一種岷江百合病程相關(guān)蛋白10基因LrPR10-5的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種岷江百合病程相關(guān)蛋白10基因LrPR10-5的應(yīng)用，LrPR10-5的核苷酸序列如SEQIDNO：1所述，編碼病程相關(guān)蛋白10蛋白，本發(fā)明通過功能基因組學(xué)相關(guān)技術(shù)研究證實(shí)LrPR10-5基因具有提高植物抗真菌的功能，將本發(fā)明抗真菌LrPR10-5基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體上并轉(zhuǎn)入煙草中過量表達(dá)，結(jié)果轉(zhuǎn)基因煙草植株具有很強(qiáng)的體外抗真菌活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明超表達(dá)LrPR10-5的轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)灰葡萄孢、立枯絲核菌以及核盤菌等多種真菌的生長具有明顯的抑制作用。
【專利說明】—種岷江百合病程相關(guān)蛋白10基因LrPR10-5的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)以及基因工程相關(guān)技術(shù)研究領(lǐng)域，特別是一種具有抗真菌活性的岷江百合病程相關(guān)蛋白10基因LrPR10-5的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]植物病害是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一個(gè)非常棘手的問題，尤其是真菌病害，約占到植物總病害的80%，嚴(yán)重影響著農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。依靠植物育種培育抗性品種、使用化學(xué)農(nóng)藥或采取輪作等耕作制度等傳統(tǒng)病害防治方法取得了一定成效，然而這些方法均存在或多或少的弊端，如傳統(tǒng)育種周期長、化學(xué)農(nóng)藥殘留高且易對(duì)環(huán)境造成污染且費(fèi)時(shí)費(fèi)力等，所以傳統(tǒng)控制植物病害的方法不能徹底植物真菌病害的問題。隨著重組DNA技術(shù)的創(chuàng)立和發(fā)展，利用基因工程技術(shù)來培育植物新品種以應(yīng)對(duì)真菌病害已取得初步成效，且有望從根本上解決真菌病害問題。
[0003]植物在生長發(fā)育過程中常遭受多種生物和非生物因子的脅迫，如干旱、寒冷、真菌侵染等，因此進(jìn)化出一系列的防御機(jī)制來抵御逆境脅迫，其中病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related protein,PR)的激活和積累是植物防御反應(yīng)的重要組成部分。根據(jù)其結(jié)構(gòu)、親源關(guān)系和生物活性，PR蛋白一般分為17個(gè)家族(PR1-PR17)，廣泛存在于單子葉植物和雙子葉植物中。1988年，Somssich等用激發(fā)子處理歐芹細(xì)胞首次發(fā)現(xiàn)PR-10蛋白(Somssich IE, Schmelzer E, Kawalleck P, et al.Gene structure and in situtranscript localizat1n of pathogenesis-related protein I in parsley.Mol GenGenet, 1988，213: 93-98)，隨后在水稻、辣椒、刺茄、和花生等植物中相繼發(fā)現(xiàn)PR-10家族成員，但至今仍未見到此種蛋白出現(xiàn)在非植物組織中的報(bào)道。大部分的PR蛋白為胞外蛋白，而PR-1O則是典型的胞內(nèi)蛋白，存在于細(xì)胞溶質(zhì)中。另外，PR-1O還具有分子量較低(16-19 kDa)、等電點(diǎn)偏酸性以及三級(jí)結(jié)構(gòu)高度保守等特性。PR-1O與主要的樹木花粉過敏原和食物過敏原十分相似，并且屬于Bet V 1-1ike超家族。其二級(jí)結(jié)構(gòu)中存在一個(gè)高度保守的氨基酸序列GXGGXG (X為任意氨基酸)，被稱為“P-loop”基序。該基序廣泛存在于核酸結(jié)合蛋白中，并且其磷酸化可能與PR-1O的核糖核酸酶活性有關(guān)。
[0004]作為植物防御系統(tǒng)中的可誘導(dǎo)組分，PR-10受多種病原菌的誘導(dǎo)表達(dá)。刺茄 SsPR-1O 受 TMV 誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)(Liu XJ, Huang BB, Lin J, et al.A novelpathogenesis-related protein (SsPRlO) from Solanum surattense withribonucleolytic and antimicrobial activity is stress and pathogen-1nducible.J Plant Phys1l, 2006, 163: 546-555)。用歐文氏菌、假單胞菌、構(gòu)巢曲霉和青霉菌分別侵染紫草葉片，24 h后收集感染葉片和遠(yuǎn)離感染部位的葉片分別進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示病原菌能明顯誘導(dǎo)受侵害葉片中(紫草中的一種PR-10蛋白基因)的轉(zhuǎn)錄，而且在遠(yuǎn)離感染部位的葉片中病原菌也能系統(tǒng)性誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。這些結(jié)果表明基因能受多種病原體浸染而誘導(dǎo)表達(dá)(Hwang HJ, Kim H, Wang CS.Gene encodingpathogenesis-related 10 protein of protein of Lithospermum erythrorhizon isresponsive to exogenous stimuli related to the plant defense system.Plant Scij2003，165: 1297-1302)。將人參基因轉(zhuǎn)入煙草中使其超表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)辣椒疫霉和炭疽病菌的抗性增強(qiáng)(Pulla RKj Lee ORj In JGj et al.Express1n andfunct1nal characterizat1n of pathogenesis-related protein family 10 gene,PgPR10~2, from Panax ginseng C.A.Meyer.Phys1l moI plant pathol，2010，74:323-329) o超表達(dá)玉米的轉(zhuǎn)基因煙草可以抑制黃曲霉的生長(Chen ZYj BrownRLj Rajasekaran K，et al.1dentificat1n of a maize kernel pathogenesis-relatedprotein and evidence for its involvement in resistance to AspergiIlus flavasinfect1n and aflatoxin product1n.Phytopathology, 2006， 96: 87-95)
一些植物激素和抗病信號(hào)分子影響的表達(dá)模式。如脫落酸(abscicis acid,ΑΒΑ)、茉莉酸(jasmonic acid, JA)、赤霉素(gibberellic acid, GA3)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)、水楊酸(salicylicacid，SA)、乙烯等均在植物防御應(yīng)答中起作用。ABA主要在寒冷、高鹽和干旱脅迫中起作用，而JA是植物受機(jī)械損傷及病原菌侵染后的主要防御物質(zhì)。水稻中一個(gè)PR-10基因{RSOsPRlO、受JA誘導(dǎo)，但不受SA和ABA的誘導(dǎo)(Hashimoto Mj Kisseleva Lj Sawa S，et al.A novel rice PRlO protein, RSOsPRlO，specifically induced in roots by b1tic and ab1tic stresses, possibly via thejasmonic acid signaling pathway.Plant Cell Phys1l, 2004，45: 550-559)。石開究表明，SA、乙烯、MeJA可以顯著誘導(dǎo)辣椒的表達(dá)(Park CJ，Kim KJ，Shin R，etal.Pathogenesis-related protein 10 isolated from hot pepper funct1ns as aribonuclease in an antiviral pathway.Plant J， 2004， 37: 186-198)。
[0005]PR-10在病原菌入侵中起重要作用，并且PR-10蛋白具有體外抑菌功能，但其抗病機(jī)理尚不清晰。大多數(shù)PR-10的抑菌機(jī)制都被認(rèn)為與其核糖核酸酶活性有關(guān)。PR-10基因編碼的氨基酸序列中都存在一個(gè)高度保守的“GXGGXG”序列，被稱為“P-L00P”基序。該基序是一類廣泛存在于核酸酶結(jié)合蛋白以及磷酸化激酶中，該區(qū)域的磷酸化可能與其核糖核酸酶活性相關(guān)(Hoffmann-Sommergruber K，VanekKrebitz Mj Radauer C，et al.Genomiccharacterizat1n of members of the Bet v I family: genes coding for allergensand pathogenesis-related proteins share intron posit1ns.Gene, 1997， 197:91-100)。轉(zhuǎn)人參基因的煙草株系的核糖核酸酶活性與抗真菌活性均有所提高(Pulla RKj Lee ORj In JGj et al.Express1n and funct1nal characterizat1n ofpathogenesis-related protein family 10 gene, PgPR10~2, from Panax ginseng C.A.Meyer.Phys1l mo I plant pathol, 2010，74: 323-329)。煙草花葉病毒侵染辣椒后，
誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)增加了裂解病毒RNA的核糖核酸酶活性(Park CJj Kim KJj ShinRj et al.Pathogenesis-related protein 10 isolated from hot pepper funct1ns asa ribonuclease in an antiviral pathway.Plant J，2004，37: 186-198)。因此，植物PRlO的防御相關(guān)機(jī)制可能與其具有核糖核酸酶活性有關(guān)。
[0006]本發(fā)明的病程相關(guān)蛋白10基因LrPR10-5來自岷江百合{LiIium regaleWilson)。岷江百合又名王百合，多年生草本植物，我國的百合特有種。僅分布于川西岷江流域海拔800~2700m的河谷到山腰的巖石縫中，具有極強(qiáng)的抗病性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種具有抗真菌活性的岷江百合病程相關(guān)蛋白10基因LrPR10-5的應(yīng)用，即在提高煙草對(duì)灰葡萄孢、立枯絲核菌、核盤菌抗性中的應(yīng)用，LrPRlOS的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述，該基因cDNA全長序列為846bp，包含一個(gè)474bp的開放閱讀框、55bp的5’非翻譯區(qū)、317bp的3’非翻譯區(qū)，編碼如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
[0008]本發(fā)明中基因的編碼區(qū)是序列表SEQ ID NO:1中第56_529位所示的核苷酸序列。
[0009]本發(fā)明分離克隆岷江百合的一個(gè)抗真菌相關(guān)基因的完整cDNA片段，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)將目的基因轉(zhuǎn)入受體植物中并過量表達(dá)，通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該基因是否具有抗真菌的活性，為后期利用該基因改良煙草及其他植物抵御真菌病害的能力奠定基礎(chǔ)，發(fā)明人將這個(gè)基因命名為LrPR10-5。
[0010]PRlO是植物受生物或非生物脅迫后誘導(dǎo)產(chǎn)生并積累的一類蛋白質(zhì)，是植物防衛(wèi)體系的重要組成部分。PRlO蛋白廣泛存在于高等植物中，當(dāng)遭受病原體侵染時(shí)一些PRlO基因的表達(dá)量顯著增高。另外，植物激素和信號(hào)分子也可以使一些PRlO基因上調(diào)表達(dá)，例如茉莉酸、水楊酸、過氧化氫、乙烯、赤霉素等。植物PRlO的核糖核酸酶活性與其具有的抑菌活性密切相關(guān)。
[0011 ] 本發(fā)明涉及分離包含的DNA片段并鑒定其功能，具有該基因片段的植物在一定程度上具有抵抗特定真菌侵染的表型，其中所述DNA片段如序列表SEQ ID NO:1所示，對(duì)該基因進(jìn)行序列分析，H%LrPR10-5全I(xiàn) cDNA為846bp，包含一個(gè)474bp的開放閱讀框(ORF)、55bp 的 5，非翻譯區(qū)(untranslated reg1n, UTR)及 317bp 的 3，UTR，其中 ORF編碼一個(gè)具有157個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。編碼蛋白具有PRlO蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，BLASTp檢索結(jié)果表明編碼的蛋白質(zhì)與麝香百合PRlO (AAD17336.1)的相似性為99%，與風(fēng)信子、小麥、山羊草、蘆筍、大麥以及其他物種的PRlO蛋白高度相似，表明其屬于岷江百合中的病程相關(guān)蛋白10。超表達(dá)序列表SEQ ID NO:2所示的蛋白質(zhì)可以增強(qiáng)煙草對(duì)灰葡萄孢、立枯絲核菌以及核盤菌的抗性。
[0012]本發(fā)明另一目的是將岷江百合病程相關(guān)蛋白10基因應(yīng)用在提高煙草對(duì)灰葡萄孢菌、立枯絲核菌以及核盤菌抗性中，具體操作如下:
(1)采用擴(kuò)增的特異引物，從接種尖孢鐮刀菌后的岷江百合根中提取總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcript1n-polymerase chain react1n,RT-PCR)擴(kuò)增出LrPR10-5的全長編碼區(qū)，然后將其連接到pMD_18T載體上，經(jīng)測(cè)序獲得具有目的基因的克?。?br> (2)用限制性內(nèi)切酶漢3ΜΠ和&oRI酶切pMD-18T-Zr/^7i?-5載體，通過膠回收得到目的基因片段，用同樣的內(nèi)切酶酶切植物表達(dá)載體pCAMBIA2300s，膠回收獲得所需載體大片段，再將所獲得基因片段與pCAMBIA2300s片段連接，構(gòu)建植物超表達(dá)載體，之后將所構(gòu)建的重組載體通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入煙草中表達(dá)；
(3)以重組載體T-DNA上具有的抗性標(biāo)記篩選轉(zhuǎn)化子，并通過PCR以及RT-PCR檢測(cè)得到真正的轉(zhuǎn)基因植株，分析轉(zhuǎn)基因植物蛋白對(duì)真菌生長的抑制活性，最后篩選出對(duì)真菌抗性明顯增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株。
[0013]本發(fā)明為提高植物對(duì)真菌病害的抗性提供了一種新的方法，通過基因工程手段培育抗病植物可以克服傳統(tǒng)育種的不足，不僅育種周期縮短，而且操作簡單，容易獲得高抗材料。本發(fā)明來自岷江百合的LrPR10-5基因能增強(qiáng)植物對(duì)真菌的抗性，將該基因?qū)霟煵葜?，可以產(chǎn)生具有真菌抗性的新品種和新材料。利用基因工程技術(shù)培育抗性植物品種和材料具有明顯的優(yōu)勢(shì)和不可取代的重要性。它不僅可以為大規(guī)模生產(chǎn)作物、花卉等提供方便，大量減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，還可以為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)節(jié)約成本、減小環(huán)境污染，因此本發(fā)明具有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1是本發(fā)明LrPR10-5轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA的PCR檢測(cè)結(jié)果，圖中=Marker為DL2000 DNA Marker (大連寶生物)；正對(duì)照為質(zhì)粒pMD-18T_Zr/^7U為模板的PCR產(chǎn)物；WT為非轉(zhuǎn)基因煙草(野生型)總DNA為模板的PCR產(chǎn)物；
圖2是本發(fā)明陽性轉(zhuǎn)基因煙草中轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)分析結(jié)果圖；圖中:Marker是DL2000 DNA Marker (大連寶生物);WT是非轉(zhuǎn)基因煙草總RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA為模板的PCR產(chǎn)物；正對(duì)照是質(zhì)粒pMD-18T-Zr/^7i?-5為模板的PCR產(chǎn)物；
圖3是本發(fā)明轉(zhuǎn)基因煙草體外抗真菌活性的抑菌效果示意圖；圖中a、b、C、中的真菌分別是核盤菌、立枯絲核菌、灰葡萄孢;WT為野生型煙草的總蛋白；CK為空白對(duì)照，即無蛋白對(duì)照(用于提取蛋白的緩沖液)。

【具體實(shí)施方式】
[0015]下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此，本實(shí)施例中方法如無特殊說明的均按常規(guī)方法操作，所用試劑如無特殊說明的采用常規(guī)試劑或按常規(guī)方法配置的試劑。
[0016]實(shí)施例1 'LrPR10-5全長基因克隆以及序列分析
用尖孢鐮刀菌接種岷江百合，用接種24 h后的根提取總RNA，用液氮將處理過的岷江百合的根研磨成粉末，然后轉(zhuǎn)入離心管中，采用異硫氰酸胍法提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV (promega)以總RNA為模板合成cDNA第一鏈，反應(yīng)體系和操作過程為:取5 μ gTotal RNA，依次加入 50 ng oligo (dT)，2 μ L dNTP (2.5mM each)、DEPC 水至反應(yīng)體積為14.5μ L ;混勻后，70 1:加熱變性5 min后迅速在冰上冷卻5 min，然后依次加入4 μ L5 X First-stand buffer.0.5μ L RNasin (200U) UuL M-MLV (200U)，混勻并短時(shí)離心，42°〇溫浴1.5 h，取出后70 °C加熱10 min，終止反應(yīng)。cDNA第一鏈合成后置于-20 °C保存?zhèn)溆谩?br> [0017]以合成的第一鏈cDNA為模板，擴(kuò)增目的基因LrPR10-5,所用上下游引物序列分別5:ATGGGGACACCTCTCTCTTCTTCT3:及
5:CGAAATACAiffTCTCACAAGTTTCACA3:0 采用 Advantage? 2 PCR Enzyme
(Clontech)擴(kuò)增出目的基因；PCR 反應(yīng)條件:95 V 2 min ；94 V 30 s，59 V 30 s，72 V50 s，30 個(gè)循環(huán)；72 °C 5 min ;反應(yīng)體系(10 μ L)為 I μ L cDNAU μ L 1XAdvantage 2PCR Buffer、0.5μ L 50 X dNTP Mix (1mM each)、0.2 μ L 正向引物(10 μΜ)、0.2μL 反向引物(10 μ Μ) >0.2 μ L Advantage 2 PCR Polymerase Mix>6.9 μ L PCR-Grade water ;PCR結(jié)束后，取5μ L用于瓊脂糖凝膠電泳，用以檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性以及大小。
[0018]所得到PCR產(chǎn)物只有一條DNA帶，故直接對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆，使用的試劑盒為pMD18-T vector kit (大連寶生物)，反應(yīng)體系和操作過程為:取1.5 μ L PCR產(chǎn)物，依次加入 I P L pMD18_T vector (50 ng/ μ L)和 2.5 μ L 2XLigat1n solut1n I，混勻后置于16 °C過夜反應(yīng)。采用熱激轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a中。使用含有氨芐青霉素(ampicillin, Amp)的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆,挑選若干個(gè)單菌落,搖菌后用擴(kuò)靖LrPR10-5的特異引物鑒定出多克隆位點(diǎn)插入的克隆，將所鑒定的克隆進(jìn)行測(cè)序，最終獲得的全長 cDNA 為 846bp,通過 NCBI ORF finder (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析發(fā)現(xiàn)其包含一個(gè)474bp的開放讀碼框(見序列表)，
編碼一個(gè)含157 個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)LrPR10-5，其分子量約為16.7 KDa，等電點(diǎn)約為5.31，含有2個(gè)半胱氨酸殘基(C)，位于第79位和110位，因此單體蛋白可能形成一個(gè)二硫鍵，借助生物信息學(xué)軟件SignalP 4.1分析編碼的蛋白序列，檢測(cè)其是否具有N端信號(hào)肽。結(jié)果顯示在LrPRlO-5中沒有檢測(cè)到信號(hào)肽的存在。
[0019]實(shí)施例2:植物超表達(dá)載體構(gòu)建
采用SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒(上海生工)提取插入的大腸桿菌質(zhì)粒pMD-18T-Zr/^7U以及植物表達(dá)載體pCAMBIA2300s的質(zhì)粒，取I μ L用于瓊脂糖凝膠電泳以檢測(cè)所提取質(zhì)粒的完整性及濃度高低；用限制性內(nèi)切酶&0RI (TaKaRa)和(TaKaRa)分別對(duì)質(zhì)粒pMD-18T_Zr/^7U和pCAMBIA2300s進(jìn)行雙酶切(100 μ L體系)，反應(yīng)體系和操作過程為:取20 μ L pMD-18T-Zr/^7U和pCAMBIA2300s質(zhì)粒、依次加入10 μ L10ΧΚ buffer、5yL EcoRI^mL60 μ L ddH20，混勻后短時(shí)離心，置于37 °C過夜反應(yīng)；將所有酶切產(chǎn)物點(diǎn)于瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，然后對(duì)片段和pCAMBIA2300s載體大片段分別進(jìn)行膠回收，整個(gè)過程使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工)；取I μ L回收產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收片段的大小以及濃度，其余回收物置于-20°c保存?zhèn)溆谩?br> [0020]利用T4 DNA Ligase (TaKaRa)，將回收的DNA 片段和 pCAMBIA2300s 載體片段連接起來，反應(yīng)體系(20 μ L)和操作過程為:取1yL LrPRlO-5 DNA片段依次加入2μ L pCAMBIA2300s載體DNA、2y L 10XT4 DNA Ligase BufferU μ L Τ4 DNA Ligase、5yLddH20，混勻后短時(shí)離心，然后16 1:水浴過夜反應(yīng)。接著采用熱激轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α中，用含有50mg/L卡那霉素(kanamycin, Km)的固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆。挑選單菌落搖菌，以菌液為模板用擴(kuò)增LrPR10-5的特異引物進(jìn)行PCR，挑選出LrPR10-5與pCAMBIA2300s成功連接的克隆，所檢測(cè)的菌株若為陽性，加入甘油并置于_80 °C保存?zhèn)溆谩?br> [0021]采用SanPr印柱式質(zhì)粒抽提試劑盒(上海生工)提取并純化上述大腸桿菌中的pCAMBIA2300s-Zr/^7i?-5質(zhì)粒。隨后用液氮凍融法將上述構(gòu)建的植物表達(dá)載體pCAMBIA2300s-Zr/^7U轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞中。操作步驟為:取2μ gpCkmik2300s-LrPR10-5質(zhì)粒加入含有200 μ L感受態(tài)細(xì)胞的離心管中，輕輕混勻后冰浴5 min,隨后轉(zhuǎn)入液氮中冷凍I min,然后迅速置于37 °C水浴5 min,之后立即冰浴2 min,加入800 μ L LB液體培養(yǎng)基于28 1:振蕩培養(yǎng)4 h。將活化后的農(nóng)桿菌涂于含有50 mg/LKm的LB固體培養(yǎng)基上，28 °C靜止培養(yǎng)。挑選單菌落搖菌，再用擴(kuò)增的特異性引物進(jìn)行PCR，檢測(cè)pCAMBIA2300s-Zr/^7i?-5是否轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，對(duì)于陽性克隆，加入甘油后置于-80 °C保存?zhèn)溆谩?br> [0022]實(shí)施例3:農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)基因植物篩選本實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)基因受體是煙草，將煙草種子用75%的酒精浸泡30 S，用無菌水洗滌后用
0.1 %的HgCl2浸泡8 min，然后再用無菌水洗滌若干次，播種于1/2 MS培養(yǎng)基上，28 °〇暗培養(yǎng)6 d,發(fā)芽后轉(zhuǎn)至光照培養(yǎng)箱(25 V ,16 h/d光照)，以后每月用MS培養(yǎng)基繼代一次。
[0023]從_80°C冰箱中取出保存的含有pCAMBIA2300s-Zr/^7U質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404菌種，接種于5 mL含有50 mg/L Km和20 mg/L利福平的LB液體培養(yǎng)基中，28 1:培養(yǎng)至培養(yǎng)基渾濁。吸取I mL渾濁的菌液至含有50mg/L Km的LB固體培養(yǎng)基上，28 °C培養(yǎng)48 h ；隨后將LB固體培養(yǎng)基上的農(nóng)桿菌刮下適量接種于附加有20 mg/L的乙酰丁香酮的MGL液體培養(yǎng)基中，28 1:振蕩培養(yǎng)2-3 h以活化農(nóng)桿菌。
[0024]取煙草無菌苗葉子切成I cm2左右的葉盤，完全浸泡于上述含有活化農(nóng)桿菌的MGL液體培養(yǎng)基中，浸染時(shí)間為15 min，用無菌濾紙吸干葉片表面的菌液，將葉盤置于共培養(yǎng)基上進(jìn)行室溫培養(yǎng)，煙草轉(zhuǎn)化的共培養(yǎng)基為MS+0.02 mg/L 6-BA+2.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂，22 °C無光條件下共培養(yǎng)2天。
[0025]將共培養(yǎng)后的葉盤轉(zhuǎn)到加有抗生素的MS篩選培養(yǎng)基中分化成苗，同時(shí)篩選轉(zhuǎn)基因植株。煙草篩選培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂+50 mg/L Km+200 mg/L 頭抱霉素(cefotaxime sodium salt, Cef);篩選培養(yǎng)時(shí)將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)(25 °C, 16 h/d光照，8 h/d黑暗)，待煙草長出芽后用含有50 mg/L Km和200 mg/L Cef的MS培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)，因煙草愈傷分化率較高，故需要對(duì)再生植株進(jìn)行進(jìn)一步篩選，將煙草再生苗移至含有50 mg/L Km的MS培養(yǎng)基上使其生根，最后選擇生根較好的再生苗進(jìn)行陽性株的篩選。
[0026]采用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因煙草植株葉片的基因組DNA，將提取的基因組DNA取I μ L通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性和濃度，以轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA為模板用擴(kuò)增LrPRlO-5的特異弓丨物進(jìn)行PCR，PCR結(jié)束后，取8 μ L產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳以檢測(cè)陽性轉(zhuǎn)基因植株，部分煙草轉(zhuǎn)基因植株的擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，轉(zhuǎn)基因煙草共篩選到29株陽性轉(zhuǎn)基因植株。
[0027]實(shí)施例4:轉(zhuǎn)基因煙草中LrPR10-5的表達(dá)分析以及轉(zhuǎn)基因植株抗真菌活性分析取陽性轉(zhuǎn)基因單株以及非轉(zhuǎn)基因煙草(野生型)的嫩葉提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄生成
cDNA第一鏈，并以此為模板用擴(kuò)增的特異引物進(jìn)行PCR，分析各轉(zhuǎn)基因單株中轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，總RNA提取以及RT-PCR的方法與實(shí)施例1中相同，PCR結(jié)束之后，取5 μ L用于瓊脂糖凝膠電泳，部分單株的檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，共檢測(cè)到18個(gè)轉(zhuǎn)基因單株中在轉(zhuǎn)錄水平大量表達(dá)，這些單株的編號(hào)為I~18。
[0028]將實(shí)驗(yàn)室保存的幾種真菌接種于PDA固體培養(yǎng)基(200 g/L馬鈴薯，15 g/L瓊脂，20 g/L葡萄糖)上，28 °C暗培養(yǎng)，待菌落生長至直徑約為2~3 cm時(shí)添加蛋白，分析轉(zhuǎn)基因植株體外抗真菌活性，供試真菌共有7種:葡萄座腔菌Q1trosphaeria dothidea)、尖抱鍵刀菌{Fusarium、灰葡萄抱菌{Botrytis ciflerea)、鏈格抱 iAlterrmriaa/temaia)、核盤菌{Sclerotiniai1r 應(yīng))、立枯絲核菌{Rhizoctonia so I an ?)、衆(zhòng)狀鍵刀菌 ifu sari uni verti ci Ili oi des)。
[0029]為了防止其它雜菌污染所提取的蛋白，整個(gè)植物蛋白提取過程均是無菌操作，首先取I g轉(zhuǎn)基因煙草單株(編號(hào)分別為:1、2、4)及野生型葉片放入研缽中，加入I mL蛋白提取液(1M NaCl, 0.1M乙酸鈉，1% PVP, pH6)，充分研磨；轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，混勻后4°C靜置過夜，4 °C離心30 min (12,000 g/min)，取上清于新的1.5 mL離心管中，并取適量用紫外分光光度儀測(cè)定總蛋白濃度。將轉(zhuǎn)基因和野生型植株的總蛋白濃度調(diào)整至0.2 μ g/μ L，然后分別取20 μ L滴于各真菌培養(yǎng)基的無菌濾紙上，在每個(gè)真菌的平板上除了添加不同轉(zhuǎn)基因煙草植株的總蛋白，同時(shí)平行添加野生型煙草的總蛋白和空白對(duì)照(提取蛋白所用的溶液)，28 °C培養(yǎng)幾天后觀察各處理真菌生長的情況，并據(jù)此來評(píng)價(jià)LrPRlO-5轉(zhuǎn)基因煙草的體外抗真菌活性，結(jié)果如圖3所示，轉(zhuǎn)基因煙草蛋白對(duì)核盤菌、灰葡萄、立枯絲核菌的生長具有很強(qiáng)的抑制作用。
【權(quán)利要求】
1.一種岷江百合病程相關(guān)蛋白10基因在提高煙草對(duì)灰葡萄孢、立枯絲核菌、核盤菌抗性中的應(yīng)用，其中所述岷江百合抗真菌基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述岷江百合病程相關(guān)蛋白10基因的應(yīng)用，其特征在于提高煙草的真菌抗性的具體操作如下: (1)將上述基因LrPR10-5與植物表達(dá)載體pCAMBIA2300s連接，構(gòu)建植物超表達(dá)載體； (2)將上述構(gòu)建的重組載體通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入煙草中； (3)以重組載體T-DNA上具有的抗性標(biāo)記來篩選轉(zhuǎn)化子，并通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株，分析轉(zhuǎn)基因煙草蛋白對(duì)真菌生長的抑制活性，最后篩選出對(duì)真菌抗性明顯增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因煙草植株。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104131015SQ201410396753
【公開日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年8月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月13日
【發(fā)明者】劉迪秋, 何華, 季博, 韓青, 葛鋒, 陳朝銀 申請(qǐng)人:昆明理工大學(xué)