體外受精液及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明為體外受精液及其制備方法，解決現(xiàn)有受精液不適宜精子、卵細(xì)胞生存，或影響受精卵發(fā)育成長等技術(shù)問題，它是通過多種溶質(zhì)溶于超純凈水中進(jìn)行調(diào)配而成的培養(yǎng)液；該基礎(chǔ)液溶質(zhì)包括有氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、?；撬?、檸檬酸鈉等；該殺菌劑為慶大霉素；該原液溶質(zhì)為人血清白蛋白；該調(diào)配的培養(yǎng)液在超凈工作臺下再利用0.2μm的濾膜過濾進(jìn)行除菌處理。本發(fā)明包含有多種適合精子、卵細(xì)胞生存和受精卵生長、發(fā)育的有機(jī)或無機(jī)成份，為試管嬰兒的培育提供了保證。
【專利說明】體外受精液及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于人工輔助生殖【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種體外受精卵前期培養(yǎng)液，為一種體外受精液及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]目前人類不孕率提高促使試管嬰兒技術(shù)的發(fā)展。在試管嬰兒技術(shù)中需采集良好的精子和母體的卵細(xì)胞進(jìn)行受精和先期培養(yǎng)，該培養(yǎng)過程與受精液密切相關(guān)，受精液的質(zhì)量優(yōu)劣決定試管嬰兒的成敗。體外受精液的目的主要是提供精子、卵子存活的營養(yǎng)和受精卵發(fā)育的營養(yǎng)，以及為精子、卵子及受精卵創(chuàng)建合理的成活和生長發(fā)育的環(huán)境。體外受精液對受精卵前期的分裂培養(yǎng)已廣泛應(yīng)用于試管嬰兒技術(shù)中；如在試驗室或臨床中，在二氧化碳環(huán)境下由體外受精液對體外精子、卵子的提供存活的環(huán)境及對受精卵提供早期發(fā)育的營養(yǎng)。
[0003]目前使用的受精液調(diào)配的營養(yǎng)不全，或其物理或化學(xué)指標(biāo)過余寬，在培養(yǎng)過程中容易使精子或卵細(xì)胞死亡、或精子獲能不足活力較低、或卵細(xì)胞生存受到影響，如在精子活力試驗中，精子保持活力的比率較低(同樣的試驗過程、同批次精液，下同)，或其比率接近或低于合格標(biāo)準(zhǔn)(保持活力率> 75% )0有些受精液的稠度較高，其含有有害成份和炎細(xì)胞去除不干凈，嚴(yán)重影響受精卵的發(fā)育成長。
[0004]另外，一般受精液在使用前不能直觀地判斷有效性的好壞，如果在其變質(zhì)后仍繼續(xù)使用將對試驗或臨床操作造成不可逆轉(zhuǎn)的結(jié)果。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明主要是解決現(xiàn)有受精液不適宜精子、卵細(xì)胞生存，或影響受精卵發(fā)育成長等技術(shù)問題，進(jìn)而提供一種完全適宜于精子、卵細(xì)胞或受精卵生存或生長的受精液；該受精液能保證精子獲能且維持其活力、能使受精卵正常發(fā)育成長，使用安全且易于直觀判斷其是否變質(zhì)，為輔助生殖技術(shù)提供有力保證，避免風(fēng)險發(fā)生。
[0006]本發(fā)明的體外受精液是通過多種溶質(zhì)溶于超純凈水中進(jìn)行調(diào)配而成的培養(yǎng)液，該多種溶質(zhì)包括基礎(chǔ)液溶質(zhì)、殺菌劑和原液溶質(zhì)；該基礎(chǔ)液溶質(zhì)包括有氯化鈉，氯化鉀，硫酸鎂，氯化鈣，碳酸氫鈉，丙酮酸鈉，乳酸鈉，?；撬幔瑱幟仕徕c；該殺菌劑為慶大霉素，該原液溶質(zhì)為人血清白蛋白；該調(diào)配的培養(yǎng)液在超凈工作臺下再利用0.2μπι的濾膜過濾進(jìn)行除菌處理。
[0007]進(jìn)一步,該基礎(chǔ)液溶質(zhì)在培養(yǎng)液中的含量如下:氯化鈉96.4~106.6mmol/L、氯化鐘4.46~4.92mmol/L、硫酸續(xù)0.19~0.21mmol/L、氣化鈣1.94~2.14mmol/L、碳酸氧納23.75 ~26.25mmol/L、丙酮酸鈉 0.31 ~0.35mmol/L、乳酸鈉 12.18 ~13.47mmol/L、?；撬?.048~0.053mmol/L、檸檬酸鈉0.000475~0.000525mmol/L ;所述的人血清白蛋白在培養(yǎng)液中的含量為9.5~10.5g/L。
[0008]再進(jìn)一步，該慶大霉素在培養(yǎng)液中的含量為9.5~10.5mg/L。
[0009]再進(jìn)一步，該培養(yǎng)液中還具有用以判斷該培養(yǎng)液pH值的指示劑；該指示劑為酚紅，在培養(yǎng)液中的含量為4.75~5.25mg/L。
[0010]更進(jìn)一步，該培養(yǎng)液的pH值為7.20~7.40 ;該培養(yǎng)液的滲透壓為260~290m0sm/Kg0
[0011]一種如上述所述的體外受精液的制備方法，它包括以下步驟:
[0012](I)培養(yǎng)液的配制
[0013]a、先按照各溶質(zhì)的含量和配制容量要求稱取或量取各溶質(zhì)，并分開放置；同時準(zhǔn)備好帶刻度調(diào)制容器和超純凈水，并將稱量好的超純凈水加入調(diào)制容器中，待用；
[0014]b、將除碳酸氫鈉外的各基礎(chǔ)液溶質(zhì)按先固體后液體的順序溶于調(diào)制容器內(nèi)的超純凈水中；
[0015]C、向上述步驟b所得溶液中加入所量取的殺菌劑和所稱取的NaHCO3溶質(zhì)，同時根據(jù)需要添加指示劑，得基礎(chǔ)液；
[0016]d、向上述步驟c所得基礎(chǔ)液中加入所稱取的人血清白蛋白，震蕩或攪拌混合均勻，得原液；
[0017]e、檢測上述步驟d所得原液的滲透壓和pH值，通過滴加2M的HCl溶液或2M的NaOH溶液調(diào)整其pH值至7.20~7.40，并記錄最終滲透壓和pH值。
[0018](2)培養(yǎng)液的處理:
[0019]a、除菌，將上述步驟所得培養(yǎng)液在超凈工作臺下利用0.2μπι的濾膜過濾除菌；
[0020]b、分裝及冷存，在無菌環(huán)境下對過濾后的培養(yǎng)液進(jìn)行分裝、封口，并放置于冰箱或冷庫內(nèi)，在2~8°C條件下保存，得體外受精液；
[0021]C、取分裝好的體外受精液進(jìn)行檢測，檢測項目包括pH值檢測、滲透壓檢測、細(xì)胞毒性檢測、皮內(nèi)刺激反應(yīng)檢測、致敏反應(yīng)檢測、無菌檢測、熱原檢測、細(xì)菌內(nèi)毒素檢測、以及體外鼠胚試驗和精子活力試驗，以判斷該體外受精液是否合格。
[0022]本發(fā)明通過該體外受精液中各成份的合理配比，保證將其溶液的滲透壓控制在260~290m0sm/Kg的范圍內(nèi)，為精子、卵細(xì)胞正常生成，受精卵的正常生長、發(fā)育創(chuàng)建了適宜的環(huán)境。
[0023]該體外受精液中根據(jù)情況添加指示劑，如酚紅。由于酚紅在pH變化時顏色變化明顯，如，pH在7.0~7.5范圍內(nèi)酚紅溶液為粉紅色到橙紅色，當(dāng)pH值小于6.8時為黃色，當(dāng)PH值大于8.4時為紅色。通過該體外受精液的的顏色觀察就可直觀地判斷其是否變質(zhì)在用于試驗或臨床時，從而避免了使用變質(zhì)體外受精液而產(chǎn)生的風(fēng)險。當(dāng)體外受精液中不含酚紅指示劑時，則溶液呈透明、清澈，在有效期內(nèi)能保證無菌且正常使用。通過加入抗生素等殺菌劑以抑制細(xì)菌的生長；如慶大霉素是一種光譜、熱穩(wěn)定性好的抗生素，在體外受精液中添加慶大霉素可以有效抑制細(xì)菌的生長。本發(fā)明在制備過程中其溶劑采用超純水，超純水的總有機(jī)碳(TOC)超低，避免了因雜質(zhì)過多影響測定的結(jié)果。
[0024]本發(fā)明包含有多種適合精子、卵細(xì)胞生存和受精卵生長發(fā)育的有機(jī)或無機(jī)成份，能創(chuàng)建適宜于精子的生存環(huán)境，維持了精子原有活力，同時能有效地去殺死有害細(xì)菌等，為體外受精卵培育提供了保證。
[0025]本發(fā)明配制工藝操作簡單合理，檢測嚴(yán)密，能夠快速地提供新鮮的培養(yǎng)液供生殖中心或科研院所使用。
[0026]以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0027]實施例一
[0028]本發(fā)明的體外受精液，它是通過多種溶質(zhì)溶于超純凈水中進(jìn)行調(diào)配而成的培養(yǎng)液。該超純凈水的物理標(biāo)準(zhǔn)為:①流速為0.05Lpm-2.0Lpm、②在25°C時電阻率為18.2ΜΩ.cm、③在25°C時電導(dǎo)率為0.055 u S/cm ;化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)為:熱原質(zhì)< 0.001Eu/ml，微粒 I/ml,T0C<5ppb。該超純凈水也可用注射用水替代。該多種溶質(zhì)包括基礎(chǔ)液溶質(zhì)、殺菌劑和原液溶質(zhì)。通過基礎(chǔ)液溶質(zhì)調(diào)配創(chuàng)建適宜于精子、卵細(xì)胞、受精卵生存的環(huán)境以及提供受精卵生長所需營養(yǎng)。該基礎(chǔ)液溶質(zhì)包括有氯化鈉，氯化鉀，硫酸鎂，氯化鈣，碳酸氫鈉，丙酮酸鈉，乳酸鈉，?；撬幔瑱幟仕徕c。該原液溶質(zhì)為人血清白蛋白，用于提供受精卵生存的必要的營養(yǎng)物質(zhì)。該殺菌劑為慶大霉素；用于殺滅體外受:精液中的細(xì)菌等有害物質(zhì)。
[0029]經(jīng)上述調(diào)配而成的培養(yǎng)液在超凈工作臺下再利用0.2 μ m的濾膜過濾進(jìn)行除菌處理。
[0030]該基礎(chǔ)液溶質(zhì)在培養(yǎng)液中的含量如下:氯化鈉96.4mmol/L、氯化鉀4.46mmol/L、硫酸鎂 0.19mmol/L、氯化?丐 1.94mmol/L、碳酸氫鈉 23.75mmol/L、丙酮酸鈉 0.31mmol/L、乳酸鈉12.18mmol/L、牛磺酸0.048mmol/L、檸檬酸鈉0.000475mmol/L ;該人血清白蛋白在培養(yǎng)液中的含量為9.5g/L。本實施例中的殺菌劑為慶大霉素，其在培養(yǎng)液中的含量為9.5g/L0具體參見表1中的“配方I”。
[0031]表1體外受精液的配方
[0032]

【權(quán)利要求】
1.一種體外受精液，它是通過多種溶質(zhì)溶于超純凈水中進(jìn)行調(diào)配而成的培養(yǎng)液，該多種溶質(zhì)包括基礎(chǔ)液溶質(zhì)、殺菌劑和原液溶質(zhì)，其特征在于:該基礎(chǔ)液溶質(zhì)包括有氯化鈉，氯化鉀，硫酸鎂，氯化鈣，碳酸氫鈉，丙酮酸鈉，乳酸鈉，牛磺酸，檸檬酸鈉；該殺菌劑為慶大霉素；該原液溶質(zhì)為人血清白蛋白；該調(diào)配的培養(yǎng)液在超凈工作臺下再利用0.2μπι的濾膜過濾進(jìn)行除菌處理。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外受精液，其特征在于:所述基礎(chǔ)液溶質(zhì)在培養(yǎng)液中的含量如下:氯化鈉96.4~106.6mmol/L、氯化鉀4.46~4.92mmol/L、硫酸鎂0.19~0.2ImmoI /I,、氣化?丐 1.94 ~2.14mmol/L、碳酸氧納 23.75 ~26.25mmol/L、丙麗酸納0.31 ~0.35mmol/L、乳酸鈉 12.18 ~13.47mmol/L、牛磺酸 0.048 ~0.053mmol/L、檸檬酸鈉0.000475~0.000525mmol/L ;所述的人血清白蛋白在培養(yǎng)液中的含量為9.5~10.5g/L0
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的體外受精液，其特征在于:所述的慶大霉素在培養(yǎng)液中的含量為 9.5 ~10.5mg/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的體外受精液，其特征在于:該培養(yǎng)液中還具有用以判斷該培養(yǎng)液PH值的指示劑；該指示劑為酚紅，在培養(yǎng)液中的含量為4.75~5.25mg/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的體外受精液，其特征在于:該培養(yǎng)液的pH值為7.20~7.40 ;該培養(yǎng)液的滲透壓為260~290m0sm/Kg。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的體外受精液，其特征在于:該基礎(chǔ)液溶質(zhì)在培養(yǎng)液中的含量如下:氯化鈉 96.4mmol/L、氯化鉀 4.46mmol/L、硫酸鎂 0.19mmol/L、氯化鈣 1.94mmol/L、碳酸氫!納 23.75mmol/L、丙麗酸納 0.31mmol/L、乳酸納 12.18mmol/L、牛橫酸 0.048mmol/L、朽1檬酸鈉0.000475mmol/L ;該人血清白蛋白在培養(yǎng)液中的含量為9.5g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的體外受精液，其特征在于:該基礎(chǔ)液溶質(zhì)在培養(yǎng)液中的含量如下:氯化鈉 101.5mmol/L、氯化鉀 4.69mmol/L、硫酸鎂 0.20mmol/L、氯化|丐 2.04mmol/L、碳酸氫鈉25mmol/L、丙酮酸鈉0.33mmol/L、乳酸鈉12.82mmol/L、?；撬?.05mmol/L、檸檬酸鈉0.0005mmol/L ;該人血清白蛋白在培養(yǎng)液中的含量為10g/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的體外受精液，其特征在于:該基礎(chǔ)液溶質(zhì)在培養(yǎng)液中的含量如下:氯化鈉 106.6mmol/L、氯化鉀 4.92mmol/L、硫酸鎂 0.21mmol/L、氯化鈣 2.14mmol/L、碳酸氫!納 26.25mmol/L、丙麗酸納 0.35mmol/L、乳酸納 13.47mmol/L、牛橫酸 0.053mmol/L、朽1檬酸鈉0.000525mmol/L ;該人血清白蛋白在培養(yǎng)液中的含量為10.5g/L。
9.一種如權(quán)利要求3~8任意項所述的體外受精液的制備方法，其特征在于:它包括以下步驟: (I)培養(yǎng)液的配制: a、先按照各溶質(zhì)的含量和配制容量要求稱取或量取各溶質(zhì)，并分開放置；同時準(zhǔn)備好帶刻度調(diào)制容器和超純凈水，并將稱量好的超純凈水加入調(diào)制容器中，待用； b、將除碳酸氫鈉外的各基礎(chǔ)液溶質(zhì)按先固體后液體的順序溶于調(diào)制容器內(nèi)的超純凈水中； C、向步驟b所得溶液中加入所量取的殺菌劑和所稱取的NaHCO3基礎(chǔ)液溶質(zhì)，同時根據(jù)需要添加指示劑，得基礎(chǔ)液； d、向步驟c所得基礎(chǔ)液中加入所稱取的人血清白蛋白，震蕩或攪拌混合均勻，得原液；(或省略該步驟，醫(yī)生在使用時，自行添加人血清白蛋白。) e、檢測步驟c所得的原液的滲透壓和pH值，通過滴加2M的HCl溶液或2M的NaOH溶液調(diào)整其PH值至7.20~7.40，并記錄最終滲透壓和pH值.(2)培養(yǎng)液的處理: a、除菌，將上述步驟所得培養(yǎng)液在超凈工作臺下利用0.2μπι的濾膜過濾除菌； b、分裝及冷存，在無菌環(huán)境下對過濾后的培養(yǎng)液進(jìn)行分裝、封口，并放置于冰箱或冷庫內(nèi)，在2~8 °C條件下保存，得體外受精液； C、取分裝好的體外受精液進(jìn)行檢測，檢測項目包括pH值檢測、滲透壓檢測、細(xì)胞毒性檢測、皮內(nèi)刺激反應(yīng)檢測 、致敏反應(yīng)檢測、無菌檢測、熱原檢測、細(xì)菌內(nèi)毒素檢測以及體外鼠胚試驗和精子活力試驗，以判斷該體外受精液是否合格。
【文檔編號】C12N5/075GK104164400SQ201410396969
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年8月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月12日
【發(fā)明者】王維華, 周淑梅, 黃永軍 申請人:沈陽潔瑞生物技術(shù)有限公司