檢測(cè)CpG ODN序列純度的方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種使用反相柱、適宜的流動(dòng)相和洗脫程序進(jìn)行CpG?ODN純度的檢測(cè)的方法。能把CpG?ODN合成過程中缺失的一個(gè)堿基（n-1）、兩個(gè)堿基（n-2），或多了的一個(gè)堿基（n+1）、兩個(gè)堿基（n+2）與主要產(chǎn)物（n）分離開，且該方法操作自動(dòng)化，可定性定量，精密度高，重現(xiàn)性好；本發(fā)明還公開了反相層析色譜柱對(duì)CpG?ODN序列純度進(jìn)行檢測(cè)的方法在CpG?ODN序列純度檢測(cè)中的應(yīng)用。
【專利說明】檢測(cè)CpG ODN序列純度的方法及應(yīng)用
[0001] 發(fā)明所屬領(lǐng)域：
[0002] 本發(fā)明涉及一種使用HPLC進(jìn)行脫氧核苷酸純度檢測(cè)的方法，具體地說，本發(fā)明涉 及一種使用反相柱、適宜的流動(dòng)相和洗脫程序進(jìn)行CpG 0DN純度的檢測(cè)。

【背景技術(shù)】：
[0003] CpG-ODN是以非甲基化的CpG二級(jí)核苷酸為核心，具有免疫刺激作用的核苷酸序 列。早在19世紀(jì)90年代，人們就發(fā)現(xiàn)給癌癥患者注射細(xì)菌提取物能明顯減輕病情，后來(lái)研 究表明，細(xì)菌DNA具有直接的免疫刺激作用和抗腫瘤作用。通過合成的寡聚脫氧核苷酸進(jìn) 行實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌DNA的免疫刺激作用和其中的非甲基化CpG二核苷酸（CpG)有關(guān)。
[0004] CpG-ODN能促進(jìn)B細(xì)胞增殖分化并分泌IL-6,從而誘導(dǎo)抗體的分泌；激活單核細(xì) 胞，巨噬細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)病原體產(chǎn)生細(xì)胞 免疫。因此CpG-ODN作為佐劑提高疫苗免疫效力成為研究熱點(diǎn)。目前，Coley公司、Dynavax 公司、云南沃森的國(guó)內(nèi)外三家公司開展了 CpG 0DN作為乙型肝炎疫苗的佐劑進(jìn)行了研究。
[0005] CpG 0DN采用化學(xué)合成是經(jīng)硫代修飾的單鏈脫氧寡核苷酸高分子聚合物。合成過 程中工藝采用固相亞磷酰胺合成法，在DNA自動(dòng)合成儀上進(jìn)行。按照設(shè)定的堿基長(zhǎng)度和序 列，經(jīng)脫保護(hù)一偶聯(lián)一硫代一封閉的多次循環(huán)，使DNA寡核苷酸鏈得以加長(zhǎng)。合成產(chǎn)物在濃 氨水條件下去除固相支持物并脫去磷酸和堿基的保護(hù)基，得到5'端和3'端都帶羥基的硫 代寡核苷酸。
[0006] 化學(xué)合成DNA過程中可能存在"n-"，"n+"系列產(chǎn)物?；瘜W(xué)合成DNA不及活細(xì)胞內(nèi) DNA復(fù)制具有高保真性，其每次合成循環(huán)的錯(cuò)誤率約為1/100,通常缺失一個(gè)堿基（n-1)或 兩個(gè)堿基（n-2)，相反也存在著合成過程多了一個(gè)堿基（n+1)或兩個(gè)堿基（n+2)的情況。
[0007] 反相液相色譜是一種以疏水作用為基礎(chǔ)的色譜分離模式。由于它具有分辨率高、 重復(fù)性好、回收率高等優(yōu)點(diǎn)，在蛋白質(zhì)及多肽的分離分析中得到了極為廣泛的應(yīng)用。其特點(diǎn) 是固定相的極性比流動(dòng)相弱。由于RPLC固相載體的疏水性，它可以根據(jù)流動(dòng)相中被分離物 質(zhì)分子疏水性的不同而發(fā)生強(qiáng)弱不同的相互作用，從而使不同分子在反相柱中彼此分離。 疏水性較弱的樣品分子和固定相間的相互作用較弱，因此較快流出；反之，疏水性相對(duì)較強(qiáng) 的分子和固定相間存在較強(qiáng)的相互作用，在柱內(nèi)保留時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。
[0008] CpG 0DN為硫代產(chǎn)物本身隨鏈長(zhǎng)度的增加疏水差異性減小，這就使得常規(guī)反相 HPLC對(duì)這些失敗序列（相關(guān)物質(zhì)）的分析變得較為困難，在現(xiàn)有技術(shù)中，通常采用比用比色 法檢測(cè)CpG 0DN純度，如王學(xué)菊劉璟等"MTT比色法建立B型CpG 0DN活性檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)"（《細(xì) 胞與分子免疫學(xué)雜志》2008年01期，69-71)，人未甲基化寡聚脫氧核苷酸ELISA檢測(cè)試劑 盒，在中國(guó)專利CN100526876C -種未甲基化CpG二核苷酸的含量的檢測(cè)方法，公開了采用 特異甲基化酶SssI修飾CpG二核苷酸的胞嘧啶為5-甲基胞嘧啶，然后利用核酸酶P1和細(xì) 菌堿性磷酸酶將DNA水解為單個(gè)脫氧核苷，利用反相-高效液相法對(duì)修飾和未修飾的DNA 水解樣品中5-甲基胞嘧啶含量做測(cè)定，并通過修飾和未修飾的DNA水解樣品中5-甲基胞 嘧啶檢出量的差別而對(duì)CpG進(jìn)行定量，但這些方法穩(wěn)定性差，重復(fù)性低，特別是作為疫苗佐 劑使用時(shí)，要求純度高的CpG ODN，且疫苗中的CpG ODN需精確定量，因此該方法在疫苗制品 純度的檢測(cè)中存在局限性。
[0009] 目前CpG 0DN佐劑的純度檢測(cè)的另外一種方法為毛細(xì)管電泳（capi 1 lary electrophoresis, CE)檢測(cè)。該方法優(yōu)勢(shì)為成本低，操作較為簡(jiǎn)便，劣勢(shì)為重現(xiàn)性差，對(duì)PH 值要求較高，不易應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中。且其檢測(cè)主要設(shè)備之一毛細(xì)管電泳儀價(jià)格昂貴，設(shè) 備普及率低，使用該方法檢測(cè)對(duì)于中小企業(yè)或資金有限的科研院所會(huì)造成較大壓力。本發(fā) 明所述方法采用高效液湘開展反相液相色譜層析，降低了檢測(cè)初期對(duì)設(shè)備要求的成本。而 高效液湘普及率較高，一般的高校及科研院所均有配備，因此租借設(shè)備或委托檢驗(yàn)比較方 便。本發(fā)明所述方法的優(yōu)點(diǎn)在于投入資金較少的情況下仍能取得良好的檢測(cè)結(jié)果，且操作 簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性能好，易于應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中。
[0010] 發(fā)明技術(shù)內(nèi)容：
[0011] 本發(fā)明的目的是提供一種基于RPC-HPLC技術(shù)的CpG 0DN純度檢測(cè)方法，該方法能 把CpG 0DN合成過程中缺失的一個(gè)堿基（n-1)、兩個(gè)堿基（n-2)，或多了的一個(gè)堿基（n+1)、 兩個(gè)堿基（n+2)與主要產(chǎn)物（η)分離開，對(duì)CpG 0DN序列純度進(jìn)行精確檢測(cè)，彌補(bǔ)現(xiàn)有CpG 0DN序列或核酸純度檢測(cè)工作的不足。
[0012] 本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供反相層析色譜柱對(duì)CpG 0DN序列純度進(jìn)行檢測(cè)的方法 在CpG 0DN序列純度檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明公開了一種使用反相層析色譜柱對(duì)CpG 0DN序列純度進(jìn)行檢測(cè)的方法，該 方法是：
[0014] [1]·上Xbridge 0ST C18柱的反相層析色譜柱；
[0015] [2]·輸入?yún)?shù)，檢測(cè)波長(zhǎng)245nm ;流速0· 1?lml/min ;柱溫30?80°C
[0016] [3].流動(dòng)相：用A、B液兩種流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫；
[0017] [4].用A液平衡色譜柱，待基線平穩(wěn)后準(zhǔn)備上樣；
[0018] [5].上樣，取20u 1樣，注入上樣閥，將閥門扳下；
[0019] [6].進(jìn)行分離，鑒定；
[0020] [7].打印結(jié)果，并分析，可得到峰數(shù)，峰高，面積百分比，保留時(shí)間等參數(shù)。
[0021] 其中：A液為10?50mM TEA和200?800mM六氟異丙醇溶液組成；B液為20 %? 80%甲醇的10?50mM TEA和200?800mM六氟異丙醇溶液組成；洗脫方式是在60min內(nèi) A液從100 %?0 %，B液從0 %?100 %的順序梯度濃度進(jìn)行洗脫；
[0022] 在本發(fā)明中，反相層析色譜柱優(yōu)選為Xbridge 0ST C18柱，柱溫為30?80°C，柱流 速為 0· 1 ?lml/min。
[0023] 本發(fā)明公開了一種優(yōu)選的使用反相層析色譜柱對(duì)CpG 0DN序列純度進(jìn)行檢測(cè)的方 法，該方法是：
[0024] [1]·上Xbridge 0ST C18柱的反相層析色譜柱；
[0025] [2].輸入?yún)?shù)，檢測(cè)波長(zhǎng)245nm ;流速0. 5ml/min ;柱溫50°C
[0026] [3].流動(dòng)相：用A、B液兩種流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫；
[0027] [4].用A液平衡色譜柱，待基線平穩(wěn)后準(zhǔn)備上樣；
[0028] [5].上樣，取20U 1樣，注入上樣閥，將閥門扳下；
[0029] [6].進(jìn)行分離，鑒定；
[0030] [7].打印結(jié)果，并分析，可得到峰數(shù)，峰高，面積百分比，保留時(shí)間等參數(shù)；
[0031] 其中：A液為30mM TEA和400mM六氟異丙醇溶液組成；B液為40%甲醇的30mM TEA 和400mM六氟異丙醇溶液組成；洗脫方式是在60min內(nèi)A液從100%?0%，B液從0%? 100 %的順序梯度濃度進(jìn)行洗脫；
[0032] 在本發(fā)明中，基于RPC-HPLC技術(shù)的CpG 0DN序列純度檢測(cè)方法，其步驟是：使用反 相層析色譜柱，如 Xbridge OST C18 柱，2. 5um2. 流動(dòng)相：A 液：15mM TEA+400 mM 六 氟異丙醇；B液：50%甲醇+A ;檢測(cè)波長(zhǎng)：260nm，洗脫程序見下表。計(jì)算方法：面積歸一化 法。
[0033] 表1 Xbridge OST C18柱的洗脫方式
[0034]

【權(quán)利要求】
1. 一種使用反相層析色譜柱對(duì)CpG ODN序列純度進(jìn)行檢測(cè)的方法，該方法是： 1) 上Xbridge OST C18柱的反相層析色譜柱； 2) 輸入?yún)?shù)，檢測(cè)波長(zhǎng)245nm ;流速0. 1?lml/min ;柱溫3(T80°C 3) 用A、B液兩種流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫； 4) 用A液平衡色譜柱，待基線平穩(wěn)后準(zhǔn)備上樣； 5) 上樣，取20 u 1樣，注入上樣閥，將閥門扳下； 6) 進(jìn)行分離，鑒定； 7) 打印結(jié)果，并分析，可得到峰數(shù)，峰高，面積百分比，保留時(shí)間等參數(shù)； 其中：A液為1(Γ50 mM TEA和20(T800 mM六氟異丙醇溶液組成；B液為209Γ80%甲 醇的l(T50mM TEA和20(T800 mM六氟異丙醇溶液組成；洗脫方式是在60min內(nèi)A液從 1009Γ0%，B液從09Γ100%的順序梯度濃度進(jìn)行洗脫。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1中檢測(cè)純度的方法,柱溫為50°C。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1中的檢測(cè)純度的方法，柱流速為0. 5ml/min。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1中的檢測(cè)純度的方法，，該方法是： 1) 上Xbridge OST C18柱的反相層析色譜柱； 2) 輸入?yún)?shù)，檢測(cè)波長(zhǎng)245nm ;流速0. 5ml/min ;柱溫50°C 3) 用A、B液兩種流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫； 4) 用A液平衡色譜柱，待基線平穩(wěn)后準(zhǔn)備上樣； 5) 上樣，取20 u 1樣，注入上樣閥，將閥門扳下； 6) 進(jìn)行分離，鑒定； 7) 打印結(jié)果，并分析，可得到峰數(shù)，峰高，面積百分比，保留時(shí)間等參數(shù)； 其中：A液為30 mM TEA和400 mM六氟異丙醇溶液組成；B液為40%甲醇的30mM TEA 和400 mM六氟異丙醇溶液組成；洗脫方式是在60min內(nèi)A液從1009Γ0%，B液從09Γ100% 的順序梯度濃度進(jìn)行洗脫。
5. 反相層析色譜柱對(duì)CpG 0DN序列純度進(jìn)行檢測(cè)的方法在CpG 0DN序列純度檢測(cè)中的 應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104195235SQ201410391955
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年8月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月28日
【發(fā)明者】楊喆, 馬波, 王麗麗, 徐婭妮, 李鐳, 何麗芳, 李偉, 代云波, 柴俊東, 錢雯, 唐業(yè)峰, 趙志宏 申請(qǐng)人:云南沃森生物技術(shù)股份有限公司