高通量篩選玉米內參基因的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高通量篩選玉米內參基因的方法，該方法利用源于具有高度多樣性的不同玉米自交系、不同組織、不同發(fā)育時期以及不同脅迫處理后構建的高通量轉錄組測序(RNA-seq)數(shù)據(jù)庫，大規(guī)模分析整個轉錄組的表達情況，篩選在不同發(fā)育時期、不同條件下表達最恒定的基因作為內參基因，為轉錄組表達研究提供準確的對照。本方法利用整個轉錄組數(shù)據(jù)，分析全基因組所有表達的基因，系統(tǒng)性地篩選玉米內參基因，相對傳統(tǒng)篩選方法更加準確、可靠。
【專利說明】高通量篩選玉米內參基因的方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及分子遺傳學領域，尤其涉及一種高通量篩選玉米內參基因的方法。

【背景技術】
[0002]基因表達(gene express1n)是指細胞在生命過程中，把儲存在脫氧核糖核酸(DNA)序列中的遺傳信息經(jīng)過轉錄和翻譯，轉變成具有生物活性的蛋白質分子。該過程決定了細胞的分化及形態(tài)的發(fā)生。每個基因轉錄產(chǎn)生信使核糖核酸(mRNA)的量，受到時空等多種因素的調控，最終影響個體的生長發(fā)育、形態(tài)結構及生物學功能?；蛘{控是現(xiàn)代分子生物學研究的中心課題之一。為研究基因表達調控的機制就必須了解不同基因在特定條件下的表達水平。在檢測基因表達量時取樣、上樣等實驗操作會對結果產(chǎn)生影響。為消除實驗誤差，就必須使用內源性參照基因作為參照物。在理論上，內參基因在各組織和細胞中的表達恒定，在檢測基因的表達水平變化時作為參照物，用于校正實驗誤差，保證結果的準確性。
[0003]常用的內源性參照基因多為已知持家基因，這類基因是指所有細胞中均表達的一類基因，其產(chǎn)物對維持細胞基本生命活動是必需的，如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因與核糖體蛋白基因等。早期人們認為持家基因在不同組織和不同發(fā)育時期的表達量也是一致的，但隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)不同持家基因在不同條件下的表達量也有差異。因此，發(fā)掘表達恒定的內參基因對基因表達調控的研究至關重要。
[0004]目前，玉米內參基因的篩選主要是先選擇幾個或十幾個候選持家基因，然后分析比較它們在不同條件下的表達變異，選擇相對表達最穩(wěn)定的一個作為內參基因。需要說明的是，這種方法篩選內參基因的覆蓋面非常低，其是根據(jù)之前界定的部分持家基因，僅僅比較部分持家基因的表達穩(wěn)定性，數(shù)據(jù)量太小，不足以篩選出真正表達穩(wěn)定的內參基因。


【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術問題是解決現(xiàn)有技術中篩選內參基因的方法覆蓋面較低，數(shù)據(jù)量較小，不足以選擇出真正表達穩(wěn)定的內參基因的缺陷。
[0006]為了解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案如下:一種高通量篩選玉米內參基因的方法，選擇源于具有高度多樣性的不同玉米自交系、不同組織、不同發(fā)育時期以及不同脅迫處理后構建的高通量轉錄組測序(RNA-seq)數(shù)據(jù)庫，其篩選步驟如下:
[0007](I)利用SolexaQA軟件將RNA-seq的數(shù)據(jù)進行過濾，除去比較差的數(shù)據(jù)，留下質量較聞的序列；
[0008](2)利用Bowtie軟件將得到的序列錨定到參考基因組上，當一個序列能夠錨定到基因組上的不同位點，則除去該序列，只選擇在基因組中有單一位點的序列；
[0009] (3)使用 Cuff links 軟件計算各轉錄本的 FPKM 值(fragments per kilobase oftranscript per mill1n mapped reads),去掉FPKM小于10的轉錄本,余下的轉錄本用于后續(xù)分析；
[0010](4)利用NormFinder軟件計算所有基因在不同條件下的表達穩(wěn)定性系數(shù)，選取不同RNA-seq數(shù)據(jù)庫中都能達到前20%穩(wěn)定表達的基因，并整合分析不同品種、不同組織、不同發(fā)育時期以及不同脅迫處理后得到的所有RNA-seq數(shù)據(jù)庫，篩選在不同RNA-seq數(shù)據(jù)庫中都能穩(wěn)定表達的基因作為候選內參基因；
[0011](5)選取不同品種進行脅迫處理，在不同發(fā)育時期取樣提取RNA，根據(jù)候選內參基因的序列設計特異引物，通過qPCR檢測候選內參基因及現(xiàn)有內參基因的表達水平，利用NormFinder計算各內參基因在不同條件下的表達穩(wěn)定性系數(shù)，比較候選內參基因與現(xiàn)有內參基因在不同材料及不同處理條件下的表達穩(wěn)定性，選擇最優(yōu)內參基因。
[0012]進一步的，所述步驟(1)中比較差的數(shù)據(jù)為Phred值低于20、長度小于20bp的數(shù)據(jù)。
[0013]本發(fā)明的高通量篩選玉米內參基因的方法，其有益效果包括:
[0014](I)使用高通量轉錄組測序(RNA-seq)的數(shù)據(jù)，大規(guī)模分析整個轉錄組的表達情況，篩選在不同發(fā)育時期、不同條件下表達最恒定的基因作為內參基因，系統(tǒng)性篩選地內參基因相對現(xiàn)有內參基因更加準確、可靠。
[0015](2)使用高通量轉錄組測序(RNA-seq)的數(shù)據(jù)，能夠同時篩選整個玉米基因組所有的表達基因，大大提聞了選擇的效率。
[0016](3)目前已知源于不同品種、不同組織、不同發(fā)育時期以及不同脅迫處理的RNA-seq數(shù)據(jù)庫已經(jīng)超過50個，屬于公開資源，可直接在網(wǎng)站上下載使用，通過數(shù)據(jù)分析選擇出候選內參基因后，再通過qPCR驗證其表達穩(wěn)定性，大大減少了實驗工作量，降低了實驗成本。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為本實施例高通量篩選玉米內參基因方法的流程圖；
[0018]圖2為利用本實施例高通量篩選玉米內參基因方法獲得的內參基因(DPP9、DUF)與現(xiàn)有內參基因(ACT和GAPDH)的表達穩(wěn)定性示意圖。

【具體實施方式】
[0019]下述實施例中實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)實驗方法。下述實施例中所述的實驗試劑及耗材如無特殊說明，均來自常規(guī)生化試劑公司。
[0020]下面結合附圖與【具體實施方式】對本發(fā)明的高通量篩選玉米內參基因的方法作進一步的詳細說明。
[0021]本實施例為高通量篩選玉米內參基因的方法，選擇源于具有高度多樣性的不同玉米自交系、不同組織、不同發(fā)育時期以及不同脅迫處理后構建的高通量轉錄組測序(RNA-seq)數(shù)據(jù)庫，其篩選步驟如圖1所示，包括:
[0022](I)利用SolexaQA軟件將RNA-seq的數(shù)據(jù)進行過濾，除去Phred值低于20、長度小于20bp的質量比較差的數(shù)據(jù)，留下質量較高的序列；
[0023](2)利用Bowtie軟件將測序得到的序列錨定到參考基因組上，當一個序列能夠錨定到基因組上的不同位點，則除去該序列，只選擇在基因組中有單一位點的序列；
[0024](3)使用 Cuff links 軟件計算各轉錄本的 FPKM 值(fragments per kilobase oftranscript per mill1n mapped reads),去掉FPKM小于10的轉錄本,余下的轉錄本用于后續(xù)分析；
[0025](4)利用NormFinder軟件計算所有基因在不同條件下的表達穩(wěn)定性系數(shù)，選取不同數(shù)據(jù)庫中都能達到前20%穩(wěn)定表達的基因，整合分析不同品種、不同組織、不同發(fā)育時期以及不同脅迫處理后得到的所有RNA-seq數(shù)據(jù)庫，篩選在不同數(shù)據(jù)庫中都能達到前20%穩(wěn)定表達的基因作為候選內參基因；
[0026](5)選取 9 個不同玉米品種(B73、Mol7、Z1144、Ky21、M37W、M162W、Mol4、Mo28 以及Mo51)，種子發(fā)芽24小時后移栽至盆缽中。從三葉期開始進行氮處理，每隔兩天施尿素一次，對照組只澆水。發(fā)芽20天、40天后取葉片利用TRIzol方法提取RNA，用TransScriptgDNA去除及cDNA合成試劑盒反轉錄為cDNA。隨機選擇兩個候選內參基因DPP9、DUF (序列號分別為:GRMZM2G174572，GRMZM2G163888)，根據(jù)候選內參基因及現(xiàn)有內參基因ACT和GAPDH(序列號分別為:GRMZM2G126010，GRMZM2G046804)的序列用軟件Primer (3)設計引物，其引物如表1所示。
[0027]表1通過Primer3設計的內參基因的qPCR引物序列
[0028]

【權利要求】
1.高通量篩選玉米內參基因的方法，其特征在于:選擇源于具有高度多樣性的不同玉米自交系、不同組織、不同發(fā)育時期以及不同脅迫處理后構建的高通量轉錄組測序(RNA-seq)數(shù)據(jù)庫，其篩選步驟如下: (1)利用SolexaQA軟件將RNA-seq的數(shù)據(jù)進行過濾，除去比較差的數(shù)據(jù)，留下質量較高的序列； (2)利用Bowtie軟件將得到的序列錨定到參考基因組上，當一個序列能夠錨定到基因組上的不同位點，則除去該序列，只選擇在基因組中有單一位點的序列； (3)使用Cuff links 軟件計算各轉錄本的 FPKM 值(fragments per kilobase oftranscript per mill1n mapped re ads),去掉FPKM小于10的轉錄本,余下的轉錄本用于后續(xù)分析； (4)利用NormFinder軟件計算所有基因在不同條件下的表達穩(wěn)定性系數(shù)，選取不同數(shù)據(jù)庫中都能達到前20%穩(wěn)定表達的基因，并整合分析不同品種、不同組織、不同發(fā)育時期以及不同脅迫處理后得到的所有RNA-seq數(shù)據(jù)庫，篩選在不同數(shù)據(jù)庫中都能穩(wěn)定表達的基因作為候選內參基因； (5)選取不同品種進行脅迫處理，在不同發(fā)育時期取樣提取RNA，根據(jù)候選內參基因的序列設計特異引物，通過qPCR檢測候選內參基因及現(xiàn)有內參基因的表達水平，利用NormFinder軟件計算各內參基因在不同條件下的表達穩(wěn)定性系數(shù)，比較候選內參基因與現(xiàn)有內參基因在不同材料及不同處理條件下的表達穩(wěn)定性，選擇最優(yōu)內參基因。
2.按照權利要求1所述的高通量篩選玉米內參基因的方法，其特征在于:所述步驟(1)中比較差的數(shù)據(jù)為Phred值低于20、長度小于20bp的數(shù)據(jù)。
【文檔編號】C12Q1/68GK104131107SQ201410396506
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年8月12日 優(yōu)先權日:2014年8月12日
【發(fā)明者】林峰, 趙涵 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學院