金魚心臟細(xì)胞系及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種金魚心臟細(xì)胞系及其應(yīng)用。該金魚心臟細(xì)胞系已于2014年7月3日保存在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，其保藏登記編號(hào)為CGMCC?No.9334。本發(fā)明所述的金魚心臟細(xì)胞系特性穩(wěn)定、成分均一，是研究水產(chǎn)動(dòng)物病毒的良好材料。
【專利說明】金魚心臟細(xì)胞系及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種金魚心臟細(xì)胞系及其應(yīng)用，屬于醫(yī)學(xué)生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 關(guān)于魚類細(xì)胞系的篩選建立的研究，國內(nèi)外取得了很大的研究進(jìn)展。胖頭魚肌肉 細(xì)胞系、劍尾魚胚胎細(xì)胞系和巴拉圭鰺幼魚細(xì)胞系等多種包括海淡水魚類細(xì)胞系也陸續(xù)建 立起來。2013年，國外學(xué)者建立了條紋無須紕的尾鰭細(xì)胞系和團(tuán)頭魴的鰭條細(xì)胞系。2007 年，國內(nèi)學(xué)者樊挺俊等建立了大菱鲆鰭細(xì)胞系；2003年薛淑群等建立了鯉魚尾鰭條細(xì)胞 系。目前尚無關(guān)于建立金魚心臟細(xì)胞系的相關(guān)報(bào)道。
[0003] 世界衛(wèi)生組織（0ΙΕ)推薦檢測水產(chǎn)動(dòng)物病毒的"黃金標(biāo)準(zhǔn)"是通過細(xì)胞來分離病 毒。由此，國內(nèi)外的許多學(xué)者正在進(jìn)行魚類細(xì)胞系的研究。魚類原代細(xì)胞系的建立技術(shù)目 前是一種較為成熟的技術(shù)，但是要獲得針對(duì)病毒敏感的細(xì)胞系仍存著很大的偶然性和困難 性，所以建立一株需要魚類細(xì)胞系有效的途徑是制備大批量的原代細(xì)胞，從而篩選出對(duì)病 毒敏感的細(xì)胞系。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種特性穩(wěn)定、成分均一的金魚心臟細(xì)胞系 (GH)，該細(xì)胞系是一些水產(chǎn)動(dòng)物病毒的敏感細(xì)胞系，也是進(jìn)一步研究未知病毒的良好材料。
[0005] 本發(fā)明還要保護(hù)所述金魚心臟細(xì)胞系的制備方法及該細(xì)胞系的應(yīng)用。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：
[0007] 經(jīng)過篩選，本發(fā)明獲得了特性穩(wěn)定、成分均一的金魚心臟細(xì)胞系，該金魚心臟細(xì) 胞系（GH)已于2014年7月3日保存在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 (CGMCC)，并證明存活，其保藏登記編號(hào)為CGMCC No. 9334,保存地址為北京市朝陽區(qū)北辰西 路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼100101，其分類命名為金魚心臟細(xì)胞系。
[0008] 進(jìn)一步地，所述金魚心臟細(xì)胞系具有以下生物學(xué)特性：
[0009] (1)細(xì)胞呈現(xiàn)典型的上皮細(xì)胞形態(tài)，連續(xù)傳代培養(yǎng)50代仍保持該形態(tài)特點(diǎn)；
[0010] (2)細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力，連續(xù)培養(yǎng)50代仍保持該增殖和生長特性。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種上述金魚心臟細(xì)胞系的制備方法，該方法包括以下步驟：
[0012] (1)取金魚一條，用醫(yī)用酒精浸泡l_5min，于無菌條件下剪取金魚的心臟，放于濃 度為1000u/ml的青霉素-鏈霉素雙抗溶液中；
[0013] ⑵用解剖刀切割成小塊（約1mm),胰酶消化液消化5min，用培養(yǎng)基重懸，離心，棄 掉上清液，再用培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，離心，棄掉上清，最后加入培養(yǎng)基，重懸混勻；
[0014] (3)將步驟（2)制備的重懸混勻液加入到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0015] (4)待細(xì)胞鋪板到1/3的時(shí)候，更換新鮮的培養(yǎng)基一次；
[0016] (5)待細(xì)胞鋪滿板子，用胰酶消化液進(jìn)行初步消化后，加入新的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；
[0017] (6)傳代3次后，凍存，復(fù)蘇后能夠繼續(xù)穩(wěn)定增殖生長，該細(xì)胞系命名為GH。
[0018] 進(jìn)一步地，所述培養(yǎng)基為含有濃度為lOOu/ml青霉素-鏈霉素雙抗溶液和20 %特 級(jí)胎牛血清的M199培養(yǎng)基。
[0019] 進(jìn)一步地，所述胰酶消化液的配制：磷酸氫二鈉2. 3g，磷酸二氫鉀0. lg，氯化鈉 8. 0g，氯化鉀 0· 2g，EDTA 0· 2g，胰酶 0· 6g，水 1000ml。
[0020] 進(jìn)一步地，本發(fā)明所述的金魚心臟細(xì)胞系GH可以作為研究水產(chǎn)動(dòng)物病毒宿主細(xì) 胞使用，用于水產(chǎn)動(dòng)物病毒的分離。
[0021] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0022] 實(shí)驗(yàn)中使用的是魚類細(xì)胞培養(yǎng)的最常用的培養(yǎng)基、且在簡單的條件進(jìn)行原代細(xì)胞 篩選培養(yǎng)，保證最終獲得的細(xì)胞無需特殊試劑和條件就能增殖，為其提供了廣闊的應(yīng)用空 間。該金魚心臟細(xì)胞系是首次成功在體外培養(yǎng)。該細(xì)胞在培養(yǎng)7天，明顯出現(xiàn)延伸生長；15 天后鋪滿板子，進(jìn)行消化后，具有較強(qiáng)的繁殖能力，呈現(xiàn)典型的上皮細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞連續(xù)傳 代培養(yǎng)18個(gè)月已傳至50代，仍然保持上述形態(tài)特點(diǎn)、生長和增殖特性。因此，該細(xì)胞是一 種特性穩(wěn)定、成分均一的金魚心臟細(xì)胞系，是研究水產(chǎn)動(dòng)物病毒的良好材料。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0024] 圖1相差顯微鏡下的金魚心臟細(xì)胞系的形態(tài)；
[0025] 圖2金魚心臟細(xì)胞系懸浮特性分析；
[0026] 圖3金魚心臟細(xì)胞系的最佳血清濃度的確定；
[0027] 圖4金魚心臟細(xì)胞系的最佳培養(yǎng)溫度的確定；
[0028] 圖5金魚心臟細(xì)胞系的倍增曲線分析；
[0029] 圖6金魚心臟細(xì)胞系的增殖病毒的初步應(yīng)用。

【具體實(shí)施方式】
[0030] 為更好地理解本發(fā)明，下面將通過具體的實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的方案，本發(fā) 明的保護(hù)范圍應(yīng)包括權(quán)利要求的全部內(nèi)容，但不限于此。
[0031] 實(shí)施例1金魚心臟細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng)
[0032] 一、實(shí)驗(yàn)材料和試劑
[0033] 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：10g_20g的健康的金魚。
[0034] 實(shí)驗(yàn)器具：解剖刀、眼科剪刀、眼科鑷子和紗布等。
[0035] 培養(yǎng)基和相關(guān)試劑：
[0036] 青霉素-鏈霉素雙抗溶液濃度為10000u/ml ;
[0037] 培養(yǎng)基：含有濃度為100u/ml青霉素-鏈霉素雙抗溶液和20 %特級(jí)胎牛血清（杭 州四季青生物工程材料有限公司）的M199培養(yǎng)基（gibco公司）；
[0038] 胰酶消化液：磷酸氫二鈉2. 3g，磷酸二氫鉀0. lg，氯化鈉8. 0g，氯化鉀0. 2g，EDTA 〇.2g，胰酶 0.6g，水 1000ml ;
[0039] 醫(yī)用酒精；
[0040] 0· 01M 的 PBS 緩沖液（NaCl 80g，Na2HP04 · 12H20 29g，KH2P042g，KC1 2g，水 1000ml)。
[0041] 二、實(shí)驗(yàn)方法
[0042] 經(jīng)過檢測的健康金魚，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)暫養(yǎng)15天，經(jīng)過檢測無其他疾病，開始實(shí)驗(yàn)。具 體方法：
[0043] (1)取一條金魚在醫(yī)用酒精中浸泡5min，無菌條件下，取金魚的心臟，放于濃度為 lOOOu/ml的青霉素-鏈霉素雙抗溶液（蒸餾水配制）中，放置15min ;
[0044] (2)用解剖刀切割成小塊（約1mm),胰酶消化液消化5min。加入培養(yǎng)基，重懸。離 心lOOOrmp，20min。棄掉上清液，再次加入培養(yǎng)基，進(jìn)行重懸，離心，棄掉上清液，最后加入培 養(yǎng)基，重懸混勻。
[0045] (3)將步驟（2)制備的重懸混勻液加入到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0046] (4)待培養(yǎng)2天后觀察細(xì)胞貼壁情況，適當(dāng)加入培養(yǎng)基（保證培養(yǎng)基的pH)。待細(xì) 胞鋪板到1/3的時(shí)候（約7天），更換新鮮的培養(yǎng)基一次。
[0047] (5)待細(xì)胞鋪滿板子（約15天），用胰酶消化液進(jìn)行初步消化后，加入新的培養(yǎng)基 進(jìn)行培養(yǎng)。
[0048] (6)每隔7天傳代1次。
[0049] 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0050] 圖1為相差顯微鏡下的金魚心臟細(xì)胞系的形態(tài)；圖2是金魚心臟細(xì)胞系懸浮特性 分析，結(jié)果表明細(xì)胞均一性比較好，集中在直徑12-18微米。
[0051] 實(shí)施例2金魚心臟細(xì)胞系的傳代培養(yǎng)和凍存保種
[0052] -、試劑
[0053] 胰酶消化液：磷酸氫二鈉2. 3g，磷酸二氫鉀0· lg，氯化鈉8. 0g，氯化鉀0· 2g，EDTA 〇· 2g，胰酶 0· 6g，水 1000ml。
[0054] 凍存液：含10 % DMS0、25 %的特級(jí)胎牛血清的M199培養(yǎng)基。
[0055] 二、實(shí)驗(yàn)方法
[0056] 1.待細(xì)胞生長至90 %時(shí)，棄掉舊的培養(yǎng)基，加入5ml胰酶消化液進(jìn)行消化；
[0057] 2.待細(xì)胞呈現(xiàn)"白霧"狀的時(shí)候，加入2ml的凍存液，以終止胰酶的作用，輕輕幌 動(dòng)，使細(xì)胞混勻，計(jì)數(shù)。
[0058] 3.收集細(xì)胞到凍存管中，于凍存管上注明細(xì)胞的名稱、細(xì)胞數(shù)和凍存日期。
[0059] 4. -個(gè)月后，按照常規(guī)細(xì)胞復(fù)蘇的方法，進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇，細(xì)胞增殖能力仍然很強(qiáng)， 狀態(tài)良好。
[0060] 獲得的金魚心臟細(xì)胞系（GH)已于2014年7月3日保存在中國微生物菌種保藏管 理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)，并證明存活，其保藏登記編號(hào)為CGMCC No. 9334。
[0061] 實(shí)施例3金魚心臟細(xì)胞系的最適條件確定
[0062] -、試劑
[0063] 胰酶消化液：磷酸氫二鈉2. 3g，磷酸二氫鉀0· lg，氯化鈉8. 0g，氯化鉀0· 2g，EDTA 〇· 2g，胰酶 0· 6g，水 1000ml。
[0064] 培養(yǎng)基：不同濃度的特級(jí)胎牛血清的M199培養(yǎng)基。
[0065] 二、實(shí)驗(yàn)方法
[0066] 1、最適血清的確定
[0067] 分別配制特級(jí)胎牛血清濃度為10 %和20%的培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度為 3 X 105πι?Λ二種血清濃度培養(yǎng)基各按lmL/孔的量接種于24孔板，于25°C，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 每天從每個(gè)實(shí)驗(yàn)組里取出3孔細(xì)胞，消化收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，共培養(yǎng)7天，連續(xù)計(jì)數(shù)7次，繪制 其生長曲線。
[0068] 2、最適溫度的確定
[0069] 選擇201：、251：、301：三個(gè)不同培養(yǎng)溫度，使用添加20%特級(jí)胎牛血清的組99培 養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度為3 X ΚΛιιΓ1，細(xì)胞懸液按lmL/孔的量接種于24孔板并置于三個(gè)不同 培養(yǎng)溫度培養(yǎng)箱里。每天從每個(gè)實(shí)驗(yàn)組里取出3孔細(xì)胞，收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，共培養(yǎng)7天，連 續(xù)計(jì)數(shù)7次，繪制其生長曲線。
[0070] 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0071] 1.最適血清的確定（圖3)，金魚心臟細(xì)胞系在特級(jí)胎牛血清20 %的M199培養(yǎng)基 中，增長繁殖最好。
[0072] 2.最適溫度的確定（圖4)，金魚心臟細(xì)胞系在25°C生長，繁殖最好。
[0073] 實(shí)施例4金魚心臟細(xì)胞系的生長曲線
[0074] -、試劑
[0075] 胰酶消化液：磷酸氫二鈉2. 3g，磷酸二氫鉀0· lg，氯化鈉8. 0g，氯化鉀0· 2g，EDTA 〇· 2g，胰酶 0· 6g，水 1000ml。
[0076] 培養(yǎng)基：20%的特級(jí)胎牛血清（FBS)的M199培養(yǎng)基。
[0077] 二、實(shí)驗(yàn)方法
[0078] 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，收集計(jì)數(shù)細(xì)胞，使用含20 % FBS的M199培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞濃度 為1. 5 X ΙΟ%!/1，按lmL/孔的量接種至24孔板中，置培養(yǎng)箱中25°C培養(yǎng)。每天取3個(gè)孔細(xì) 胞，胰酶消化消化制成細(xì)胞懸液，混勻后用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，連續(xù)進(jìn)行 7d，以培養(yǎng)時(shí)間（d)為橫坐標(biāo)，細(xì)胞濃度（細(xì)胞/mL)為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。
[0079] 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0080] 金魚心臟細(xì)胞系對(duì)數(shù)生長期在第l-4d，當(dāng)4d時(shí)進(jìn)入到平穩(wěn)期（圖5)。
[0081] 實(shí)施例5金魚心臟細(xì)胞系的初步應(yīng)用
[0082] -、試劑
[0083] 胰酶消化液：磷酸氫二鈉2. 3g，磷酸二氫鉀0· lg，氯化鈉8. 0g，氯化鉀0· 2g，EDTA 〇· 2g，胰酶 0· 6g，水 1000ml。
[0084] 培養(yǎng)基：20%的特級(jí)胎牛血清（FBS)的M199培養(yǎng)基。
[0085] 由 ATCC 購買傳染性膜臟壞死病毒（infectious pancreatic necrosis virus， IPNV，ATCC VR-877)。
[0086] 二、實(shí)驗(yàn)方法
[0087] 對(duì)金魚心臟細(xì)胞系用胰酶消化液進(jìn)行消化，含有20 %的特級(jí)胎牛血清（FBS)的 M199培養(yǎng)基1:1傳代，25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞增殖在24h內(nèi)接入傳染性胰臟壞死病毒，置 于16°C培養(yǎng)箱中，每天觀察變化。
[0088] 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0089] 細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，說明金魚心臟細(xì)胞系能夠增殖病毒傳染性胰臟壞死 病毒，見圖6。
[0090] 顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì) 本發(fā)明的實(shí)施方式的限定，對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可 以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)，這里無法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā) 明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。
【權(quán)利要求】
1. 一種金魚心臟細(xì)胞系GH，其保藏編號(hào)為CGMCC No. 9334。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的金魚心臟細(xì)胞系GH，其特征在于，所述細(xì)胞系具有以下生物 學(xué)特性： (1) 細(xì)胞呈現(xiàn)典型的上皮細(xì)胞形態(tài)，連續(xù)傳代培養(yǎng)50代仍保持該形態(tài)特點(diǎn)； (2) 細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力，連續(xù)培養(yǎng)50代仍保持該增殖和生長特性。
3. -種權(quán)利要求1所述的金魚心臟細(xì)胞系GH的制備方法，其特征在于，該方法包括以 下步驟： (1) 取金魚一條，用醫(yī)用酒精浸泡l_5min，于無菌條件下剪取金魚的心臟，放于濃度為 1000u/ml的青霉素-鏈霉素雙抗溶液中； (2) 用解剖刀切割成小塊，胰酶消化液消化5min，用培養(yǎng)基重懸，離心，棄掉上清液，再 用培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，離心，棄掉上清，最后加入培養(yǎng)基，重懸混勻； (3) 將步驟（2)制備的重懸混勻液加入到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； (4) 待細(xì)胞鋪板到1/3的時(shí)候，更換新鮮的培養(yǎng)基一次； (5) 待細(xì)胞鋪滿板子，用胰酶消化液進(jìn)行初步消化后，加入新的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)； (6) 傳代3次后，凍存，復(fù)蘇后能夠繼續(xù)穩(wěn)定增殖生長，該細(xì)胞系命名為GH。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基為含有濃度為lOOu/ml青 霉素-鏈霉素雙抗溶液和20 %特級(jí)胎牛血清的M199培養(yǎng)基。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述胰酶消化液的配制：磷酸氫二鈉 2. 3g，磷酸二氫鉀 0. lg，氯化鈉 8. 0g，氯化鉀 0. 2g，EDTA 0. 2g，胰酶 0. 6g，水 1000ml。
6. 權(quán)利要求1所述的金魚心臟細(xì)胞系GH作為研究水產(chǎn)動(dòng)物病毒宿主細(xì)胞的應(yīng)用。
7. 權(quán)利要求1所述的金魚心臟細(xì)胞系GH在水產(chǎn)動(dòng)物病毒分離中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N7/00GK104152399SQ201410395208
【公開日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年8月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月12日
【發(fā)明者】景宏麗, 張旻, 王娜, 高隆英, 張利峰, 林祥梅, 吳紹強(qiáng), 王樹云, 江育林 申請(qǐng)人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院