一種外切型瓊膠酶及其編碼基因與應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種外切型瓊膠酶及其編碼基因與應用，一種外切型瓊膠酶AgaO，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。編碼所述外切型瓊膠酶AgaO的基因，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。本發(fā)明所述的瓊膠酶AgaO降解瓊脂糖過程中寡糖主產(chǎn)物始終是新瓊二糖，且酶的性質(zhì)穩(wěn)定，具備工業(yè)應用的潛質(zhì)。
【專利說明】一種外切型瓊膠酶及其編碼基因與應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種外切型瓊膠酶及其編碼基因與應用，屬于基因工程【技術領域】。

【背景技術】
[0002] 瓊膠（Agar)主要產(chǎn)自江蘺、紫菜等食用紅藻，與褐藻膠、卡拉膠并稱產(chǎn)量最大、用 途最廣的三大海洋多糖，廣泛應用于食品、醫(yī)藥和化工行業(yè)。瓊脂糖（Agarose)是瓊膠的主 要成分之一，屬中性多糖，其分子主鏈由二糖單元（3-6-內(nèi)醚-L-吡喃半乳糖-a 1-3-吡喃 半乳糖）通過β 1-4糖苷鍵重復交替鏈接而成。瓊膠酶（Agarase)能催化瓊脂糖分子中 糖苷鍵的水解，產(chǎn)生水溶性的低聚糖和寡糖，并因所催化糖苷鍵的類型不同，分為α -瓊膠 酶、β -瓊膠酶；所對應的寡糖產(chǎn)物分別以3, 6-內(nèi)醚-a -L-吡喃半乳糖（Α)、β -D-吡喃半 乳糖（G)為還原性末端，稱之為瓊寡糖（Agaro_oligosaccharides，AOs)、新瓊寡糖（Neoaga ro-oligosaccharides, NAOs)〇
[0003] 近年的研究發(fā)現(xiàn)，瓊脂糖的降解產(chǎn)物一低聚糖組分具有抗炎癥、抗氧化、促進腸 道有益菌群生長等重要生物活性。特別值得注意的是，構成瓊脂糖分子的基本單元一新瓊 二糖具有抑制黑色素分泌、促進皮膚增白的效果，且未見毒副作用，表明具有更大的應用潛 力與更高的經(jīng)濟價值。因此，新瓊二糖的快速、高效制備技術備受關注。
[0004] 與化學降解法相比，瓊脂糖的酶法降解具有酶學反應的多種優(yōu)點，如條件溫和可 控、污染小且能耗低等綠色環(huán)保、高效的特征。因此，瓊膠酶的用途較為廣泛，如：降解瓊脂 糖凝膠并從中回收DNA分子、消化海藻組織碎片以制備原生質(zhì)體、降解瓊膠以制備低聚糖 或寡糖等。瓊膠酶的基因還可在微生物的基因表達載體中被用作報告基因，并用于分泌型 信號肽序列的篩選。這表明瓊膠酶及瓊膠酶基因的資源開發(fā)具有重要的經(jīng)濟價值與應用前 旦 -5^ 〇
[0005] 但是，通過酸降解、堿降解等化學方法，或者超聲降解、微波降解等物理學方法，降 解瓊膠或瓊脂糖后，其寡糖產(chǎn)物的聚合度較為多樣，迄今無法實現(xiàn)二糖的專一性生產(chǎn)。
[0006] 目前僅見發(fā)明專利申請CN103540579A(申請?zhí)?01310464445)公開了一種β-瓊 膠酶及其應用，即一種能夠降解瓊脂糖產(chǎn)生單一的新瓊2糖的β -瓊膠酶，其氨基酸序列為 SEQ ID Ν0:1。該發(fā)明的β-瓊膠酶能夠降解瓊脂糖產(chǎn)生單一的新瓊2糖，因此可以用于純 的新瓊2糖的制備。該發(fā)明所述的β -瓊膠酶AgWH50C來源于淡黃色噬瓊膠菌WH0801，降 解瓊脂糖后的主產(chǎn)物是新瓊二糖，可以用于純的新瓊2糖的制備。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種外切型瓊膠酶及其編碼基因與應用，該外 切型瓊膠酶能夠降解瓊脂糖并專一性產(chǎn)生新瓊二糖。
[0008] -種外切型瓊膠酶AgaO,氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0009] 編碼上述外切型瓊膠酶AgaO的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0010] 一種重組表達載體，在表達載體中插入了上述外切型瓊膠酶AgaO的編碼基因。
[0011] 一種重組菌或轉(zhuǎn)基因細胞系，在宿主細胞或細胞系中插入了上述切型瓊膠酶AgaO 的編碼基因。
[0012] 上述外切型瓊膠酶AgaO在分解瓊膠或制備新瓊二糖中的應用。
[0013] 有益效果
[0014] 1、本發(fā)明所述的瓊膠酶AgaO,由火色桿菌屬細菌（Flammeovirga yaeyamensis) MY04的基因組編碼，是火色桿菌屬細菌中首次報道的外切型瓊膠酶，與文獻已報道的該菌 株來源的以新瓊四糖和新瓊六糖為最終產(chǎn)物的內(nèi)切型瓊膠酶AgaG4不同，且瓊膠酶AgaO的 氨基酸序列及編碼基因序列與已有專利所涉及的任何瓊膠酶均顯著不同；其降解瓊脂糖過 程中寡糖主產(chǎn)物始終是新瓊二糖，且酶的性質(zhì)穩(wěn)定，具備工業(yè)應用的潛質(zhì)。
[0015] 2、本發(fā)明制備的外切型瓊膠酶AgaO對瓊脂糖的比活為191U/mg、對瓊膠的比活為 115U/mg ;適用于新瓊二糖的專一'丨生生產(chǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1、重組外切型瓊膠酶rAgaO表達及純化情況的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖 (SDS-PAGE)；
[0017] 其中：M、蛋白質(zhì)分子量標準，條帶自上至下大小為116kD，66. 2kD，45kD，35kD， 25kD，18. 4kD，14. 4kD ;泳道1、對照菌株破壁前菌體，上樣量10 μ L，泳道2、重組菌破壁前菌 體，上樣量10 μ L，泳道3、重組菌破壁后上清，上樣量10 μ L，泳道4、經(jīng)鎳柱純化的rAgaO,上 樣量10 μ L。
[0018] 圖2、溫度對重組瓊膠酶rAgaO的活性影響曲線；
[0019] 圖3、pH值對重組瓊膠酶rAgaO的活性影響曲線；
[0020] 圖4、溫度對重組瓊膠酶rAgaO的穩(wěn)定性影響曲線；
[0021] 圖5、pH值對重組瓊膠酶rAgaO的穩(wěn)定性影響曲線；
[0022] 圖6、金屬離子對重組瓊膠酶rAgaO活性的影響柱形圖；
[0023] 圖7、外切型瓊膠酶rAgaO不同時間降解瓊脂糖所得產(chǎn)物的TLC分析圖；
[0024] 圖8、外切型瓊膠酶rAgaO不同時間降解還原性末端被熒光標記的新瓊六糖的產(chǎn) 物的HPLC分析圖；

【具體實施方式】
[0025] 以下實施例的闡述，是為了全面公開本發(fā)明如何實施的一些常用技術，而不是為 了限制本發(fā)明的應用范圍。發(fā)明人已經(jīng)盡最大努力確保實施例中個參數(shù)的準確性（例如 量，溫度，等等），但是一些實驗誤差和偏差也應該予以考慮。除非另有說明，本發(fā)明中分子 量是指重均分子量，溫度是攝氏度。
[0026] 生物材料來源
[0027] 火色桿菌（Flammeovirga yaeyamensis)MY04來源于中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC N0. 2777,地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號 中國科學院微生物研究所，保藏日期2008年11月27日。
[0028] 實施例1、火色桿菌（Flammeovirga yaeyamensis)MY04菌株基因組DNA的提取
[0029] 將火色桿菌（Flammeovirga yaeyamensis)MY04接種至液體培養(yǎng)基YT04中，在 28°C、200rpm的條件下，振蕩培養(yǎng)至600nm吸光值（0D_)為1.2 ;取培養(yǎng)菌液10mL，在 12,000\8&，地球引力常數(shù)）條件下離心1511^11，收集菌體沉淀；用101^的溶菌酶緩沖液 (10mM Tris-HCl，pH8. 0)懸浮菌體，在12, OOOrmp條件下離心15min，收集菌體沉淀。
[0030] 上述液體培養(yǎng)基YT04的每升組分如下：
[0031] 胰蛋白胨l〇g、酵母提取物5. Og、氯化鈉30g，水定容至1L，pH 7. 2。
[0032] 向上述菌體沉淀中，每管加入溶菌酶緩沖液6. OmL，得到約7. OmL的菌液，分別加 入濃度為20mg/mL的溶菌酶溶液各280 μ L，使溶菌酶終濃度為800 μ g/mL ;置于冰水浴中 1. 〇h，然后轉(zhuǎn)移至37°C水浴中，溫浴2h，至反應體系粘稠；加入濃度為100mg/mL的十六烷基 磺酸鈉溶液〇. 41mL、100mg/mL的蛋白酶K溶液30 μ L，在52°C溫浴1. Oh ;加入Tris-平衡過 的酚/氯仿/異戊醇（體積比25 :24:1)溶液7.5mL，輕輕顛倒混勻；在10,000Xg、4°C條件 下離心lOmin，收集上清，并加入1. OmL的NaAc-HAc (pH5. 2, 3. 0M)緩沖液，以及8. 5mL的無 水乙醇，充分混勻；用〇. 5mL的槍頭挑出絲狀DNA，轉(zhuǎn)移至1. 5mL的EP離心管中，以70%乙 醇（貯于-20°C )，洗滌2次，微離心后棄掉上清；在10,000父8、41：條件下離心21^11，徹底 棄掉上清；將DNA沉淀于無菌工作臺中風吹干燥，然后用無菌去離子水在4°C過夜溶解DNA 樣品，制得基因組DNA。
[0033] 實施例2、火色桿菌（Flammeovirga yaeyamensis)MY04菌株基因組的掃描及其序 列分析。
[0034] 將實施例1制得的基因組DNA，采用焦磷酸測序技術進行基因組的掃描 測序，由上海美吉生物公司完成。用NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)網(wǎng)站的在線軟件對DNA測序結果進行分 析。所用到的 NCBI 網(wǎng)站的分析軟件是 Open Reading Frame Finder (0RF Finder, http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)和 Basic Local Alignment Search Tool(BLAST, http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)〇
[0035] 上述生物學軟件的分析結果顯示，火色桿菌（Flammeovirga yaeyamensis)MY04菌 株基因組DNA上攜帶一個瓊膠酶的編碼因 agaO,基因 agaO的編碼區(qū)長2118bp，其核苷酸序 列如SEQ ID NO. 1所示?；?agaO所編碼的瓊膠酶AgaO共含有705個氨基酸，其氨基酸序 列如SEQIDN0·2所不。瓊膠酶Aga0與BacteroidalesbacteriumCF的全基因組序列中 基因編碼的由677個氨基酸組成的瓊膠酶（NCBI注冊號：AGY53973)有39%的同源性。用 生物學軟件BioEdit7. 0. 5. 3進行分析，顯示蛋白質(zhì)AgaO的理論分子量約為81. 3kD。用信 號膚在線預測軟件 SignalP4. lServer(http://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/)在 線分析，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列中不含有分泌型信號肽。
[0036] 實施例3、基因 agaO在大腸桿菌T0P10菌株中的重組表達
[0037] 以實施例1制得的基因組DNA為模板，進行PCR擴增。引物序列如下：
[0038] if 向引物 BAga〇-F :5' -GCCGCTCGAGTTTTTTTTAGCATTCAATCCGCC-3' (Xho I)；
[0039] 反向引物 BAga〇-R :5' -GCCGTCTAGAAAGTTATTCACATTACCCAAACGG-3' (Xba I)；
[0040] 正向引物BAga〇-F中下劃線標注的是限制性內(nèi)切酶Xho I位點，反向引物BAga〇-R 下劃線標注的是限制性內(nèi)切酶Xba I位點。所用高保真DNA聚合酶Primerstar HS購自中 國大連寶生物公司，所用PCR反應試劑按照該公司提供的產(chǎn)品說明進行操作。
[0041] PCR 反應條件：95°C預變性 4min ;94°C變性 40s，60°C退火 40s，72°C延伸 140s，35 個循環(huán)；72°C延伸5min ;4°C穩(wěn)定15min。
[0042] 將PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Xho I和Xba I進行雙酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳回收 酶切后的PCR產(chǎn)物。將購于美國Novagen公司的產(chǎn)品pBAD/g III A質(zhì)粒DNA，用Xho I和 Xbal雙酶切，進行瓊脂糖凝膠電泳并回收酶切后的產(chǎn)物片段。限制性內(nèi)切酶Xho I和Xba I均購于中國大連寶生物公司，酶切所用到的酶與底物反應的體系、溫度和時間，均按照該 公司提供的產(chǎn)品說明操作。
[0043] 將經(jīng)過Xho I和Xba I雙酶切的PCR產(chǎn)物，與同樣經(jīng)過雙酶切的pBAD/g III A 質(zhì)粒載體，在DNA連接酶的催化下進行接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α菌株，涂布于含有 50 μ g/mL氨芐青霉素的Luria-Bertani培養(yǎng)基固體平板上，37°C培養(yǎng)14h后，挑取單克??； 將單克隆接入含有50μ g/mL氨節(jié)青霉素的液體Luria-Bertani培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒； 將質(zhì)粒用正向引物BAga〇-F和反向引物BAga〇-R進行PCR驗證，結果得到大小為的2. lkb 的擴增產(chǎn)物，初步證明構建的重組質(zhì)粒正確；接著將該重組質(zhì)粒進行測序，結果表明，在 pBAD/g III A的Xho I和Xba I酶切位點之間插入SEQ ID NO. 1所示的基因 agaO,且插入 方向正確，所以進一步證明構建的重組質(zhì)粒正確，將該重組質(zhì)粒命名為pBAgaO。
[0044] 將重組質(zhì)粒pBAgaO轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株Top 10 (購自美國Novagen公司），然后按照 該公司提供的操作步驟，使用L-阿拉伯糖進行重組瓊膠酶rAgaO的誘導表達。并用Ni-丙 烯酰胺凝膠對rAga〇-BA進行純化，純化條件按照凝膠的產(chǎn)品手冊操作。用聚丙烯酰胺凝變 性膠電泳檢測重組瓊膠酶rAga〇-BA的純化情況。結果如圖1所示：經(jīng)L-阿拉伯糖誘導表 達后的ToplO菌體中，rAga〇-BA的產(chǎn)量不低于120mg/L菌體培養(yǎng)物；純化后的重組瓊膠酶 rAgaO在電泳膠上呈單一條帶，且位置與預測的分子量相吻合；經(jīng)分離制得重組酶rAgaO。
[0045] 實施例4、基因 agaO在大腸桿菌BL21 (DE3)菌株中的重組表達
[0046] 按照與實施例3相同的操作流程，以實施例1制得的基因組DNA為模板，進行PCR 擴增、載體構建，和重組蛋白質(zhì)的表達、純化，制得重組酶rAgaO。與實施例3的不同之處在 于：
[0047] (l)PCR所用引物如下：
[0048] 正向引物 22Aga〇-F : 5，-GCCGCATATGTTTTTTTTAGCATTCAATCCGCC-3，；
[0049] 反向引物 22Aga〇-R : 5，-GCCGCTCGAGAAGTTATTCACATTACCCAAACGG-3，；
[0050] 正向引物22Aga〇-F中下劃線標注的是限制性內(nèi)切酶Nde I位點，反向引物 22Aga〇-R下劃線標注的是限制性內(nèi)切酶Xho I位點。
[0051] ⑵克隆基因 agaO所用的載體是購自Invitrogen公司的pET-22b (+)質(zhì)粒DNA, 所構建重組質(zhì)粒命名為pE22-Aga0,所表達的重組酶命名為rAgaO。
[0052] (3)表達重組蛋白rAgaO所用的宿主細胞是大腸桿菌BL21 (DE3)菌株。
[0053] (4)誘導重組蛋白表達所用的誘導劑是異丙基硫代半乳糖苷（IPTG)，誘導時IPTG 的濃度是 〇· 001-0. 100mm〇l/L。
[0054] 實施例5、重組酶rAgaO最適溫度的測定
[0055] 用去離子水配制質(zhì)量體積濃度為0. 1 %的瓊脂糖底物，加熱溶解后，置于0°C、 10°C、20°C、25°C、30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、70°C水浴環(huán)境中降溫 lh。向每 450 μ L底物中添加實施例4制得的重組酶rAgaO的稀釋液50 μ L，重組酶rAgaO濃度為 5 μ g/mL，混勻后繼續(xù)反應，隔時取樣。每個溫度條件下3個平行樣品，以沸水浴滅活的重組 酶制劑為對照組。用DNS-還原糖法測定各反應體系中新生成的還原糖濃度（0D540)，并計 算平均值，進行偏差分析。最大吸收值對應的反應溫度為重組酶的最適溫度，相對酶（RA) 活定義為：各吸收值與最大吸收值的百分比。結果如圖2所示：rAgaO在45°C反應時達到最 大活力，表明rAgaO的最適反應溫度是45°C。
[0056] 實施例6、重組酶rAgaO最適pH的測定
[0057] 分別用濃度為50mM的NaAc-HAC緩沖液、50mM的NaH2P0 4_Na2HP04緩沖液、50mM的 Tris-HCl緩沖液，與瓊脂糖配制終濃度為0. 10%的瓊脂糖底物，所對應的pH值分別為5、6、 6. 5,6、6. 5、7、7. 5、8,7. 5、8、9、10等三個區(qū)段，各pH值均在最適溫度下調(diào)定。將底物加熱溶 解后，置于最適溫度中降溫lh，然后向每450 μ L底物中添加實施例4制得的重組酶rAgaO 的稀釋液50 μ L，混勻后繼續(xù)反應，隔時取樣。每個pH條件下3個平行樣品，以沸水浴滅活 的重組酶制劑為對照組。用DNS-還原糖法測定各反應體系中新生成的還原糖濃度（0D 54Q)， 并計算平均值和偏差。相對酶（RA)活定義為：各組平均吸收值與最大吸收值的百分比。最 大吸收值對應的pH為重組酶的最適pH。結果如圖3所示：rAgaO在pH7. 0時達到最大活 力，表明rAgaO的最適反應pH為7.0(如圖3)。
[0058] 實施例7、重組酶rAgaO的溫度穩(wěn)定性分析
[0059] 將在不同溫度（0°C?70°C )下熱處理lh后的實施例4制得的重組酶rAgaO酶 液，與質(zhì)量體積濃度（g/mL)為0. 1 %的瓊脂糖或瓊膠溶液按1 :9(體積比）的比例混合，然 后在最適溫度和最適pH下測定剩余酶活，以不經(jīng)過熱處理的酶液酶活定義為100%相對活 力。結果如圖4所示：rAgaO在低于40°C的溫度下具有較好的熱穩(wěn)定性（如圖4)。
[0060] 實施例8、重組酶rAgaO的pH穩(wěn)定性分析
[0061] 將在最適溫度（45°C )、不同的pH(pH5?10)環(huán)境中預孵育lh后的實施例4制得 的重組酶rAgaO酶液與質(zhì)量濃度為0. 1 %的瓊脂糖或者瓊膠底物溶液按1 :9 (體積比）的 比例混合，然后在最適溫度和最適pH下測定剩余酶活，以不經(jīng)過pH處理的酶液酶活定義為 100 %相對活力。結果如圖5所示，在PH5-9的范圍內(nèi)預處理lh, rAgaO酶活仍保持60%以 上。這表明rAgaO對pH值耐受范圍較廣（如圖5)。
[0062] 實施例9、金屬離子對重組酶rAgaO活性的影響
[0063] 將用去離子水配置的質(zhì)量濃度為0. 1 %瓊脂糖或瓊膠底物、實施例4制得的重組 酶rAgaO酶液、以及水按2 :1 :3(體積比）的比例混合后，接著向反應體系中添加不同的金 屬離子，添加的離子終濃度為ImM或10mM，然后在45°C反應40min，按前述的DNS-還原糖 法測酶的活力。對照組為不加任何金屬離子時rAgaO的活性（設定為100% )。結果圖6 所示，在ImM或10mM濃度下：（l)Na+、K+、Li+等三種一價金屬試劑對rAgaO的活性表現(xiàn)為微 弱的促進作用，Ag+具有顯著抑制作用；(2) Mg2+二價金屬例子對酶活具有促進作用，其余二 價、三價金屬離子均顯示抑制活性；（3)GlyCer〇l、β -巰基乙醇等2種化學試劑有促進活 性。此外，Mg2+和Glycerol等2種試劑在ImM、10mM濃度下分別使酶活提高至124. 9%和 140. 9%，具有顯著促進活性。
[0064] 實施例10、DNS-還原糖法測定重組酶rAgaO的酶活
[0065] 將質(zhì)量濃度為0. 1%的瓊脂糖、濃度為5μ g/mL的重組酶rAgaO酶液、150mmol/L 的NaH2P04-Na2HP04(pH7.0)緩沖液以及水按2 :1 :3 :3(體積比）的比例混合后，45°C下反應 40min。將反應產(chǎn)物在沸水浴中加熱10min，轉(zhuǎn)入冰水浴中5min，在12,000Xg、4°C條件下 離心5min，收集上清；將一定體積的上清與等體積的DNS (3, 5-對硝基二甲苯）-反應液混 勻，在沸水浴中加熱lOmin，降至室溫后在540nm測定吸收值。用分析純D-半乳糖作標準 品，同樣方法操作，繪制D-半乳糖的摩爾濃度與0D 54(I之間的量效關系曲線。用購于上海生 工生物工程有限公司的蛋白質(zhì)定量試劑盒測定rAgaO酶液的蛋白含量。按照國際標準定義 計算酶的活力單位，即在標準條件下，每分鐘內(nèi)產(chǎn)生1 μ mol產(chǎn)物所需的酶量為1個IU。結 果表明：以瓊脂糖為底物，重組rAgaO對的比活為190U/mg，以瓊膠為底物，rAgaO的比活為 125U/mg。
[0066] 實施例11、重組酶rAgaO降解瓊脂糖的產(chǎn)物的薄板層析（TLC)分析
[0067] 用去離子水配制質(zhì)量體積濃度（g/mL)為0. 1 %的瓊脂糖底物，加熱溶解后，置于 45°C水浴環(huán)境中降溫lh。向每450 μ L底物中添加實施例4制得的重組酶rAgaO的稀釋 液50 μ L，混勻后繼續(xù)反應，隔時取樣。將反應產(chǎn)物在沸水浴中加熱10min，轉(zhuǎn)入冰水浴中 5min。在12,000Xg、4°C條件下離心5min，收集上清。取0. 5yL上清，上樣于娃膠薄板 (Merck公司，Silca Gel60F254)上，在流動相為正丁醇：乙醇：水的體積比為2:1:1的條件 下展開45min。用含有新瓊二糖、新瓊四糖、新瓊六糖、新瓊八糖和新瓊十糖的混合寡糖，作 為分子量標準物進行參照實驗。將含有二苯胺的顯色劑（二苯胺：苯胺：85%磷酸：丙酮= lg :lmL :10mL :100mL)噴于娃膠板的表面，風干后將娃膠板置于110°C加熱10min以顯色。 結果如圖所示，重組酶rAgaO降解瓊脂糖后的寡糖主產(chǎn)物是單一的，且與新瓊二糖的展開 系數(shù)一致。這提示rAgaO是以新瓊二糖為單一主產(chǎn)物的瓊脂糖外切酶。
[0068] 實施例12、重組酶rAgaO酶切模式的熒光-高效液相色譜（HPLC)分析
[0069] 取約含10μ g新瓊六糖的溶液，旋轉(zhuǎn)蒸干。參照文獻方法，加入含過量鄰氨基苯甲 酰胺（2-AB)、硼腈化鈉的二甲亞砜（DMS0)溶液，混勻后置60°C水浴中溫育2h。旋轉(zhuǎn)蒸干， 加入500 μ L去離子水溶解樣品，將樣品與200 μ L氯仿共振蕩，離心，收集上清。繼續(xù)用氯 仿反復抽提，不少于7次，得到還原性末端被熒光標記了的新瓊六糖（2-ΑΒ-ΝΑ6)。同樣方法 標記新瓊寡糖分子量標準物。
[0070] 取上述 2-ΑΒ-ΝΑ6 樣品、150mmol/L 的 NaH2P04-Na2HP04 (ρΗ7. 0)緩沖液、實施例 4 制 得的重組酶rAgaO的稀釋液，按照體積比1:1:1混勻，置于45°C水浴中反應0?12h，隔時 取樣。將反應體系置沸水浴中l(wèi)〇min，轉(zhuǎn)至冰水浴5min，在12,000Xg、4°C條件下離心至少 15min。收集上清，作為重組酶rAgaO的寡糖降解產(chǎn)物。以預先在沸水浴中加熱10min的 rAgaO酶液，做陰性對照反應。
[0071] 用濃度為 0· 20mol/L 的 NH4HC03 溶液，平衡 Superdex P印tidel0/300GL(GE 公司） 分子凝膠色譜柱，流速0. 40mL/min，至少2柱床。將述2-AB-NA6及其不同酶解時間的樣品， 以自動進樣器加載20 μ L/樣品，其它條件不變，330nm激發(fā)，420nm檢測。用HPLC操作軟件， 分析各寡糖組分的積分面積，計算相對摩爾濃度。參照分子量標準物的信號，確定各寡糖的 相對分子量。
[0072] 如圖8所示，rAgaO降解2-AB-NA6后先產(chǎn)生熒光標記的新瓊四糖，再將2-AB-NA4 降解產(chǎn)生熒光標記的新瓊二糖（2-AB-NA2)，并最終徹底降解成與初始底物2-AB-NA6等摩 爾的2-AB-NA2。這表明外切型瓊膠酶AgaO是從底物的非還原性末端降解得到新瓊二糖的。
【權利要求】
1. 一種外切型瓊膠酶AgaO,氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2. 編碼權利要求1所述外切型瓊膠酶AgaO的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
3. -種重組表達載體，在表達載體中插入了權利要求2所述外切型瓊膠酶AgaO的編碼 基因。
4. 一種重組菌或轉(zhuǎn)基因細胞系，在宿主細胞或細胞系中插入了權利要求2所述切型瓊 膠酶AgaO的編碼基因。
5. 權利要求1所述外切型瓊膠酶AgaO在分解瓊膠或制備新瓊二糖中的應用。
【文檔編號】C12N9/38GK104152427SQ201410396060
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月12日 優(yōu)先權日:2014年8月12日
【發(fā)明者】李福川, 韓文君, 程媛媛, 方玉春, 古靜燕, 高長健, 劉生云 申請人:山東大學