用于檢測腸癌的標(biāo)記物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于檢測腸癌的標(biāo)記物，還涉及所述標(biāo)記物在檢測腸癌中的應(yīng)用以及相關(guān)的試劑盒和檢測方法。
【專利說明】用于檢測腸癌的標(biāo)記物及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域，涉及用于檢測腸癌的標(biāo)記物，還涉及所述標(biāo) 記物在檢測腸癌中的應(yīng)用以及相關(guān)的試劑盒和檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，占胃腸道腫瘤的第二位。好發(fā)部位為直腸及直腸 與乙狀結(jié)腸交界處，占60%。隨著人民生活方式和膳食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死 亡率呈逐年上升的趨勢，發(fā)病多在40歲以后，男女之比為2:1。目前.結(jié)直腸癌早期診斷的 方法包括大便隱血檢測（Fecal occult blood test, F0BT)、結(jié)腸鏡檢測（Colonoscopy)、 糞便DNA突變檢測和糞便RNA特異性基因檢測等，鋇灌腸（Double-contrast barium enema，DCBE)等。結(jié)腸鏡檢測被認為是診斷結(jié)直腸癌的金標(biāo)準(zhǔn)，但是它為侵入性檢查，需要 腸道準(zhǔn)備，檢查過程中有發(fā)生并發(fā)癥如出血及穿孔危險，患者接受性不高，且花費較大。大 便隱血檢測雖然為非侵入性檢測，但是檢查結(jié)果容易受飲食等因素的影響，并且對于篩查 結(jié)直腸癌而言.糞便隱血檢測的靈敏度和特異性不夠理想。
[0003] 成熟的microRNA (miRNA)是一類不編碼蛋白質(zhì)的單鏈的RNA，由18 - 24個堿基 組成，與相應(yīng)的mRNA結(jié)合導(dǎo)致mRNA分解或沉默，從而起到對基因的調(diào)節(jié)作。近年來的研究 顯示，miRNA的特異性表達與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，某些miRNA甚至可以起到抑癌基因或 癌基因的作用。環(huán)氧化酶（C0X)是前列腺素合成過程中的重要限速酶，C0X2在正常組織 中不表達，但可在各種刺激因素的作用下誘導(dǎo)表達，故又被稱為誘導(dǎo)型早期反應(yīng)基因，與腫 瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，C0X2在大部分頭頸腫瘤中過表達，Cox2也 是腸癌的生物標(biāo)志之一。因此，如果能夠研發(fā)出的相應(yīng)的腸癌試劑盒使之能夠應(yīng)用于科研 領(lǐng)域，將極大地促進腸癌篩查研究及科研成果的轉(zhuǎn)化，對于腸癌的診療必將起到巨大的推 動作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-92a、miRNA-135b、miRNA-18a、miRNA-221、miRNA-19、 miRNA-223、miRNA-301a的上調(diào)表達與人類多種腫瘤（如腸癌）的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，提示對 檢測糞便和血清 miRNA-92a、miRNA-135b、miRNA-18a、miRNA-221、miRNA-19、miRNA-223、 miRNA-301a的表達檢測可以成為腫瘤如腸癌檢測的指標(biāo)之一。
[0005] 本發(fā)明提供用于檢測腸癌的引物、探針和試劑盒（尤其是用于檢測糞便和血清 miRNA-92a、miRNA-135b、miRNA-18a、miRNA-221、miRNA-19、miRNA-223、miRNA-301a 和 C0X2)的核酸及檢測方法。
[0006] 本發(fā)明包括以下技術(shù)方案： 1.腸癌檢測試劑盒，其包含選自SEQ ID N0: 9-27所示的引物和/或探針。
[0007] 2.上述1所述的試劑盒，其包含選自SEQ ID N0: 9-15所示的一種或多種引物。
[0008] 3.上述1或2所述的試劑盒，其包含SEQ ID N0: 23所示的引物。
[0009] 4.上述1 - 3中任一項所述的試劑盒，其包含SEQ ID NO: 24和/或27所示的 探針。
[0010] 5.上述1 - 4中任一項所述的試劑盒，其包含選自SEQ ID N0: 16 - 22和25 - 26所示的一種或多種引物。
[0011] 6.上述1 一 5中任一項所述的試劑盒，其包含選自以下的一組或多組引物和探 針： SEQ ID N0: 9、16、23 和 24 ; SEQ ID N0: 10、17、23 和 24 ; SEQ ID N0: 11、18、23 和 24 ; SEQ ID N0: 12、19、23 和 24 ; SEQ ID N0: 13、20、23 和 24 ; SEQ ID N0: 14、21、23 和 24 ; SEQ ID N0: 15、22、23 和 24 ;和 SEQ ID NO: 25-27〇
[0012] 7.上述1 一 6中任一項所述的試劑盒，其中所述探針帶有熒光標(biāo)記。
[0013] 8.上述7所述的試劑盒，其中所述探針的5'用FAM標(biāo)記，而所述探針的3'用 TAMRM標(biāo)記。
[0014] 9.試劑在制備腸癌檢測試劑盒中的用途，其中所述試劑用于測定選自以下的一 種或多種標(biāo)記物：miRNA-92a、miRNA-135b、miRNA-18a、miRNA-221、miRNA-19、miRNA-223、 miRNA-301a和C0X2,所述試劑優(yōu)選選自SEQ ID NO: 9-27所示的一種或多種引物和/或探 針。
[0015] 10.腸癌檢測方法，包括檢測樣品中選自以下的一種或多種標(biāo)記物的水平： miRNA-92a、miRNA-135b、miRNA-18a、miRNA-221、miRNA-19、miRNA-223、miRNA-301a 和 C0X2,所述樣品優(yōu)選為糞便和/或血清樣品，優(yōu)選使用選自SEQ ID NO: 9-27所示的一種或 多種引物和/或探針檢測所述標(biāo)記。
[0016] 本發(fā)明的試劑盒和方法采用水解探針法TaqMan技術(shù)的設(shè)計方法（圖1)，除了一對 特異性引物，用TaqMan探針法增加一條與模版互補的基因特異性探針(通常20- 30bp)，特 異性高。此外，探針上5'端和3'端還可以分別標(biāo)記一個熒光報告基團，增強靈敏度。本發(fā) 明的引物、探針、試劑盒和方法適用腸癌患者的檢測和診斷。
[0017] 用于腸癌檢測的引物和探針優(yōu)選為： (1)用于檢測miR-92a的逆轉(zhuǎn)錄引物、探針及檢測引物如下所示： miRNA-92a-RT (逆轉(zhuǎn)錄引物）： 5'-GCTCAACCAGTGAGGCGTCCACGCCTGCCGTTCGCACTGGATGCACTGGTTGAGC CAGGCC-3' ； miRNA-92a_F : 5'-CTGCTGCTATTGCACTTGTCC-3' ； 通用下游引物（miRNA-92a-R ): 5， 一 GCTCAACCAGTGAGGCGTC-3，； 通用探針（miRNA-92a-B): 5'-CGCCTGCCGTTCGCACTGGAT-3' ； (2) 用于檢測miRNA-135b的逆轉(zhuǎn)錄引物、探針及檢測引物如下所示： miRNA-135b-RT (逆轉(zhuǎn)錄引物）： 5'-GCTCAACCAGTGAGGCGTCCACGCCTGCCGTTCGCACTGGATGCACTGGTTGAGC TCACAT-3' ； miRNA-135b-F ： 5'-TGCTGCTATGGCTTTTCATTCCT-3' ； 通用下游引物（miRNA-135b-R ): 5,-GCTCAACCAGTGAGGCGTC-3，； 通用探針（miRNA-135b-B): 5'-CGCCTGCCGTTCGCACTGGAT-3' ； (3) 用于檢測miRNA-18a的逆轉(zhuǎn)錄引物、探針及檢測引物逆轉(zhuǎn)錄引物如下所示； miRNA-18a-RT (逆轉(zhuǎn)錄引物）： 5'-GCTCAACCAGTGAGGCGTCCACGCCTGCCGTTCGCACTGGATGCACTGGTTGAGC CTATCT-3' ； miRNA-18a-F (檢測用上游引物）： 5'-CTGCTGTAAGGTGCATCTAGTGC-3' ； 通用下游引物（miRNA-18a-R ): 5,-GCTCAACCAGTGAGGCGTC-3，； 通用探針（miRNA-18a-B): 5'-CGCCTGCCGTTCGCACTGGAT-3' ； (4) 用于檢測miR-221的逆轉(zhuǎn)錄引物、探針及檢測引物如下所示： miR-221-RT (逆轉(zhuǎn)錄引物）： 5'-GCTCAACCAGTGAGGCGTCCACGCCTGCCGTTCGCACTGGATGCACTGGTTGAGC GAAACC-3' ； miR-221-F(上游引物）： 5'-GCTGCAGCTACATTGTCTGCTG-3' ； 通用下游引物（miR-221-R ): 5,-GCTCAACCAGTGAGGCGTC-3，； 通用探針（miR-221-B): 5'-CGCCTGCCGTTCGCACTGGAT-3' ； (5) 用于檢測miRNA-19的逆轉(zhuǎn)錄引物、探針及檢測引物如下所示： miRNA-19-RT (逆轉(zhuǎn)錄引物）： 5'-GCTCAACCAGTGAGGCGTCCACGCCTGCCGTTCGCACTGGATGCACTGGTTGAGC TCAGTT-3' ； miRNA-l9_F(上游引物）：5'-TGCTGCTGTGCAAATCTATGCAA_3' ； 通用下游引物（miRNA-19-R ):5'-GCTCAACCAGTGAGGCGTC-3' ； 通用探針（miRNA-19-B): 5'-CGCCTGCCGTTCGCACTGGAT-3' ； (6) 用于檢測miRNA-223的逆轉(zhuǎn)錄引物、探針及檢測引物如下所示： miRNA-223-RT (逆轉(zhuǎn)錄引物）： 5'-GCTCAACCAGTGAGGCGTCCACGCCTGCCGTTCGCACTGGATGCACTGGTTGAGC TGGGGT-3' ； miRNA-223-F(上游引物）：5'-CTGCTGCTGTCAGTTTGTCAAAT-3' ； 通用下游引物（miRNA-223-R ):5'-GCTCAACCAGTGAGGCGTC-3' ； 通用探針（miRNA-223-B): 5'-CGCCTGCCGTTCGCACTGGAT-3' ； (7) 用于檢測miRNA-301a的逆轉(zhuǎn)錄引物、探針及檢測引物如下所示： miRNA-301a-RT (逆轉(zhuǎn)錄引物）： 5'-GCTCAACCAGTGAGGCGTCCACGCCTGCCGTTCGCACTGGATGCACTGGTTGAGC GCTTTG-3' ； miRNA_3〇la-F(上游引物）：5'-CTGCTGCCAGTGCAATAGTATTGT_ 3' ； 通用下游引物（miRNA-301a-R ):5'-GCTCAACCAGTGAGGCGTC-3' ； 通用探針（miRNA-301a-B): 5'-CGCCTGCCGTTCGCACTGGAT-3' T ; (8) 用于檢測C0X2的引物和探針如下所示： C0X2-B (探針）： 5'-TCCTCAAAAGATTCATAGGGCTTCAGC-3' ； C0X2-F(上游引物）：5'-CACTTGACCAGAGCAGAGAGATGA-3' ； C0X2-R(下游引物）：5' -TAGAGCGCTTCTAACTCTGCAGC-3'。
[0018] microRNA 所述引物的序列是根據(jù) microRNA 數(shù)據(jù)庫（http://www. mirbase. org/)中報道的核苷酸序列 miRNA-92a (MIMAT0000092)、miRNA-135b (MIMAT0000758)、 miRNA-18a (MIMAT0000072), miRNA-221 (MIMAT0000278), miRNA-19 (MIMAT0000073), miRNA-223 (MIMAT0000280)、miRNA-301a (MIMAT0000688)以及 GeneBank 數(shù)據(jù)庫中的 C0X2 序列（JN793538 )為模板設(shè)計的。表1列出了所述miRNA的核苷酸序列。
[0019] 表 1

【權(quán)利要求】
1. 腸癌檢測試劑盒，其包含選自SEQ ID NO: 9-27所示的引物和/或探針。
2. 權(quán)利要求1所述的試劑盒，其包含一種或多種選自SEQ ID NO: 9-15所示的引物。
3. 權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其包含SEQ ID NO: 23所示的引物。
4. 權(quán)利要求1 - 3中任一項所述的試劑盒，其包含SEQ ID NO: 24和/或27所示的探 針。
5. 權(quán)利要求1 一 4中任一項所述的試劑盒，其包含一種或多種選自SEQ ID NO: 16 - 22和25 - 26所示的引物。
6. 權(quán)利要求1 一 5中任一項所述的試劑盒，其包含選自以下的一組或多組引物和探 針： SEQ ID NO: 9、16、23 和 24 ; SEQ ID NO: 10、17、23 和 24 ; SEQ ID NO: 11、18、23 和 24 ; SEQ ID NO: 12、19、23 和 24 ; SEQ ID NO: 13、20、23 和 24 ; SEQ ID NO: 14、21、23 和 24 ; SEQ ID NO: 15、22、23 和 24 ;和 SEQ ID NO: 25-27〇
7. 權(quán)利要求1 一 6中任一項所述的試劑盒，其中所述探針帶有熒光標(biāo)記。
8. 權(quán)利要求7所述的試劑盒，其中所述探針的5'用FAM標(biāo)記，而所述探針的3'用 TAMRM標(biāo)記。
9. 試劑在制備腸癌檢測試劑盒中的用途，其中所述試劑用于測定選自以下的一種 或多種標(biāo)記物：miRNA-92a、miRNA-135b、miRNA-18a、miRNA-221、miRNA-19、miRNA-223、 miRNA-301a和C0X2,所述試劑優(yōu)選為一種或多種選自SEQ ID NO: 9-27所示的引物和/或 探針。
10. 腸癌檢測方法，包括檢測樣品中選自以下的一種或多種標(biāo)記物的水平： miRNA-92a、miRNA-135b、miRNA-18a、miRNA-221、miRNA-19、miRNA-223、miRNA-301a 和 C0X2,所述樣品優(yōu)選為糞便和/或血清樣品，優(yōu)選使用一種或多種選自SEQ ID NO: 9-27所 示的引物和/或探針來檢測所述標(biāo)記。
【文檔編號】C12Q1/68GK104195238SQ201410403598
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月15日
【發(fā)明者】于浩洋, 蘇靜, 陳勉喬 申請人:深圳市晉百慧生物有限公司