精子洗滌液及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種精子洗滌液及其制備方法，解決精子清洗時(shí)維持精子的活力，降低精子的死亡率等技術(shù)問題。它是通過多種溶質(zhì)溶于超純凈水中進(jìn)行調(diào)配而成的清洗培養(yǎng)液，該溶質(zhì)包括基礎(chǔ)液溶質(zhì)、殺菌劑和原液溶質(zhì)；該基礎(chǔ)液溶質(zhì)包括氯化鈉、氯化鉀、碳酸氫鈉、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、?；撬?、非必需氨基酸和殺菌劑等；該原液溶質(zhì)為人血清白蛋白。本發(fā)明包含有多種適合精子生存和生長的有機(jī)或無機(jī)成份，在精子清洗過程中，能維持精子原有活力，并有效地去除精液中的雜物，為試管嬰兒的培育或精子的冷凍貯藏提供了保證。
【專利說明】精子洗滌液及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于人工輔助生殖【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種用于精子清洗的化學(xué)劑，尤其是一種精子洗滌液及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]目前人類不孕率提高促使試管嬰兒技術(shù)的發(fā)展。在試管嬰兒技術(shù)中首先需采集良好的精子，精子的優(yōu)劣決定試管嬰兒的成敗。在試管嬰兒技術(shù)中其精子來源主要有兩方面:直接采集人體精子，或從精子貯藏庫中提取。無論精子來源如何都必須使用清洗液對(duì)精子進(jìn)行科學(xué)地洗滌，以收集活動(dòng)能力較強(qiáng)、質(zhì)量良好的精子，使精子獲得足夠的能量，同時(shí)除去精液中有害成份及死精子、炎細(xì)胞等。一方面保證冷凍貯藏的精液不變質(zhì)、質(zhì)量?jī)?yōu)良，另一方面在實(shí)施試管嬰兒時(shí)對(duì)精液進(jìn)行洗滌處理和篩選，保證培育優(yōu)越的嬰兒。
[0003]目前使用的清洗液(或洗滌液等)品種不統(tǒng)一，效果不明顯，且價(jià)格昂貴。有些洗滌液中調(diào)配的營養(yǎng)不全，在清洗過程中容易造成精子的死亡或清子獲能不足活力較低，如在精子活力實(shí)驗(yàn)中，精子保持活力的比率較低(同樣的實(shí)驗(yàn)過程、同批次精液，下同)，其比率接近或低于合格標(biāo)準(zhǔn)(保持活力率> 75% )。有些洗滌液的稠度較高，在精洗過程難以一次性將精液中的有害成份、死精子和炎細(xì)胞去除，造成冷凍貯藏的精液質(zhì)量不能得到保證。
[0004]另外，一般精子洗滌液在使用前不能直觀地判斷有效性的好壞，如果在洗滌液變質(zhì)后仍繼續(xù)使用將對(duì)實(shí)驗(yàn)或臨床操作造成不可逆轉(zhuǎn)的結(jié)果。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明主要是解決精子清洗時(shí)更好地維持精子的活力、降低精子的死亡率等技術(shù)問題，以便更好的冷凍冷藏或?yàn)檩o助生殖技術(shù)提供有力保證，避免風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生。進(jìn)而提供一種各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到體外清洗培養(yǎng)液的標(biāo)準(zhǔn)、有利精子生存、使用安全且易于判斷該清洗培養(yǎng)液是否變質(zhì)的精子洗滌液。
[0006]本發(fā)明的精子洗滌液，它是對(duì)多種溶質(zhì)溶于超純凈水所配制的清洗培養(yǎng)液進(jìn)行除菌而成；該多種溶質(zhì)包括基礎(chǔ)液溶質(zhì)、殺菌劑和原液溶質(zhì)；該基礎(chǔ)液溶質(zhì)包括氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈣、碳酸氫鈉、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖、丙酮酸鈉、乳酸鈉、丙氨酰谷氨酰胺、?；撬峒胺潜匦璋被?；該原液溶質(zhì)為人血清白蛋白；該殺菌劑為慶大霉素；該除菌是清洗培養(yǎng)液在超凈工作臺(tái)下利用0.2 μ m的濾膜進(jìn)行過濾的過程。
[0007]進(jìn)一步，該基礎(chǔ)液溶質(zhì)在清洗培養(yǎng)液中的含量如下:氯化鈉92.815~102.585mmol/L,氣化鐘 4.465 ~4.935mmol/L,硫酸續(xù) 0.19 ~0.21 mmol /I,,葡萄糖 2.66 ~
2.94mmol/L,磷酸二氫鉀 0.3515 ~0.3885mmol/L,氯化鈣 1.9 ~2.lmmol/L,乳酸鈉12.18 ~13.48mmol/L、丙麗酸納 0.3135 ~0.3465mmol/L、碳酸氧納 3.8 ~4.2mmol/L、丙氨酰谷氨酰胺0.95~1.05mmol/L、?；撬?.095~0.105mmol/L、4_輕乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) 19.95~22.05mmol/L及非必需氨基酸9.5~10.5ml/L ;該人血清白蛋白在清洗培養(yǎng)液中的含量為4.75~5.25g/L。
[0008]更進(jìn)一步，該殺菌劑為慶大霉素，其在清洗培養(yǎng)液中的含量為9.5~10.5mg/L.
[0009]再進(jìn)一步，該清洗培養(yǎng)液中還具有用以判斷該清洗培養(yǎng)液pH值的指示劑；該指示劑為酚紅，在清洗培養(yǎng)液中的含量為9.5~10.5mg/L。
[0010]進(jìn)一步，該清洗培養(yǎng)液的pH值為7.20~7.40 ;該清洗培養(yǎng)液的滲透壓為260~290m0sm/Kg。
[0011]更進(jìn)一步，該非必需氨基酸為L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸中的一種或者幾種。
[0012]本發(fā)明的一種如上所述的清子洗滌液的制備方法，它包括以下步驟:
[0013](I)、清洗培養(yǎng)液的配制:
[0014]a、先按照各溶質(zhì)的含量和配制容量要求稱取或量取各溶質(zhì)，并分開放置；同時(shí)準(zhǔn)備好帶刻度調(diào)制容器和超純凈水，并將稱量好的超純凈水加入調(diào)制容器中；
[0015]b、將除碳酸氫鈉外的各基礎(chǔ)液溶質(zhì)按先固體后液體的順序溶于調(diào)制容器內(nèi)的超純凈水中；
[0016]C、向上述步驟b所得溶液中加入所量取的殺菌劑和所稱取的NaHCO3基礎(chǔ)液溶質(zhì)，同時(shí)根據(jù)需要添加指示劑，得基礎(chǔ)液；
[0017]d、向上述步驟c所得基礎(chǔ)液中加入所稱取的人血清白蛋白，震蕩或攪拌混合均勻，得原液；
[0018]e、檢測(cè)上述步驟d所得的原液的滲透壓和pH值，通過滴加2M的HCl溶液或2M的NaOH溶液調(diào)整其pH值至7.20~7.40，并記錄最終滲透壓和pH值
[0019](2)、清洗培養(yǎng)液的處理:
[0020]a、除菌，將上述的所得清洗培養(yǎng)液在超凈工作臺(tái)下利用0.2μπι的濾膜過濾除菌；
[0021]b、分裝及冷存，在無菌環(huán)境下對(duì)上述過濾后的清洗培養(yǎng)液進(jìn)行分裝、封口，并放置于冰箱或冷庫內(nèi)在2~8 °C條件下保存，得精子洗滌液；
[0022]C、檢驗(yàn)，取上述分裝好的精子洗滌液進(jìn)行檢測(cè)；檢測(cè)項(xiàng)目包括pH值檢測(cè)、滲透壓檢測(cè)、細(xì)胞毒性檢測(cè)、皮內(nèi)刺激反應(yīng)檢測(cè)、致敏反應(yīng)檢測(cè)、無菌檢測(cè)、熱原檢測(cè)、細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)、體外鼠胚試驗(yàn)和精子活力試驗(yàn)，以判斷該精子洗滌液是否合格。
[0023]本發(fā)明的精子洗滌液可根據(jù)需要添加指示劑酚紅，酚紅在pH值變化時(shí)顏色變化明顯，PH值在7.0~7.5范圍內(nèi)酚紅溶液為粉紅色到橙紅色，當(dāng)pH值小于6.8時(shí)為黃色，當(dāng)PH值大于8.4時(shí)為紅色，變色比較明顯，精子洗滌液的pH值在7.20~7.40范圍內(nèi)溶液為粉紅色到橙紅色，當(dāng)精子洗滌液顏色與此不符時(shí)，說明該精子洗滌液變質(zhì)，不能用于實(shí)驗(yàn)或臨床，從而避免了使用變質(zhì)精子液而產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)不添加指示劑時(shí)，本發(fā)明的洗滌液呈透明、清澈，在有效期內(nèi)使用能夠保證液體不變質(zhì)。
[0024]本發(fā)明通過使用抗生素來抑制細(xì)菌的生長，如慶大霉素是一種光譜、熱穩(wěn)定性好的抗生素，在精子洗滌液中添加慶大霉素可以有效抑制細(xì)菌的生長。
[0025]本發(fā)明包含有多種適合精子生存和生長的有機(jī)或無機(jī)成份，在對(duì)精子的清洗過程中，能創(chuàng)建適合于精子的生存環(huán)境，維持了精子原有活力，同時(shí)能有效地去除精液中的雜物，殺死有害細(xì)菌等，為試管嬰兒的培育或精子的冷凍貯藏提供了保證。
[0026]本發(fā)明精子洗滌液的原料均是已經(jīng)證明其安全性的物質(zhì)，在制備過程中其溶劑采用超純水，超純水的總有機(jī)碳(TOC)超低，避免了因雜質(zhì)過多影響測(cè)定的結(jié)果。
[0027]本發(fā)明配制工藝操作簡(jiǎn)單合理，檢測(cè)嚴(yán)密，能夠提供新鮮的培養(yǎng)液供生殖中心或科研院所使用。

【具體實(shí)施方式】
[0028]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。
[0029]實(shí)施例一
[0030]本發(fā)明的精子洗滌液是對(duì)多種溶質(zhì)溶于超純凈水所配制的清洗培養(yǎng)液進(jìn)行除菌而成。該超純凈水的物理標(biāo)準(zhǔn)為:①流速為0.05Lpm-2.0Lpm、②在25°C時(shí)電阻率為18.2ΜΩ.cm、③在25°C時(shí)電導(dǎo)率為0.055 μ S/cm ;化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)為:熱原質(zhì)< 0.001Eu/ml，微粒(l/ml，T0C<5ppb。該超純凈水也可用注射用水替代。所述多種溶質(zhì)包括基礎(chǔ)液溶質(zhì)、殺菌劑和原液溶質(zhì)。通過基礎(chǔ)液溶質(zhì)調(diào)配創(chuàng)建適合于精子生存的環(huán)境。該基礎(chǔ)液溶質(zhì)包括氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈣、碳酸氫鈉、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、葡萄糖、丙酮酸鈉、乳酸鈉、丙氨酰谷氨酰胺、?；撬峒胺潜匦璋被?。該原液溶質(zhì)為人血清白蛋白，用于提供精子生存的必要的培養(yǎng)物質(zhì)。該殺菌劑為慶大霉素，用于殺滅溶液中的細(xì)菌。
[0031]該除菌是清洗培養(yǎng)液在超凈工作臺(tái)下利用0.2 μ m的濾膜過濾除菌過程。通過濾膜除去清洗培養(yǎng)液中有關(guān)細(xì)菌和雜物。
[0032]上述基礎(chǔ)液溶質(zhì)在清洗培養(yǎng)液中的含量如下:氯化鈉92.815mmol/L(即配制后的清洗培養(yǎng)液中每升含有氯化鈉92.815mmol,下同)、氯化鉀4.465mmol/L、硫酸鎂0.19mmol/L、葡萄糖 2.66mmol/L、憐酸二氧鐘 0.3515mmol/L、氣化?丐 1.9mmol/L、乳酸納 12.18mmoI /L、丙酮酸鈉0.3135mmol/L、碳酸氫鈉3.8mmol/L、丙氨酰谷氨酰胺0.95mmol/L、牛磺酸0.095mmol/L、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) 19.95mmol/L及非必需氨基酸9.5ml/L ;該人血清白蛋白在清洗培養(yǎng)液中的含量為4.75g/L。具體參見表1的“配方I”一欄。
[0033]表1精子洗滌液中物質(zhì)含量:
[0034]

【權(quán)利要求】
1.一種精子洗滌液，它是對(duì)多種溶質(zhì)溶于超純凈水所配制的清洗培養(yǎng)液進(jìn)行除菌而成，該多種溶質(zhì)包括基礎(chǔ)液溶質(zhì)、殺菌劑和原液溶質(zhì)，其特征在于:該基礎(chǔ)液溶質(zhì)包括氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈣、碳酸氫鈉、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖、丙酮酸鈉、乳酸鈉、丙氨酰谷氨酰胺、牛磺酸及非必需氨基酸；該原液溶質(zhì)為人血清白蛋白；該殺菌劑為慶大霉素；該除菌是清洗培養(yǎng)液在超凈工作臺(tái)下利用0.2 μ m的濾膜進(jìn)行過濾的過程。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的精子洗滌液，其特征在于:該基礎(chǔ)溶質(zhì)在清洗培養(yǎng)液中的含量如下:氯化鈉92.815~102.585mmol/L,氯化鉀4.465~4.935mmol/L,硫酸鎂0.19~0.21 mmol /I,,葡萄糖 2.66 ~2.94mmol/L,憐酸二氧鐘 0.3515 ~0.3885mmol/L,氣化?丐1.9 ~2.1 mmol/L,乳酸納 12.18 ~13.48mmol/L、丙麗酸納 0.3135 ~0.3465mmol/L、碳酸氫鈉3.8~4.2mmol/L、丙氛酸谷氛酸胺0.95~1.05mmol/L、牛橫酸0.095~0.10SmmoI /L、4-羥乙基哌嗪乙磺酸19.95~22.05mmol/L及非必需氨基酸9.5~10.5ml/L ;該人血清白蛋白在清洗培養(yǎng)液中的含量為4.75~5.25g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的精子洗滌液，其特征在于:該慶大霉素在清洗培養(yǎng)液中的含量為 9.5 ~10.5mg/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的精子洗滌液，其特征在于:該清洗培養(yǎng)液中還具有用以判斷該清洗培養(yǎng)液pH值的指示劑；該指示劑為酚紅，在清洗培養(yǎng)液中的含量為9.5~10.5mg/L0
5.根據(jù)權(quán)利要求4所 述的精子洗滌液，其特征在于:該清洗培養(yǎng)液的pH值為7.20~7.40 ;該清洗培養(yǎng)液的滲透壓為260~290m0sm/Kg。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或3或4或5所述的精子洗滌液，其特征在于:該非必需氨基酸為L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸中的一種或者幾種。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的精子洗滌液，其特征在于:該基礎(chǔ)液溶質(zhì)在清洗培養(yǎng)液中的含量如下:氯化鈉92.815mmol/L、氯化鉀4.465mmol/L、硫酸鎂0.19mmol/L、葡萄糖2.66mmol/L、憐酸二氧鐘 0.3515mmol/L、氣化|丐 1.9mmol/L、乳酸納 12.18mmol/L、丙麗酸納0.3135mmol/L、碳酸氫鈉 3.8mmol/L、丙氨酰谷氨酰胺 0.95mmol/L、牛磺酸 0.095mmol/L>4-羥乙基哌嗪乙磺酸19.95mmol/L及非必需氨基酸9.5ml/L ;該人血清白蛋白在清洗培養(yǎng)液中的含量為4.75g/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的精子洗滌液，其特征在于:該基礎(chǔ)液溶質(zhì)在清洗培養(yǎng)液中的含量如下:氯化鈉97.7mmol/L、氯化鉀4.70mmol/L、硫酸鎂0.20mmol/L、葡萄糖2.80mmol/L、憐酸二氧鐘 0.37mmol/L、氣化?丐 2.0mmol/L、乳酸納 12.84mmol/L、丙麗酸納 .0.33mmol/L、碳酸氫鈉4.0mmol/L、丙氨酰谷氨酰胺1.0mmol/L、?；撬?.10mmol/L、4_輕乙基哌嗪乙磺酸21.0mmol/L及非必需氨基酸10ml/L ;該人血清白蛋白在清洗培養(yǎng)液中的含量為5g/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的精子洗滌液，其特征在于:該基礎(chǔ)液溶質(zhì)在清洗培養(yǎng)液中的含量如下:氯化鈉102.585mmol/L、氯化鉀4.935mmol/L、硫酸鎂0.21mmol/L、葡萄糖.2.94mmol/L、憐酸二氧鐘 0.3885mmol/L、氣化韓 2.lmmol/L、乳酸納 13.48mmol/L、丙麗酸納.0.3465mmol/L、碳酸氫鈉 4.2mmol/L、丙氨酰谷氨酰胺 1.05mmol/L> 牛磺酸 0.105mmol/L>.4-羥乙基哌嗪乙磺酸22.05mmol/L及非必需氨基酸10.5ml/L ;該人血清白蛋白在清洗培養(yǎng)液中的含量為5.25g/L。
10.一種如權(quán)利要求3~9任意項(xiàng)所述的清子洗滌液的制備方法，其特征在于:它包括以下步驟: (1)、清洗培養(yǎng)液的配制: a、先按照各溶質(zhì)的含量和配制容量要求稱取或量取各溶質(zhì)，并分開放置；同時(shí)準(zhǔn)備好帶刻度調(diào)制容器和超純凈水，并將稱量好的超純凈水加入調(diào)制容器中； b、將除碳酸氫鈉外的各基礎(chǔ)液溶質(zhì)按先固體后液體的順序溶于調(diào)制容器內(nèi)的超純凈水中； C、向步驟b所得溶液中加入所量取的殺菌劑和所稱取的NaHC03溶質(zhì)，同時(shí)根據(jù)需要添加指不劑，得基礎(chǔ)液； d、向步驟c所得基礎(chǔ)液中加入所稱取的人血清白蛋白，震蕩或攪拌混合均勻，得原液； e、檢測(cè)步驟d所得的原液的滲透壓和pH值，通過滴加2M的HCl溶液或2M的NaOH溶液調(diào)整其PH值至7.20~7.40，并記錄最終滲透壓和pH值。 (2)、清洗培養(yǎng)液的處理: a、除菌，將上述的所得清洗培養(yǎng)液在超凈工作臺(tái)下利用0.2μπι的濾膜過濾除菌； b、分裝及冷存，在無菌環(huán)境下對(duì)過濾后的清洗培養(yǎng)液進(jìn)行分裝、封口，并放置于冰箱或冷庫內(nèi)在2~8°C條件下保存，得精子洗滌液； c、檢驗(yàn)，取分裝好的精子洗滌液進(jìn)行檢測(cè)；檢測(cè)項(xiàng)目包括pH值檢測(cè)、滲透壓檢測(cè)、細(xì)胞毒性檢測(cè)、皮內(nèi)刺激反應(yīng)檢測(cè)、致敏反應(yīng)檢測(cè)、無菌檢測(cè)、熱原檢測(cè)、內(nèi)毒素檢測(cè)、體外鼠胚試驗(yàn)和精子活力試驗(yàn)，以判斷該精子洗滌液是否合格。
【文檔編號(hào)】C12N5/076GK104164401SQ201410396987
【公開日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2014年8月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月12日
【發(fā)明者】王維華, 周淑梅, 黃永軍 申請(qǐng)人:沈陽潔瑞生物技術(shù)有限公司