán)利要求4所述的利用HRM法進行豬肉DNA溯源的方法，特征在于：步驟3)中 touchdown 程序為： SNP1 :64°C -56°C，每個循環(huán)下降 0· 5°C ; SNP2 :65°C -56°C，每個循環(huán)下降 0· 5°C ; SNP3 :65°C -56°C，每個循環(huán)下降 0· 5°C ; SNP4 :64°C -54°C，每個循環(huán)下降 0· 5°C ; SNP5 :65°C -56°C，每個循環(huán)下降 0· 5°C ; SNP6 :64°C -54°C，每個循環(huán)下降 0· 5°C ; SNP7 :64°C -54°C，每個循環(huán)下降 0· 5°C ; SNP8 :62°C -52°C，每個循環(huán)下降 0· 5°C ; SNP9 :64°C -54°C，每個循環(huán)下降 0· 5°C ; SNP10 :62°C -52°C，每個循環(huán)下降 0· 5°C。
6. 權(quán)利要求5所述的利用HRM法進行豬肉DNA溯源的方法，特征在于：步驟3)中計算 11 每個單核苷酸多態(tài)性SNP的的公式為//= l-Epi2。 i=1
7. 權(quán)利要求1所述的SNP分子標(biāo)記在豬肉檢測中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/11GK104152447SQ201410390913
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月8日
【發(fā)明者】周光宏, 楊薩薩, 李春保, 徐幸蓮, 吳洽宇 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)