F11基因拷貝數(shù)變異檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種F11基因拷貝數(shù)變異檢測試劑盒，包括：2×PCR緩沖液；競爭性DNA；PCR引物混合液和Taq?DNA聚合酶。由于目標(biāo)基因片段與其內(nèi)對照DNA之間僅有少數(shù)幾個堿基差別，這兩個模板的擴增效率將體現(xiàn)高度一致性，因此最后的擴增產(chǎn)物真實的反應(yīng)了擴增前兩個模板濃度比例。根據(jù)我們預(yù)測試結(jié)果，一個競爭性PCR反應(yīng)重復(fù)3次的標(biāo)準(zhǔn)方差在5％之內(nèi)，而且如果將目標(biāo)基因片段與內(nèi)對照DNA按不同稀釋梯度混合進行競爭性PCR，我們發(fā)現(xiàn)樣本峰與內(nèi)對照峰面積之比與兩個模板的原始濃度比的相關(guān)性達到99.9％以上。因此，基于此原理技術(shù)開發(fā)的F11基因拷貝數(shù)變異檢測試劑盒具有快速和高準(zhǔn)確性等優(yōu)點，具有良好的臨床價值。
【專利說明】F11基因拷貝數(shù)變異檢測試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，應(yīng)用于生物科學(xué)研究和臨床分子診斷，具體涉及一種 F11基因拷貝數(shù)變異檢測試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 遺傳性凝血因子XI (FXI)缺陷癥，又稱為血友病C，是較為少見的一組遺傳性出血 性疾病。該病為常染色體隱性遺傳性疾病，男女均可受累。本病在人群中的發(fā)病率約為10 萬分之一，隨著檢測水平的提1?，該病在人群中的發(fā)病率有所提1?，尤其在猶太人中有較1? 的發(fā)病率，雜合突變攜帶者可高達10%。
[0003] 遺傳性FXI缺陷臨床表現(xiàn)多樣，患者具有出血傾向，但多數(shù)患者無自發(fā)性出血，主 要表現(xiàn)為創(chuàng)傷或手術(shù)后出血增多。大多數(shù)臨床患者是在術(shù)前檢查或健康查體時查凝血因子 XI活性（FXI :C)低而確診。與其他出血性疾病不同，F(xiàn)XI:C水平與患者臨床出血癥嚴(yán)重?zé)o 明顯相關(guān)性。
[0004] FXI缺陷癥患者出血多發(fā)生于黏膜，如鼻出血，血尿，月經(jīng)過多等。這些部位的纖溶 活性較高，而研究認(rèn)為，F(xiàn)XI有抑制纖溶的作用，F(xiàn)XI缺乏可導(dǎo)致凝血酶和凝血酶激活的纖 溶抑制物（TAFI)活性降低，導(dǎo)致纖溶亢進，從而引起出血增多。這可能是FXI缺陷癥導(dǎo)致 臨床出血的主要機制。
[0005] 據(jù)FXI缺陷癥的突變數(shù)據(jù)庫（http://WWW. factorxi. com)統(tǒng)計，迄今為止，共發(fā)現(xiàn) 220種與FXI的缺陷有關(guān)的基因突變，大多數(shù)突變表現(xiàn)為FXI活性和抗原水平的共同降低， 為交叉反應(yīng)物質(zhì)陰性（CRM-)。突變類型主要包括錯義突變、堿基缺失或插入、無義突變和剪 切位點突變等，其中錯義突變最為常見，占57%，堿基缺失為6%。突變分布于整個FXI基 因（F11)，編碼包括信號肽、連接區(qū)、球形結(jié)構(gòu)區(qū)1-4(AP1-AP4)、絲氨酸蛋白酶區(qū)（SP)，其中 SP區(qū)的突變最多，約占占30 %。
[0006] FXI缺陷癥的基因診斷主要是通過F11基因直接測序的方法分析診斷。該方法可 有效地診斷點突變及小的缺失和插入突變，但對大缺失突變不能明確診斷，而對打的插入 突變則檢測不到。
[0007] 異常的DNA拷貝數(shù)變化（CNV)是許多人類遺傳性疾病的一種重要分子致病機制。 作為疾病的一項生物學(xué)標(biāo)志，染色體水平的缺失、擴增等變化已成為許多疾病研究的熱點， 然而傳統(tǒng)的方法（比如G顯帶，F(xiàn)ISH，CGH等）存在操作繁瑣，分辨率低等問題，難以快速 提供變異區(qū)段的具體信息。近年來，隨著芯片技術(shù)和分子診斷技術(shù)的發(fā)展，比較基因組雜 交芯片（array-based Comparative Genomic Hybridization，aCGH)及多重連接探針技術(shù) (multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)被廣泛應(yīng)用于 CNV檢測。同 傳統(tǒng)方法相比，該類技術(shù)具有極高的分辨率。
[0008] aCGH技術(shù)通過在一張芯片上用標(biāo)記不同熒光素的樣品（病例樣品和對照樣品）進 行共雜交來檢測樣本基因組相對于對照基因組的DNA拷貝數(shù)變化，該檢測無需細(xì)胞培養(yǎng)， 是對全基因組的拷貝數(shù)變化的檢測，分辨率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于核型分析。所需時間約5天左右。因 此，成本相對較高。使用該技術(shù)檢測患者F11缺失雖然可以保證極高的分辨率，但是由于芯 片的成本短期內(nèi)難以下降，使檢測費用高，浪費了大量其他信息。開發(fā)針對目的基因片段或 目的基因的CNV檢測具有重要的臨床應(yīng)用價值。而MLPA利用簡單的雜合、連接、PCR擴增反 應(yīng)，可以對待測核酸靶序列或靶基因進行精確的定性和定量分析，現(xiàn)已廣泛運用于各種遺 傳性疾病的基因診斷中。另一種目前廣泛應(yīng)用于CNV檢測領(lǐng)域的技術(shù)為多重連接探針技術(shù) (MLPA)。MLPA最大的特色在于它針對靶序列設(shè)計了一對探針，一條化學(xué)合成的短探針及一 條由M13噬菌體制備的長探針，擴增僅針對完成連接的探針而非樣本靶序列。其反應(yīng)可分 為3步：1.兩條特異性探針分別與靶序列結(jié)合2.兩條探針相互連接形成一條單鏈3.單鏈 結(jié)合PCR引物開始循環(huán)擴增。只有當(dāng)特異性探針與靶序列完全互補時，兩條探針才能被連 接酶連接進而形成單鏈擴增，而每一對探針的擴增產(chǎn)物的長度都是不同的，借助毛細(xì)電泳 可以對擴增產(chǎn)物進行分離鑒別，確保了該方法極高的特異性。MLPA可在同一反應(yīng)管中對50 個不同片段的拷貝數(shù)進行檢測，所需設(shè)施簡單，PCR儀和毛細(xì)管電泳儀。荷蘭MRC-Holland 公司研發(fā)了數(shù)百種MLPA檢測試劑盒，用于人類疾病，細(xì)胞遺傳學(xué)及腫瘤研究，其中包括各 種遺傳性出血與血栓性疾病的相關(guān)基因的CNVs的檢測。盡管MLPA在診斷特定基因外顯子 CNVs方面技術(shù)已經(jīng)非常成熟，但是MLPA也存在一些比較突出的問題。首先，它對所檢測標(biāo) 本的DNA質(zhì)量要求相對較高，普通的DNA抽提方法無法滿足實驗要求，需要購買質(zhì)量較好的 商品化試劑盒進行抽提，增加了實驗成本，而且檢測標(biāo)本和參比標(biāo)本必須使用同種DNA抽 提方法。
[0009] AccuCopy是一種基于競爭性熒光PCR技術(shù)的新型檢測方法。其擴增模板除待測靶 序列之外還包括額外加入的合成片段，即競爭DNA片段，該片段與相應(yīng)的待測序列極其相 似，僅有極微小的差別，通常為數(shù)個堿基長度上的差異。這一方法的基本原理為：將一定量 的競爭DNA片段與合適量的樣本DNA混合，作為隨后多重?zé)晒飧偁幮訮CR擴增的模板，同時 選擇數(shù)種已知二倍體模板及其類似合成片段作為參考物（管家基因，分布在不同的染色體 上）；擴增后的多重PCR產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳后對不同基因位點擴增產(chǎn)物以及同一位點的不 同模板（樣本DNA與競爭DNA)擴增產(chǎn)物根據(jù)其長度差異進行分離；通過對熒光峰面積進行 分析，將樣本DNA熒光峰（S)與競爭DNA熒光峰（C)相比較，獲得S/C值后同標(biāo)準(zhǔn)二倍體參 考物的S/C值進行校正后獲取目標(biāo)基因的準(zhǔn)確拷貝數(shù)。
[0010] 而AccuCopy作為一種檢測CNV的新方法，雖然目前使用范圍較小，但該方法具有 操作簡單，對DNA質(zhì)量要求不高且每次分析所需DNA樣本量極少，僅需10ng左右，而MLPA 需要高質(zhì)量的DNA 100ng，完成整個反應(yīng)少于4小時，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于MLPA 24小時的檢測時間。 此外該方法的精密度和準(zhǔn)確性高，每個反應(yīng)可以對20個不同的目的片段進行檢測。我們利 用該技術(shù)已經(jīng)對F8基因的CNV進行了檢測，取得了良好的效果，證明AccuCopy技術(shù)具有設(shè) 計靈活，可以根據(jù)具體需求隨時進行相應(yīng)的改善與補充。本發(fā)明利用AccuCopy技術(shù)，設(shè)計 F11基因 CNV檢測試劑盒，具有良好的臨床價值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的以上問題，提供一種F11基因拷貝數(shù)變異 檢測試劑盒，基于多重基因拷貝數(shù)檢測方法技術(shù)，檢測F11基因拷貝數(shù)變異的試劑盒及檢 測體系，主要用于檢測F11基因缺失或重復(fù)突變而導(dǎo)致的凝血因子XI (FXI)質(zhì)或量的缺陷， 以獲取F11基因各目標(biāo)位點的正確拷貝數(shù)的檢測試劑盒。
[0012] 為實現(xiàn)上述技術(shù)目的，達到上述技術(shù)效果，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0013] 一種F11基因拷貝數(shù)變異檢測試劑盒，包括：
[0014] 1)2XPCR 緩沖液；
[0015] 2)競爭性 DNA;
[0016] 3)PCR引物混合液；
[0017] 4) TaqDNA 聚合酶；
[0018] 其中，所述PCR引物混合液包括：
[0019] a)Fll_l, Fll_2, Fll_3, Fll_4, Fll_5, Fll_6, Fll_7, Fll_8, Fll_10, Fll_ll, F11_12，F(xiàn)11_13，F(xiàn)11_14，F(xiàn)11_15 共 14 對目標(biāo)位點的多重 PCR 引物：SEQ ID N0:l-28 ;
[0020] b)參照位點A、參照位點B、參照位點C、參照位點D共4對參照基因的多重PCR引 物：SEQ ID N0:29-36 ;
[0021] 所述競爭性DNA包括：
[0022] i)Fll_l, Fll_2, Fll_3, Fll_4, Fll_5, Fll_6, Fll_7, Fll_8, Fll_10, Fll_ll, Fll_12, Fll_13, Fll_14, Fll_15 共 14 個標(biāo)準(zhǔn)序列的內(nèi)對照 DNASEQ ID N0:37-50 ;
[0023] ii)參照基因 A、參照基因 B、參照基因 C、參照位點D共4個參照基因的內(nèi)對照 DNASEQ ID N0:51-54。
[0024] 進一步的，所述的每對引物中有一個5'端熒光素標(biāo)記。
[0025] 優(yōu)選的，所述熒光素可選用 FAM、HEX、VIC、NED、PET、TAMRA、R0X、熒光素、FITC、 IRD-700/800、CY3、CY5、CY3. 5、CY5. 5、TET、TAMRA、JOE、BODIPY TMR、俄勒岡綠、羅丹明綠、 羅丹明紅、德克薩斯紅或雅基馬黃。但不僅限于此23種熒光素，如果上述所標(biāo)記引物的擴 增產(chǎn)物利用片斷大小可以區(qū)分鑒別，可利用同種熒光標(biāo)記；如果無法以擴增產(chǎn)物片段大小 區(qū)別則可利用不同種熒光標(biāo)記區(qū)分。
[0026] 一種F11基因拷貝數(shù)變異檢測方法，主要包括以下步驟：
[0027] 1)針對待測F11基因，設(shè)計14對目標(biāo)位點的多重PCR引物，每對引物中的一條具 有熒光標(biāo)記；設(shè)計了 4對參照基因的多重PCR引物；每對引物中的一條具有熒光標(biāo)記；上述 同種熒光標(biāo)記的多重PCR引物對應(yīng)擴增產(chǎn)物的長度有差異；
[0028] 2)設(shè)計針對不同待測的F11基因目標(biāo)位點和參照基因的內(nèi)對照DNA片段，所述內(nèi) 對照DNA片段與步驟1中對應(yīng)的多重PCR引物的擴增產(chǎn)物高度一致，為對應(yīng)擴增產(chǎn)物的序 列缺失或插入少數(shù)1-50個堿基的序列；
[0029] 3)對所有內(nèi)對照DNA片段嚴(yán)格定量；
[0030] 4)將每種內(nèi)對照DNA片段等量混合，與所述多重PCR引物對待測樣品進行多重?zé)?光PCR擴增；
[0031] 5)擴增產(chǎn)物通過變性毛細(xì)管電泳將不同長度的片段分開，得到每個條帶的位置信 息以及熒光強度。
[0032] 優(yōu)選的，步驟5之后還包括以下步驟：計算每個F11基因目標(biāo)位點的樣本條帶/內(nèi) 對照DNA條帶的熒光峰高或面積比，然后將目標(biāo)位點的該比值除以參照基因的該比值再乘 以參照基因的拷貝數(shù)即得目標(biāo)位點的相對拷貝數(shù)。
[0033] 本發(fā)明的有益效果是：
[0034] 1、AccuCopy技術(shù)與MLPA -樣，可在同一反應(yīng)管中針對多個外顯子進行拷貝數(shù)檢 測。而且在診斷特定基因或者特定區(qū)域CNVs方面AccuCopy具有更大的優(yōu)勢和應(yīng)用前景。 AccuCopy技術(shù)操作相對簡單，只需要常規(guī)的PCR儀及ABI3130XL測序儀，而且對模板DNA 的質(zhì)量要求沒有MLPA高，各種方法抽提的DNA均能滿足試驗要求，且僅需10-20ng的模板 DNA。同時，應(yīng)用AccuCopy技術(shù)，完成整個試驗過程只需要4個小時，而MLPA需要24個小 時，效率明顯提高。更為重要的是AccuCopy技術(shù)的精確度高，變異系數(shù)小于5%，并且結(jié)果 的準(zhǔn)確性也高。因此，本項發(fā)明采用了 AccuCopy技術(shù)開發(fā)FI 1基因拷貝數(shù)變異檢測試劑盒， 并檢測發(fā)現(xiàn)了約9例有大缺失突變的血友病C患者，臨床應(yīng)用效果良好。
[0035] 2、快速檢測：在獲得內(nèi)對照DNA后，只要將樣本DNA與內(nèi)對照DNA混勻后進行多重 PCR，然后將PCR產(chǎn)物直接上毛細(xì)管熒光電泳儀（如ABI測序儀）即可，整個實驗過程僅需 要一步PCR循環(huán)和一步毛細(xì)管電泳，耗時不到4個小時。
[0036] 3、高精確性：由于目標(biāo)基因片段與其內(nèi)對照DNA之間僅有少數(shù)幾個堿基差別，這 兩個模板的擴增效率將體現(xiàn)高度一致性，因此最后的擴增產(chǎn)物真實的反應(yīng)了擴增前兩個模 板濃度比例，根據(jù)我們預(yù)測試結(jié)果，一個競爭性PCR反應(yīng)重復(fù)3次的標(biāo)準(zhǔn)方差在5 %之內(nèi)，而 且如果將目標(biāo)基因片段與內(nèi)對照DNA按不同稀釋梯度混合進行競爭性PCR，我們發(fā)現(xiàn)樣本 峰與內(nèi)對照峰面積之比與兩個模板的原始濃度比的相關(guān)性達到99. 9%以上。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0037] 圖1為本發(fā)明所述檢測方法的原理示意圖；
[0038] 圖2為本發(fā)明實施例中樣品1檢測結(jié)果示意圖；
[0039] 圖3為本發(fā)明實施例中樣品2檢測結(jié)果示意圖。

【具體實施方式】
[0040] 下面將參考附圖并結(jié)合實施例，來詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0041] F11基因目標(biāo)位點序列，參照基因及內(nèi)對照DNA序列信息：
[0042] 1、FI 1基因位點1 (目標(biāo)位點）
[0043] 人標(biāo)準(zhǔn)序列，274bp
[0044] AGCTTTGGCTAGCAGGCACACAGGCAAAATCAAGTTCTACATCTGTCCCTGTGTATGTCACTTGTTTGA ATACGaaataaaattaaaaaaataaattCAGTGTATTGAGAAAGCAAGCAATTCTCTCAAGGTATATTTCTGACATA CTAAGATTTTAACGACTTTCACAAATATGCTGTACTGAGAGAGAATGTTACATAACATTGAGAACTAGTACAAGTAA ATATTAAAGTGAAGTGA CCAT TTCCTACACAAGCTCATTCAGAGGAGGATG
[0045] Fll_l 內(nèi)對照 DNA 序列，272bp
[0046] AGCTTTGGCTAGCAGGCACACAGGCAAAATCAAGTTCTACATCTGTCCCTGTGTATGTCACTTGTTTGA ATACGaaataaaattaaaaaaataaattCAGTGTATTGAGAAAGCAAGCAATTCTCTCAAGGTATATTTCTGACATA CTAAGATTTTAACGACTTTCACAAATATGCTGTACTGAGAGAGAATGTTACATAACATTGAGAACTAGTACAAGTAA ATATTAAAGTGAAGTGA CT TTCCTACACAAGCTCATTCAGAGGAGGATG
[0047] 2、Fll基因位點2(目標(biāo)位點）
[0048] 人標(biāo)準(zhǔn)序列，213bp
[0049] CATGCACCTTTTTCTCATTGTAGG ATG ATTT TCTT ATATCAAGTGGTACATTTCATTTTATTTACT TCAGTTTCTGGTGGTAAGTAGAGTGTTATCTTAACTATGGGCTGGGAGAGGGAAATCACACTGCAATCTCCACACAT GTGGGAGAATCCCACACCATTTATGCCGGGAAGGAAATAAAATGTTTTTATTAACTTCCTGCCTGAGGCT
[0050] Fll_2 內(nèi)對照 DNA 序列，211bp
[0051] CATGCACCTTTTTCTCATTGTAGG ATG ATTT TT ATATCMGTGGTACATTTCATTTTATTTACTTC AGTTTCTGGTGGTAAGTAGAGTGTTATCTTAACTATGGGCTGGGAGAGGGAAATCACACTGCAATCTCCACACATGT GGGAGAATCCCACACCATTTATGCCGGGAAGGAAATAAAATGTTTTTATTAACTTCCTGCCTGAGGCT
[0052] 3、Fll基因位點3(目標(biāo)位點）
[0053] 人標(biāo)準(zhǔn)序列，171bp
[0054] CCAACATAACGCATGCCATGTACTAC ATCA CAGAATGTGTGACTCAGTTGTTGAAGGACACCTGCTT TGAAGGAGGGGACATTACTACGGTCTTCACACCAAGCGCCAAGTACTGCCAGGTAGTCTGCACTTACCACCCAAGAT GTTTACTCTTCACTTTCACGGCGGAAT
[0055] Fll_3 內(nèi)對照 DNA 序列，169bp
[0056] CCAACATAACGCATGCCATGTACTAC AA CAGAATGTGTGACTCAGTTGTTGAAGGACACCTGCTTTG AAGGAGGGGACATTACTACGGTCTTCACACCAAGCGCCAAGTACTGCCAGGTAGTCTGCACTTACCACCCAAGATGT TTACTCTTCACTTTCACGGCGGAAT
[0057] 4、F11基因位點4(目標(biāo)位點）
[0058] 人標(biāo)準(zhǔn)序列，136bp
[0059] AATGCTCACACCAAATAAGCGGTAAGATA TGTT CTCAGAATCAACAAATACCAGCTGTGATGTACAC ATATCGCCACATCGGATGTGGTTTTAAGGCTATGAAATGAAACACTGCTATGTGGAAATAAACCCCCTT
[0060] Fll_4 內(nèi)對照 DNA 序列，134bp
[0061] AATGCTCACACCAAATAAGCGGTAAGATA TT CTCAGAATCAACAAATACCAGCTGTGATGTACACAT ATCGCCACATCGGATGTGGTTTTAAGGCTATGAAATGAAACACTGCTATGTGGAAATAAACCCCCTT
[0062] 5、Fll基因位點5(目標(biāo)位點）
[0063] 人標(biāo)準(zhǔn)序列，128bp
[0064] GCTCAGTTGCCAAGAGTGCTCAAGA ATGC CAAGAAAGATGCACGGATGACGTCCACTGCCACTTTTT CACGTACGCCACAAGGCAGTTTCCCAGCCTGGAGCATCGGTGAGTGAGTCCCAGGACATTC
[0065] Fll_5 內(nèi)對照 DNA 序列，126bp
[0066] GCTCAGTTGCCAAGAGTGCTCAAGA AC CAAGAAAGATGCACGGATGACGTCCACTGCCACTTTTTCA CGTACGCCACAAGGCAGTTTCCCAGCCTGGAGCATCGGTGAGTGAGTCCCAGGACATTC
[0067] 6、F11基因位點6(目標(biāo)位點）
[0068] 人標(biāo)準(zhǔn)序列，185bp
[0069] TTCCTCCTTGCAGTTGGAAGAATAAGACACTTTTCCTTTTTCTTTTTATTCAGTAACATTTGTCTACT GAAGCACACCCAAACAGGGACACCAACCAGAATAACGAAGCTCGATAAAGTGGTGTCTGGATTTTCACTGAAATCC TGTGC ACTT TCTAATCTGGGTAATTATCGACTTCTTGATGA
[0070] Fll_6 內(nèi)對照 DNA 序列，183bp
[0071] TTCCTCCTTGCAGTTGGAAGAATAAGACACTTTTCCTTTTTCTTTTTATTCAGTAACATTTGTCTACT GAAGCACACCCAAACAGGGACACCAACCAGAATAACGAAGCTCGATAAAGTGGTGTCTGGATTTTCACTGAAATCC TGTGC AT TCTAATCTGGGTAATTATCGACTTCTTGATGA
[0072] 7、Fll基因位點7 (目標(biāo)位點）
[0073] 人標(biāo)準(zhǔn)序列，117bp
[0074] CGCGCAGCTTGTATTAGGGACATTTTC CCTA ATACGGTGTTTGCAGACAGCAACATCGACAGTGTCA TGGCTCCCGATGCTTTTGTCTGTGGCCGAATCTGCACTCATCATCCCGGT
[0075] Fll_7 內(nèi)對照 DNA 序列，115bp
[0076] CGCGCAGCTTGTATTAGGGACATTTTC CA ATACGGTGTTTGCAGACAGCAACATCGACAGTGTCATG GCTCCCGATGCTTTTGTCTGTGGCCGAATCTGCACTCATCATCCCGGT
[0077] 8、F11基因位點8(目標(biāo)位點）
[0078] 人標(biāo)準(zhǔn)序列，232bp
[0079] ACCTAAGGGCCATGGAGTGTGACTCCATGGTTTATGGGTGTAACTCCGTGGTTTATGAAGAGT ACTTTCAAAATAGGAAAATCTTCACAACTAAGTGCTAGCATGAGCTGACTTTACTTTCTCTAGGTGCTGTA AAAATGTTTTTATGTGTTTGATATGATATATTTCTACTTCCCTTTTGTTTTTGTTAGAAATCTTTG TCTC CTTAAAACATCTGAGAGTGGATTGCCCA
[0080] Fll_8 內(nèi)對照 DNA 序列，230bp
[0081] ACCTAAGGGCCATGGAGTGTGACTCCATGGTTTATGGGTGTAACTCCGTGGTTTATGAAGAGT ACTTTCAAAATAGGAAAATCTTCACAACTAAGTGCTAGCATGAGCTGACTTTACTTTCTCTAGGTGCTGT AAAAATGTTTTTATGTGTTTGATATGATATATTTCTACTTCCCTTTTGTTTTTGTTAGAAATCTTTG TC CTTAAAACATCTGAGAGTGGATTGCCCA
[0082] 9、Fll基因位點10(目標(biāo)位點）
[0083] 人標(biāo)準(zhǔn)序列，262bp
[0084] CGTCTGCCTGTGAGGTGCATTATGTTTA TACC GTTTTGTTTCCAACTGCAGGGGCAAGTGTTACTTA AAGCTTTCTTCAAACGGATCTCCAACTAAAATACTTCACGGGAGAGGAGGCATCTCTGGATACACATTAAGGTTGTG TAAAATGGATAATGGTGAGTATAATGTCACTTGAAAAAATATAGCTGAAGGAATTATTCCATGCTTCATACATCACA ATCAAGACTGTCAGTTATAGCCACAGAAGGGAGAACATTCA
[0085] Fll_10 內(nèi)對照 DNA 序列，260bp
[0086] CGTCTGCCTGTGAGGTGCATTATGTTTA TC GTTTTGTTTCCAACTGCAGGGGCAAGTGTTACTTAAA GCTTTCTTCAAACGGATCTCCAACTAAAATACTTCACGGGAGAGGAGGCATCTCTGGATACACATTAAGGTTGTGTA AAATGGATAATGGTGAGTATAATGTCACTTGAAAAAATATAGCTGAAGGAATTATTCCATGCTTCATACATCACAAT CAAGACTGTCAGTTATAGCCACAGAAGGGAGAACATTCA
[0087] 10、Fll基因位點11 (目標(biāo)位點）
[0088] 人標(biāo)準(zhǔn)序列，93bp
[0089] CCACCAAAATCAAGCCCAGGATCGTTG GAGG AACTGCGTCTGTTCGTGGTGAGTGGCCGTGGCAGGT GACCCTGCACACAACCTCACCCACTC
[0090] Fll_ll 內(nèi)對照 DNA 序列，91bp
[0091] CCACCAAAATCAAGCCCAGGATCGTTG GG AACTGCGTCTGTTCGTGGTGAGTGGCCGTGGCAGGTGA CCCTGCACACAACCTCACCCACTC
[0092] 11、Fll基因位點12(目標(biāo)位點）
[0093] 人標(biāo)準(zhǔn)序列，107bp
[0094] AATGGCAGAAAGCGGGTATGATATTG CCTT GTTGAAACTGGAAACCACAGTGAATTACACAGGTACG GAGAATTTTATCCGGAAAGTTGTCTCCAATGGTGAACTGG
[0095] Fll_12 內(nèi)對照 DNA 序列，105bp
[0096] AATGGCAGAAAGCGGGTATGATATTG CT GTTGAAACTGGAAACCACAGTGAATTACACAGGTACGGA GAATTTTATCCGGAAAGTTGTCTCCAATGGTGAACTGG
[0097] 12、FI 1基因位點13(目標(biāo)位點）
[0098] 人標(biāo)準(zhǔn)序列，244bp
[0099] TGTGCGATATCGTGCTGAACCTGAGGGA GGAA AATACACGACAACAAGGCAAAAAATGAATATAGTA AACAAAGAAAACACAGATAATGTACAGTGGAAGAAGAGTCTCTTCTGGAAAAGAGGATATATTTTGCGTCTCATATT TAAACCACGATTTTTTAAATTTAGATTCTCAACGACCCATATGCCTGCCTTCCAAAGGAGATAGAAATGTAATATAC ACTGATTGCTGGGTGACTGGATG
[0100] Fll_13 內(nèi)對照 DNA 序列，242bp
[0101] TGTGCGATATCGTGCTGAACCTGAGGGA GA AATACACGACAACAAGGCAAAAAATGAATATAGTAAA CAAAGAAAACACAGATAATGTACAGTGGAAGAAGAGTCTCTTCTGGAAAAGAGGATATATTTTGCGTCTCATATTTA AACCACGATTTTTTAAATTTAGATTCTCAACGACCCATATGCCTGCCTTCCAAAGGAGATAGAAATGTAATATACAC TGATTGCTGGGTGACTGGATG
[0102] 13、F11基因位點14(目標(biāo)位點）
[0103] 人標(biāo)準(zhǔn)序列，87bp
[0104] TGACCAACGAAGAGTGCCAGAAGAGA TACA GAGGACATAAAATAACCCATAAGATGATCTGTGCCGG CTACAGGGAAGGAGGGAAGG
[0105] Fll_14 內(nèi)對照 DNA 序列，85bp
[0106] TGACCAACGAAGAGTGCCAGAAGAGA ΤΑ GAGGACATAAAATAACCCATAAGATGATCTGTGCCGGCT ACAGGGAAGGAGGGAAGG
[0107] 14、FI 1基因位點15(目標(biāo)位點）
[0108] 人標(biāo)準(zhǔn)序列，287bp
[0109] CCCCTCGTTCTAGGGAGATTCGGGAGGCCCTCTGTCCTGCAAACACAATGAGGTCTGGCATCTGGTAG GCATCACGAGCTGGGGCGAAGGCTGTGCTCAAAGGGAGCGGCCAGGTGTTTACACCAACGTGGTCGAGTACGTGGA CTGGATTCTGGAGAAAACTCAAGCAGTG TGA ATGGGTTCCCAGGGGCCATTGGAGTCCCTGAAGGACCCAGGATT TGCTGGGAGAGGGTGTTGAGTTCACTGTGCCAGCAT GCTT CCTCCACAGTAACACGCTGAAGGGGCTT
[0110] Fll_15 內(nèi)對照 DNA 序列，285bp
[0111] CCCCTCGTTCTAGGGAGATTCGGGAGGCCCTCTGTCCTGCAAACACAATGAGGTCTGGCATCTGGTAG GCATCACGAGCTGGGGCGAAGGCTGTGCTCAAAGGGAGCGGCCAGGTGTTTACACCAACGTGGTCGAGTACGTGGA CTGGATTCTGGAGAAAACTCAAGCAGTG TGA ATGGGTTCCCAGGGGCCATTGGAGTCCCTGAAGGACCCAGGATT TGCTGGGAGAGGGTGTTGAGTTCACTGTGCCAGCAT GT CCTCCACAGTAACACGCTGAAGGGGCTT
[0112] 15、參照基因 A
[0113] 人標(biāo)準(zhǔn)序列，75bp
[0114] TGAGCCAAAAATTCAGAATACAAGGAGCTTTCAAGGAAAAAGG CTGT ATGCTGCGTTTGCCTGCCTTCCAAGCAA
[0115] 參照基因 A內(nèi)對照DNA序列，73bp
[0116] TGAGCCAAAAATTCAGAATACAAGGAGCTTTCAAGGAAAAAGG CT ATGCTGCGTTTGCCTGCCTTCCAAGCAA
[0117] 16、參照基因 B
[0118] 人標(biāo)準(zhǔn)序列，145bp
[0119] CACTGAGCCCCAGAGACCTGACAAGCCTGTTTGAGCCGTGCCTGAAAAATGTGGCTCATCCTCAG GCTG CAGCGGGGAAAATGGAAGAGTTTAATTGGTTCTGACTTCAGGATTCAGATCATAGTTTTCCCTGGAGGTGTG CATT
[0120] 參照基因 B內(nèi)對照DNA序列，143bp
[0121] CACTGAGCCCCAGAGACCTGACAAGCCTGTTTGAGCCGTGCCTGAAAAATGTGGCTCATCCTCAG GG CAGCGGGGAAAATGGAAGAGTTTAATTGGTTCTGACTTCAGGATTCAGATCATAGTTTTCCCTGGAGGTGTGCATT
[0122] 17、參照基因 C
[0123] 人標(biāo)準(zhǔn)序列，222bp
[0124] AGGGTGCTGGGATCAGAGAGAGGCTTTTTCAGGGAGACCATCAGTGGGTGGGAGAAGATGTCTCATCTC CGCCCGAGTCTCCATTGTGAGCTTTCTGAGCATTTCACCATGGAGACTCGGCACAGACGTGTTCCTTGGCTTTCCTG TAGGAATCCAGGGCCCACCAGAGCTTCCCTTAGCACCA GCAG TGGCAGCTGGTTCATTTTGCCACCCTCCAGTAG C
[0125] 參照基因 C內(nèi)對照DNA序列220bp
[0126] AGGGTGCTGGGATCAGAGAGAGGCTTTTTCAGGGAGACCATCAGTGGGTGGGAGAAGATGTCTCATCTC CGCCCGAGTCTCCATTGTGAGCTTTCTGAGCATTTCACCATGGAGACTCGGCACAGACGTGTTCCTTGGCTTTCCTG TAGGAATCCAGGGCCCACCAGAGCTTCCCTTAGCACCA GG TGGCAGCTGGTTCATTTTGCCACCCTCCAGTAGC
[0127] 18、參照基因 D
[0128] 人標(biāo)準(zhǔn)序列，298bp
[0129] TCCTCCACCAAGCTGATGTGTTCCTTAGCACTGATGGCAATTCTCTTCAGTCTGGGGACAGGTATCATC TCCTTTGGTTTATCAGTGGACGGAGCACGGGCTGCAGGGTTCAACA AAGC ATCCATGTCCTCAAAGAAGGCGCAG GGTTCTAGCATGTGGCCATTTCTCACCTTTCGATAGCTTTTCTGGAGACTTTTGAACTTGGTTCGACACTGTTCTGG GGTTCTAAGGAAGCCACATTCTCGCAACCATTCAGCCACAGCACCATACACTTGGCTATTTCGGGGACAGGCCTGAA
[0130] 參照基因 D內(nèi)對照DNA序列，296bp
[0131] TCCTCCACCAAGCTGATGTGTTCCTTAGCACTGATGGCAATTCTCTTCAGTCTGGGGACAGGTATCATC TCCTTTGGTTTATCAGTGGACGGAGCACGGGCTGCAGGGTTCAACA AC ATCCATGTCCTCAAAGAAGGCGCAGGG TTCTAGCATGTGGCCATTTCTCACCTTTCGATAGCTTTTCTGGAGACTTTTGAACTTGGTTCGACACTGTTCTGGGG TTCTAAGGAAGCCACATTCTCGCAACCATTCAGCCACAGCACCATACACTTGGCTATTTCGGGGACAGGCCTGAA
[0132] 表1為用于復(fù)合擴增體系的引物序列以及所述引物序列的混合物。
[0133] 表 1
[0134]

【權(quán)利要求】
1. 一種F11基因拷貝數(shù)變異檢測試劑盒，其特征在于，包括： 1) 2XPCR緩沖液； 2) 競爭性DNA ; 3. PCR引物混合液； 4. TaqDNA聚合酶； 其中，所述PCR引物混合液包括： a) Fll_l, Fll_2, Fll_3, Fll_4, Fll_5, Fll_6, Fll_7, Fll_8, Fll_10, Fll_ll, Fll_12, F11_13，F(xiàn)11_14，F(xiàn)11_15 共 14 對目標(biāo)位點的多重 PCR 引物：SEQ ID N0:l-28 ; b) 參照位點A、參照位點B、參照位點C、參照位點D共4對參照基因的多重PCR引物： SEQ ID NO :29-36 ； 所述競爭性DNA包括： i) Fll_l, Fll_2, Fll_3, Fll_4, Fll_5, Fll_6, Fll_7, Fll_8, Fll_10, Fll_ll, Fll_12, F11_13，F(xiàn)11_14，F(xiàn)11_15 共 14 個標(biāo)準(zhǔn)序列的內(nèi)對照 DNASEQ ID N0:37-50; ii) 參照基因 A、參照基因 B、參照基因 C、參照位點D共4個參照基因的內(nèi)對照DNASEQ ID NO:51-54。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的F11基因拷貝數(shù)變異檢測試劑盒，其特征在于：所述的每對 引物中有一個5'端突光素標(biāo)記。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的F11基因拷貝數(shù)變異檢測試劑盒，其特征在于：所述熒光素 可選用 FAM、HEX、VIC、NED、PET、TAMRA、R0X、熒光素、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、CY3. 5、 CY5. 5、TET、TAMRA、JOE、BODIPY TMR、俄勒岡綠、羅丹明綠、羅丹明紅、德克薩斯紅或雅基馬 黃。
【文檔編號】C12Q1/68GK104120190SQ201410395660
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年8月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月13日
【發(fā)明者】王學(xué)鋒, 姜正文, 丁秋蘭, 王鵬, 戴菁, 張希, 陸曄玲, 林琳 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院, 天昊生物醫(yī)藥科技（蘇州）有限公司