亞全能干細(xì)胞的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了亞全能干細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟：組織的獲得，消毒處理，組織的分離、洗滌和剪碎，膠原酶消化，亞全能干細(xì)胞的獲得。本發(fā)明公開(kāi)了一種從臍帶、胎盤羊膜、絨毛膜或基蛻膜組織中分離亞全能干細(xì)胞的方法，獲得的亞全能干細(xì)胞均一、穩(wěn)定、生長(zhǎng)周期短。
【專利說(shuō)明】亞全能干細(xì)胞的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及干細(xì)胞工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種亞全能干細(xì)胞的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 干細(xì)胞是一類具有自我更新能力且在適合微環(huán)境下具有多系分化潛能的原始細(xì) 胞。根據(jù)個(gè)體發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)的先后次序不同，干細(xì)胞可分為胚胎干細(xì)胞、新生兒干細(xì)胞和 成體干細(xì)胞，按照干細(xì)胞分化潛能的不同，可以分為全能干細(xì)胞、亞全能干細(xì)胞、多能干細(xì) 胞和單能干細(xì)胞。目前，已有利用干細(xì)胞治療心肌梗塞、紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)損 傷和肌肉萎縮等。
[0003] 亞全能干細(xì)胞是指具有三胚層分化潛能的一類干細(xì)胞亞群，在特定環(huán)境下，理論 上可以誘導(dǎo)分化為人體任何一種組織細(xì)胞，主要來(lái)源于人體中廣泛存在的間充質(zhì)組織，特 別是骨髓、脂肪、臍帶和胎盤等間充質(zhì)組織，由于臍帶和胎盤來(lái)源的亞全能干細(xì)胞具有更為 原始和更為強(qiáng)大的增值能力，較強(qiáng)的分化能力，低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)功能，其在臨床上的 應(yīng)用價(jià)值越來(lái)越受人們關(guān)注。
[0004] 作為要應(yīng)用于臨床細(xì)胞治療的細(xì)胞產(chǎn)品，應(yīng)當(dāng)具有如下特點(diǎn)：組織取材方便，來(lái) 源廣泛，不受倫理限制；分離過(guò)程簡(jiǎn)單，無(wú)外源污染引入；外來(lái)添加物少，過(guò)程可控性強(qiáng)，重 復(fù)性好；可獲得足夠細(xì)胞，細(xì)胞活力好；培養(yǎng)周期短，成本低。目前亞全能干細(xì)胞的制備過(guò) 程中，獲得的亞全能干細(xì)胞不穩(wěn)定，且需要多次傳代才可獲得足夠的干細(xì)胞，因此生長(zhǎng)周期 長(zhǎng)。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)《人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞及其制備方法》(CN102127522)使用到了含抗生素 Hanks' Balanced Salt Solution和D-PBS溶液，成本高而且是科研研究用的，引入不要 的風(fēng)險(xiǎn)。其還使用II型膠原酶、IV型膠原酶、II型膠原酶和胰酶混合液、或II型膠原酶和 透明質(zhì)酸酶混合液中的一種。消化時(shí)間長(zhǎng)達(dá)6小時(shí)且效果一般。
[0006] 現(xiàn)有技術(shù)《一種利用胎盤小葉組織制備亞全能干細(xì)胞的方法》（申請(qǐng)?zhí)?201310170574. 9)。方法復(fù)雜且用到牛血清等試劑。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的提供亞全能干細(xì)胞的制備方法，解決上述現(xiàn)有技術(shù)問(wèn)題中的一個(gè)或 者多個(gè)。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，亞全能干細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟：
[0009] 亞全能干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
[0010] 步驟1分離、洗滌和剪碎臍帶組織，預(yù)處理提高制備效果。
[0011] 步驟2膠原酶消化：配制0. 1?2%的膠原酶，加入經(jīng)步驟2的臍帶組織，在37°C、 150rpm震蕩消化10?60min，得細(xì)胞懸液；
[0012] 步驟3)亞全能干細(xì)胞的獲得：向步驟2離心管內(nèi)補(bǔ)加等量生理鹽水，經(jīng)150目 篩網(wǎng)過(guò)濾，收集細(xì)胞初懸液，將細(xì)胞初懸液進(jìn)行梯度離心，細(xì)胞初懸液梯度離心分為三個(gè)梯 度，分別是2000rpm、lOmin，1500rpm、lOmin，1200rpm、lOmin，取梯度離心得到的細(xì)胞沉淀加 入培養(yǎng)基重懸，得到細(xì)胞懸液即為亞全能干細(xì)胞。使用此特點(diǎn)參數(shù)分離效果好對(duì)細(xì)胞傷害 小。獲得的亞全能干細(xì)胞均一、穩(wěn)定、生長(zhǎng)周期短。
[0013] 在一些實(shí)施方式中，組織的分離、洗滌和剪碎的步驟中，組織最優(yōu)剪碎時(shí)間為 10?15min，最優(yōu)剪碎大小為2?3mm 3。
[0014] 在一些實(shí)施方式中，膠原酶消化的步驟中，膠原酶的最優(yōu)濃度為0. 5%，37°C，最優(yōu) 消化時(shí)間為15?25min。由此消化時(shí)間縮短，消化效果仍可保證，且對(duì)細(xì)胞傷害小見(jiàn)表一和 圖1?7。
[0015] 在一些實(shí)施方式中，分離、洗滌和剪碎臍帶組織操作前進(jìn)行消毒處理。由此即使臍 帶組織采集環(huán)境條件不同，環(huán)境可能無(wú)法達(dá)到完全無(wú)菌的條件仍然可以保證亞全能干細(xì)胞 提取安全。
[0016] 在一些實(shí)施方式中，消毒處理方法為臍帶兩端結(jié)扎后，放入75%的酒精中浸泡 1?2min，用0. 9%生理鹽水清洗2?3次；胎盤羊膜面、絨毛膜和基蛻膜面用75%的酒精 棉順時(shí)針擦拭，重復(fù)一遍。不使用抗生素并根據(jù)組織特性消毒。
[0017] 在一些實(shí)施方式中，分離、洗滌和剪碎臍帶組織方法為：臍帶剔除一根臍靜脈和 兩根臍動(dòng)脈，獲得華通氏膠，將羊膜從胎盤上剝離，取下羊膜后剝離絨毛主干和游離絨毛膜 末端的基蛻膜，將不同的組織放入無(wú)菌皿內(nèi)，再使用〇. 9 %生理鹽水洗滌，去除殘余的紅細(xì) 胞，將處理好的組織放入離心管內(nèi)，用鈍頭無(wú)菌剪剪成0. 5?5mm3小塊，剪碎時(shí)間為10? 40min〇
[0018] 膠原酶P，其作用是消化細(xì)胞間的膠原組織，加速細(xì)胞解離出來(lái)，不對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生破 壞。選用這種特定酶經(jīng)過(guò)大量實(shí)踐篩選。
[0019] 華通氏膠為構(gòu)成臍帶的凝膠狀物質(zhì)，主要成份是黏多糖（Mucopolysaccharides)， 也含有成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，是一種黏膜組織。當(dāng)嬰兒分娩后，溫度的改變使華通氏膠內(nèi) 部的結(jié)構(gòu)發(fā)生蹋陷，從而鉗住臍帶內(nèi)的血管，此過(guò)程一般持續(xù)約五分鐘。華通氏膠內(nèi)的部份 細(xì)胞具有干細(xì)胞的特質(zhì)。
[0020] 本發(fā)明提供的亞全能干細(xì)胞的制備方法，還有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0021] 本發(fā)明可從一種從臍帶、胎盤羊膜、絨毛膜或基蛻膜組織中分離亞全能干細(xì)胞。
[0022] 本發(fā)明組織樣本經(jīng)過(guò)組織表面消毒和組織樣本的反復(fù)洗滌處理，避免采集環(huán)節(jié)出 現(xiàn)的污染。
[0023] 本發(fā)明樣本組織洗滌液為醫(yī)用0. 9%的生理鹽水，而非科研研究用的杜氏磷酸緩 沖液（DPBS)等，易于后續(xù)使用。
[0024] 本發(fā)明的干細(xì)胞分離技術(shù)結(jié)合專門的培養(yǎng)基，使細(xì)胞經(jīng)過(guò)一次傳代就可以獲得足 夠的干細(xì)胞用于儲(chǔ)存。細(xì)胞凍存代數(shù)越早，細(xì)胞的增殖，活力，分化能力就越好。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1為0· 5 %膠原酶P濃度作用下獲得的亞全能種子細(xì)胞活力圖；
[0026] 圖2為0. 1 %膠原酶P濃度作用下獲得的亞全能種子細(xì)胞活力圖；
[0027] 圖3為2%膠原酶P濃度作用下獲得的亞全能種子細(xì)胞活力圖；
[0028] 圖4為0.5%膠原酶P濃度作用下獲得的亞全能種子細(xì)胞24h換液后細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)圖；
[0029] 圖5為0. 1 %膠原酶P濃度作用下獲得的亞全能種子細(xì)胞24h換液后細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)圖；
[0030] 圖6為2%膠原酶P濃度作用下獲得的亞全能種子細(xì)胞24h換液后細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)圖；
[0031] 圖7為本發(fā)明提取的亞全能干細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0032] 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下面對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步 詳細(xì)說(shuō)明。
[0033] 實(shí)施例1
[0034] 組織的獲得：將新生兒的臍帶，置于無(wú)菌條件下，在12h內(nèi)分離，胎盤取自足月健 康孕婦，孕婦HBV抗原、抗HCV抗體，抗HIV抗體、抗梅毒螺旋體抗體、ALT、支原體等檢測(cè)項(xiàng) 目均為陰性，胎盤自手術(shù)臺(tái)取下后，浸在含有抗生素的0.9%的生理鹽水里，維持在4°C的 環(huán)境下保存；
[0035] 消毒處理：臍帶兩端結(jié)扎后，放入75%的酒精中浸泡1?2min，用0. 9%生理鹽水 清洗2?3次，剔除組織表面殘留的血液；胎盤羊膜面、絨毛膜和基蛻膜面用75%的酒精棉 順時(shí)針擦拭，重復(fù)一遍；環(huán)境可能無(wú)法達(dá)到完全無(wú)菌的條件仍然可以保證亞全能干細(xì)胞提 取安全，臍帶與胎盤羊膜面、絨毛膜、基蛻膜面根據(jù)其特性所以消毒處理不同，臍帶可以酒 精浸泡，胎盤羊膜面、絨毛膜和基蛻膜面脆弱不可浸泡酒精。
[0036] 組織的分離、洗滌和剪碎：臍帶剔除一根臍靜脈和兩根臍動(dòng)脈，獲得華通氏膠，將 羊膜從胎盤上剝離，取下羊膜后剝離絨毛主干和游離絨毛膜末端的基蛻膜，將不同的組織 放入無(wú)菌皿內(nèi)，再使用〇. 9%生理鹽水洗滌3次，去除殘余的紅細(xì)胞，將處理好的組織放入 50ml的離心管內(nèi)，10ml/管，用鈍頭無(wú)菌剪剪成1?3mm 3小塊，剪碎時(shí)間為10?15min ;
[0037] 膠原酶消化：配制0. 5%的膠原酶，在離心管中加入0. 5%的膠原酶充分混勻，在 37°C、150rpm震蕩消化15?25min。不同酶濃度作用下獲得的亞全能種子細(xì)胞數(shù)和活力的 比較見(jiàn)表一。
[0038] 表一：不同酶濃度作用下獲得的亞全能種子細(xì)胞數(shù)和活力的比較
[0039]

【權(quán)利要求】
1. 亞全能干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： 步驟1分離、洗滌和剪碎臍帶組織； 步驟2膠原酶消化：配制0. 1?2%的膠原酶，加入經(jīng)步驟2的臍帶組織，在37°C、 150rpm震蕩消化10?60min，得細(xì)胞懸液； 步驟3亞全能干細(xì)胞的獲得：向步驟2離心管內(nèi)的細(xì)胞懸液補(bǔ)加等量生理鹽水稀釋，經(jīng) 150目篩網(wǎng)過(guò)濾，收集細(xì)胞初懸液，將細(xì)胞初懸液進(jìn)行梯度離心，細(xì)胞初懸液梯度離心分為 三個(gè)梯度，分別是2000rpm、lOmin，1500rpm、lOmin，1200rpm、lOmin，取梯度離心得到的細(xì)胞 沉淀加入培養(yǎng)基重懸，得到細(xì)胞懸液即為亞全能干細(xì)胞懸液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞全能干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述組織的分離、洗 滌和剪碎的步驟中，組織最優(yōu)剪碎時(shí)間為10?15min，剪碎大小為2?3_ 3。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞全能干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述膠原酶消化的 步驟中，膠原酶的濃度為0. 5%，所述膠原酶為膠原酶P，37°C，消化時(shí)間為15?25min。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞全能干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述步驟1分離、洗 滌和剪碎臍帶組織操作前進(jìn)行消毒處理。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的亞全能干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述消毒處理方法 為臍帶兩端結(jié)扎后，放入75%的酒精中浸泡1?2min，用0. 9%生理鹽水清洗2?3次；胎 盤羊膜面、絨毛膜和基蛻膜面用75%的酒精棉順時(shí)針擦拭，重復(fù)一遍。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞全能干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述分離、洗滌和剪 碎臍帶組織方法為：臍帶剔除一根臍靜脈和兩根臍動(dòng)脈，獲得華通氏膠，將羊膜從胎盤上剝 離，取下羊膜后剝離絨毛主干和游離絨毛膜末端的基蛻膜，將不同的組織放入無(wú)菌皿內(nèi)，再 使用0. 9%生理鹽水洗滌，去除殘余的紅細(xì)胞，將處理好的組織放入離心管內(nèi)，用鈍頭無(wú)菌 剪剪成〇· 5?5mm3小塊，剪碎時(shí)間為10?40min。
【文檔編號(hào)】C12N5/0775GK104152408SQ201410400235
【公開(kāi)日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年8月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月14日
【發(fā)明者】王軍霞, 黃福來(lái) 申請(qǐng)人:黃福來(lái)