一種從牛肝臟中提取谷氨酸脫氫酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從牛肝臟中提取谷氨酸脫氫酶的方法，將以牛肝臟為原料制備而來的谷氨酸脫氫酶粗提液，采用超濾濃縮和凝膠層析技術(shù)進(jìn)行谷氨酸脫氫酶的提取純化，取代了利用大量有機(jī)溶劑或無機(jī)鹽溶液等進(jìn)行提取的復(fù)雜工藝，一方面使提取工藝更加簡單易操作，大大降低了生產(chǎn)成本，另一方面將超濾濃縮產(chǎn)生的透過液重復(fù)回收利用，將每千克原料的水耗降低到2.0千克以下，避免了廢水的排放，是一種環(huán)境友好型生產(chǎn)工藝。另外，在搗碎過程中采用并補(bǔ)充預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液，使搗碎過程始終處于低溫下進(jìn)行，保證了谷氨酸脫氫酶的活性，所得谷氨酸脫氫酶酶活達(dá)到9000U/mg以上，產(chǎn)率達(dá)到21％以上。
【專利說明】一種從牛肝臟中提取谷氨酸脫氫酶的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種從牛肝臟中提取谷氨酸脫氫酶的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase.⑶H)是參與谷氨酸新陳代謝的關(guān)鍵酶之一，它以NAD或NADP或者同時(shí)利用NAD和NADP作為輔酶，可逆的催化谷氨酸脫氨，使之形成Q.酮戊二酸和氨，從而參與到谷氨酸的合成與分解中，在生物體的碳、氮代謝中起著非常重要的作用。
[0003]尿素氦試劑盒主要用于臨床上血清以及血漿中尿素氮含量的測定，以此作為對肝臟、腎臟疾病的鑒別、診斷以及療效觀察的指標(biāo)。雖然尿素氮含量測定的方法有許多，但脲酶.谷氨酸脫氫酶偶聯(lián)法以其獨(dú)特的優(yōu)勢被廣泛使用。該方法不需要特殊儀器，操作簡單，還不受含氮化合物的干擾，準(zhǔn)確度較高，適用于自動分析。
[0004]在許多的動物組織中，包括:腦、肝臟、腎臟、心臟、胰腺、卵巢以及淋巴結(jié)等，都發(fā)現(xiàn)有谷氨酸脫氫酶的存在。動物體內(nèi)的谷氨酸脫氫酶在催化反應(yīng)發(fā)生時(shí)既可以NAD作為輔酶，又可以NADP作為輔酶，但以NAD作為輔酶的催化效率要高出以NADP作為輔酶的效率的數(shù)倍。目前，已有從牛腦、魚肝、牛肝、豬肝及鴨肝等組織中分離純化谷氨酸脫氫酶的報(bào)道。
[0005]目前國內(nèi)報(bào)道的得到谷氨酸脫氫酶的方法有兩種:
[0006]一是發(fā)酵法生產(chǎn)，大連大學(xué)在申請?zhí)?01210106727.9的專利中提到的一種方法方法是將產(chǎn)生的⑶H的微生物進(jìn)行6-10次活化，再經(jīng)過微生物定向馴化4-6次，使其在24-30°C的環(huán)境下生長，然后按照常規(guī)方法經(jīng)過一級和二級種子罐，按照發(fā)酵液的3-9 %接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在24-30°C中培養(yǎng)60-114小時(shí)得到含有谷氨酸脫氫酶的發(fā)酵液，然后經(jīng)過發(fā)酵液的分離提取純化得到谷氨酸脫氫酶。西藏金稞集團(tuán)公司在申請?zhí)枮?01110449716.6的專利中，提出了一種由谷氨酸棒桿菌發(fā)酵、制備粗酶液、離子交換層析、疏水分離等一系列的工藝得到最后產(chǎn)品谷氨酸脫氫酶。這類發(fā)酵工藝的主要弊端就是發(fā)酵產(chǎn)率低、工藝長而且復(fù)雜，導(dǎo)致生產(chǎn)成本很高。而且這些工藝目前都處于起步研究階段，穩(wěn)定性和持續(xù)性很值得商榷。
[0007]二是從動物內(nèi)臟中提取谷氨酸脫氫酶的工藝。
[0008]目前國內(nèi)對從動物內(nèi)臟中提取谷氨酸脫氫酶的工藝比較多，從工藝路線上來看大部分都大同小異，西藏金稞集團(tuán)公司在申請?zhí)枮?01110422831.4的專利中提出了由動物內(nèi)臟中提取谷氨酸脫氫酶的一種方法，大致工藝路線由動物內(nèi)臟一絞碎一抽提一粗酶液一酸沉淀一硫酸銨鹽析一磷酸鈣凝胺吸附一離心一上清透析一冷凍、干燥一試劑制備一谷氨酸脫氫酶成品，經(jīng)過這大量的步驟得到最后的產(chǎn)品谷氨酸脫氫酶。這類型工藝的典型問題就是工藝路線長，而且工藝復(fù)雜，要用到大量的無機(jī)鹽沉淀，對環(huán)境造成不利影響的同時(shí)收率較低，而且生產(chǎn)過程中產(chǎn)生大量廢水，造成水資源的極大浪費(fèi)。朱鴻、李想韻等人在生物工程2010，VOL0 31，N0.1中發(fā)表題目為鴨肝谷氨酸脫氫酶的純化與酶學(xué)性質(zhì)研究的文章，其中涉及的谷氨酸脫氫酶提取工藝路線為:丙酮干粉的制備一粗提液的制備一重金屬離子沉淀一硫酸銨分級沉淀一DEAE-Sepharose離子交換層析一Sephacryl S-200凝膠過濾柱層析，這類型工藝中要用到大量的有機(jī)溶劑，且和上一類型的工藝有同樣的缺點(diǎn)，工藝路線長，收率低，既不環(huán)保而且工藝復(fù)雜難于操作。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有的谷氨酸脫氫酶提取工藝的不足，提供一種從牛肝臟中提取谷氨酸脫氫酶的方法，本發(fā)明以牛肝臟為原料制備谷氨酸脫氫酶粗提液，將所得粗提液采用超濾濃縮和凝膠層析技術(shù)進(jìn)行谷氨酸脫氫酶的提取及純化，取代利用大量有機(jī)溶劑提取、大量無機(jī)鹽沉淀等對環(huán)境污染的方法，且將超濾濃縮得到的大量透過液進(jìn)行重復(fù)利用，具有節(jié)能減排、經(jīng)濟(jì)環(huán)保且酶活損失小的優(yōu)點(diǎn)，適合工業(yè)化生產(chǎn)的要求。
[0010]本發(fā)明的技術(shù)方案為:
[0011]一種從牛肝臟中提取谷氨酸脫氫酶的方法，其特征在于，
[0012]以牛肝臟為原料提取獲得谷氨酸脫氫酶粗提液，將所得谷氨酸脫氫酶粗提液采用孔徑為0.004-0.006 μ m的中空纖維濾膜，以30_50L/h的流速進(jìn)行超濾濃縮，收集超濾截留液得到含有高濃度谷氨酸脫氫酶的谷氨酸脫氫酶濃縮液；
[0013]此外，還包括以下步驟:
[0014]步驟一、純化，將所得谷氨酸脫氫酶濃縮液采用superdex-200凝膠進(jìn)行凝膠過濾層析，用PH值為6.5-7.5的磷酸緩沖液對所述凝膠柱進(jìn)行洗脫，流速為2.0-3.0L/h,收集層析洗脫液得到純化的谷氨酸脫氫酶母液；
[0015]步驟二、冷凍干燥，將所得谷氨酸脫氫酶母液經(jīng)過冷凍干燥，既得所述谷氨酸脫氫酶。
[0016]優(yōu)選的是，所述的從牛肝臟中提取谷氨酸脫氫酶的方法中，所述谷氨酸脫氫酶粗提液的制備方法包括以下步驟:
[0017]步驟一、將切碎的牛肝臟和預(yù)冷至5-10°C的磷酸緩沖液按照體積比1: 6-10混合后，進(jìn)行搗碎20-30min，將搗碎后的物料于5_10°C攪拌3_5h，得到牛肝勻漿；
[0018]步驟二、將所得牛肝勻漿在5-20°C條件下進(jìn)行真空壓濾，收集過濾液既得所述谷氨酸脫氫酶粗提液。
[0019]優(yōu)選的是，所述的從牛肝臟中提取谷氨酸脫氫酶的方法中，搗碎過程中所用磷酸緩沖液的PH值為6.5-7.5，且在搗碎過程中至少補(bǔ)充一次預(yù)冷至5-10°C的磷酸緩沖液，補(bǔ)充的磷酸緩沖液的量以磷酸緩沖液的總加入量低于牛肝臟與磷酸緩沖液的最大體積比為準(zhǔn)。
[0020]優(yōu)選的是，所述的從牛肝臟中提取谷氨酸脫氫酶的方法中，采用ΧΤΖ?_Φ260/Φ200真空過濾機(jī)，孔徑為0.4-0.6mm的棉綸濾布對牛肝勻漿進(jìn)行真空壓濾。
[0021]優(yōu)選的是，所述的從牛肝臟中提取谷氨酸脫氫酶的方法中，將所述超濾濃縮得到的透過液進(jìn)行收集，并調(diào)節(jié)所得透過液的PH值為6.5-7.5并預(yù)冷至5-10°C后，與切碎的牛肝臟混合后進(jìn)行搗碎。
[0022]優(yōu)選的是，所述的從牛肝臟中提取谷氨酸脫氫酶的方法中，在進(jìn)行凝膠過濾層析之前用PH值為6.5-7.5的磷酸緩沖液對所述凝膠柱進(jìn)行沖洗。
[0023]優(yōu)選的是，所述的從牛肝臟中提取谷氨酸脫氫酶的方法中，步驟二中冷凍干燥溫度為-55—60°C。
[0024]優(yōu)選的是，所述的從牛肝臟中提取谷氨酸脫氫酶的方法中，所用磷酸緩沖液的濃度均為 0.09-0.llmol/L。
[0025]本發(fā)明具有以下有益效果:首先，本發(fā)明將以牛肝臟為原料制備而來的谷氨酸脫氫酶粗提液，采用超濾濃縮和凝膠層析技術(shù)進(jìn)行谷氨酸脫氫酶的提取純化，取代了利用大量有機(jī)溶劑或無機(jī)鹽溶液等進(jìn)行提取的復(fù)雜工藝，一方面使提取工藝更加簡單易操作，大大降低了生產(chǎn)成本，另一方面由于可將超濾濃縮產(chǎn)生的透過液重復(fù)回收利用，將每千克原料的水耗降低到2.0千克以下，避免了一般提取工藝中大量廢水的排放，是一種環(huán)境友好型生產(chǎn)工藝，具有節(jié)能環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)。
[0026]其次，本發(fā)明在對牛肝臟的搗碎過程中采用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液，并在搗碎過程中補(bǔ)充預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液，大幅度減少了在搗碎過程中由于機(jī)械摩擦升溫導(dǎo)致的酶失活，使搗碎過程始終處于低溫下進(jìn)行，從而最大限度地保持了谷氨酸脫氫酶的活性，同時(shí)，由于提取過程中未采用有機(jī)溶劑及其他酸溶液進(jìn)行沉淀，也避免了有機(jī)溶劑或酸溶液對谷氨酸脫氫酶造成一定的破壞，使本發(fā)明所述方法提取得到的谷氨酸脫氫酶酶活至少達(dá)到9000U/mg以上，甚至達(dá)到20000U/mg，產(chǎn)品回收率達(dá)到21 %以上，均高于現(xiàn)有的從動物內(nèi)臟中提取谷氨酸脫氫酶的方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為本發(fā)明所述的從牛肝臟中提取谷氨酸脫氫酶的方法的工藝流程圖。

【具體實(shí)施方式】
[0028]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域普通技術(shù)人員參閱本說明書后能夠據(jù)以實(shí)施。
[0029]如圖1所示，一種從牛肝臟中提取谷氨酸脫氫酶的方法，其中，
[0030]以牛肝臟為原料提取獲得谷氨酸脫氫酶粗提液，將所得谷氨酸脫氫酶粗提液采用孔徑為0.004-0.006 μ m的中空纖維濾膜為組件的超濾設(shè)備，本發(fā)明所采用濾膜為由吉林金賽提供的GP4012濾膜，孔徑為0.005 μ m，并以30_50L/h的流速進(jìn)行超濾濃縮，截留分子量10萬以上的肽鏈，收集超濾截留液得到含有高濃度谷氨酸脫氫酶的谷氨酸脫氫酶濃縮液；而將超濾透過液回收到儲蓄罐中，并利用鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)透過液的pH值為6.5~7.5備用。在進(jìn)行超濾濃縮之前先用純凈水對超濾設(shè)備進(jìn)行沖洗，將超濾設(shè)備的管道及容器沖洗干凈后再加入所述谷氨酸脫氫酶粗提液進(jìn)行超濾濃縮。
[0031]此外，還包括以下步驟:
[0032]步驟一、純化，將所得谷氨酸脫氫酶濃縮液采用superdex-200凝膠柱進(jìn)行凝膠過濾層析，裝柱后，在進(jìn)行凝膠過濾層析之前用濃度為0.09-0.llmol/L，pH值為6.5-7.5的磷酸緩沖液對所述凝膠柱進(jìn)行沖洗，上樣后用濃度為0.09-0.llmol/L, pH值為6.5-7.5的磷酸緩沖液對凝膠柱進(jìn)行洗脫，流速為2.0-3.0L/h,收集層析洗脫液得到純化的谷氨酸脫氫酶母液；所用superdex-200是葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠混合后的產(chǎn)品，是最新的分子篩材料，和SephacrylS-200相比，具有剛性好、流速快的特點(diǎn)，更加適用于谷氨酸脫氫酶濃縮液的純化。
[0033]步驟二、冷凍干燥，將所得谷氨酸脫氫酶母液經(jīng)過冷凍干燥，既得所述谷氨酸脫氫酶產(chǎn)品，冷凍干燥溫度為-55—60°C，優(yōu)選_60°C，所用冷凍干燥儀器為FD — 27壓蓋型冷凍干燥機(jī)。
[0034]所述的從牛肝臟中提取谷氨酸脫氫酶的方法中，所述谷氨酸脫氫酶粗提液的制備方法包括以下步驟:
[0035]步驟一、將新鮮牛肝臟用水洗凈后切碎，將切碎的牛肝臟和預(yù)冷至5-10°C的pH值為6.5-7.5的磷酸緩沖液按照體積比1: 6-10混合后，用組織搗碎勻漿機(jī)進(jìn)行搗碎20-30min，勻漿機(jī)轉(zhuǎn)速為2000-3000r/min，將搗碎后的物料于5_10°C攪拌3_5h，得到牛肝勻漿，其中保持低溫的方式通過將搗碎后的物料置于冷凍機(jī)中進(jìn)行攪拌來實(shí)現(xiàn)。可在進(jìn)行搗碎之前先按照體積比加入預(yù)冷至5-10°C的磷酸緩沖液，在搗碎過程中至少補(bǔ)充一次少量的預(yù)冷至5-10°C的磷酸緩沖液，用以使物料在搗碎過程中始終保持一個(gè)低溫環(huán)境，有效避免溫度升高對谷氨酸脫氫酶酶活的降低，補(bǔ)充的磷酸緩沖液的量以磷酸緩沖液的總加入量低于牛肝臟與磷酸緩沖液的最大體積比為準(zhǔn)。另外，本發(fā)明中所用的磷酸緩沖液的濃度均優(yōu)選 0.lmol/Lo
[0036]步驟二、將所得牛肝勻漿在5_20°C條件下進(jìn)行真空壓濾，由于過濾過程中具有一定的壓力，在壓力作用下有利于谷氨酸脫氫酶更充分地溶出，收集過濾液既得所述谷氨酸脫氫酶粗提液。本發(fā)明中采用XTZL-Φ 260/Φ 200真空過濾機(jī)，孔徑為0.4-0.6mm的棉綸濾布對牛肝勻漿進(jìn)行真空壓濾。
[0037]所述的從牛肝臟中提取谷氨酸脫氫酶的方法中，將所述超濾濃縮得到的透過液進(jìn)行收集，并調(diào)節(jié)所得透過液的PH值為6.5-7.5并預(yù)冷至5-10°C后，替代磷酸緩沖液與切碎的牛肝臟混合后進(jìn)行搗碎，從而將超濾產(chǎn)生的大量透過液回收利用，實(shí)現(xiàn)提取工藝中的廢水零排放。
[0038]實(shí)施例1
[0039]將新鮮牛肝50kg用自來水洗凈，切碎，加入預(yù)冷至5°C的6倍體積的pH值為6.5的磷酸緩沖液中，用組織搗碎勻漿機(jī)搗碎20分鐘，并在搗碎至1min時(shí)補(bǔ)充I倍體積的預(yù)冷至5°C的磷酸緩沖液，然后保持5°C下緩慢攪拌3.0小時(shí)，得到牛肝勻漿，將所得牛肝勻漿在保持溫度10°C下用XTZL-Φ 260/Φ200真空過濾機(jī)，孔徑為0.5mm的棉綸濾布進(jìn)行壓濾分離，過濾液為谷氨酸脫氫酶粗提液。先用純凈水沖洗超濾設(shè)備，確定超濾設(shè)備的管道及容器沖洗干凈后，將待進(jìn)行超濾的料液裝入超濾設(shè)備的原料槽，采用GP4012濾膜，以30L/h的流速進(jìn)行超濾濃縮，截留分子量10萬以上的母液既得所述谷氨酸脫氫酶濃縮液，而將透過液回收到儲罐中，然后調(diào)節(jié)透過液的PH值為6.5作為提取劑重復(fù)使用。將所得谷氨酸脫氫酶濃縮液采用superdex-200凝膠進(jìn)行凝膠過濾層析,裝柱后,用濃度為0.lmol/L, pH值為
6.5的磷酸緩沖液沖洗,上樣后用濃度為0.lmol/L, pH值為6.5的磷酸緩沖液進(jìn)行洗脫,流速為2.0L/h，收集洗脫液得到純化的谷氨酸脫氫酶母液。將純化后的谷氨酸脫氫酶母液用FD-27壓蓋型冷凍干燥機(jī)，在_60°C冷凍干燥，得到谷氨酸脫氫酶產(chǎn)品，酶活達(dá)到9000U/mg。
[0040]實(shí)例2.[0041 ] 將新鮮牛肝50kg用自來水洗凈，切碎，加入預(yù)冷至10°C的8倍體積的pH值為7.2的磷酸緩沖液中，用組織搗碎勻衆(zhòng)機(jī)搗碎25分鐘,并在搗碎至1min時(shí)補(bǔ)充I倍體積的預(yù)冷至10°C的磷酸緩沖液，然后保持10°C下緩慢攪拌4.0小時(shí)，得到牛肝勻漿，將所得牛肝勻漿在保持溫度10°c下用XTZL-Φ260/Φ200真空過濾機(jī)，孔徑為0.5mm的棉綸濾布進(jìn)行壓濾分離，過濾液為谷氨酸脫氫酶粗提液。先用純凈水沖洗超濾設(shè)備，確定超濾設(shè)備的管道及容器沖洗干凈后，將待進(jìn)行超濾的料液裝入超濾設(shè)備的原料槽，采用GP4012濾膜，以30L/h的流速進(jìn)行超濾濃縮，截留分子量10萬以上的母液既得所述谷氨酸脫氫酶濃縮液，而將透過液回收到儲罐中，然后調(diào)節(jié)透過液的PH值為7.2作為提取劑重復(fù)使用。將所得谷氨酸脫氫酶濃縮液采用superdex-200凝膠進(jìn)行凝膠過濾層析,裝柱后,用濃度為0.lmol/L, pH值為7.2的磷酸緩沖液沖洗,上樣后用濃度為0.lmol/L, pH值為7.2的磷酸緩沖液進(jìn)行洗脫，流速為3.0L/h，收集洗脫液得到純化的谷氨酸脫氫酶母液。將純化后的谷氨酸脫氫酶母液用FD-27壓蓋型冷凍干燥機(jī)，在_60°C冷凍干燥，得到谷氨酸脫氫酶產(chǎn)品，酶活達(dá)到10000U/
mg ο
[0042]盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的圖例。
【權(quán)利要求】
1.一種從牛肝臟中提取谷氨酸脫氫酶的方法，其特征在于， 以牛肝臟為原料提取獲得谷氨酸脫氫酶粗提液，將所得谷氨酸脫氫酶粗提液采用孔徑為0.004-0.006 μ m的中空纖維濾膜，以30_50L/h的流速進(jìn)行超濾濃縮，收集超濾截留液得到含有高濃度谷氨酸脫氫酶的谷氨酸脫氫酶濃縮液； 此外，還包括以下步驟: 步驟一、純化，將所得谷氨酸脫氫酶濃縮液采用superdex-200凝膠進(jìn)行凝膠過濾層析，用PH值為6.5-7.5的磷酸緩沖液進(jìn)行洗脫，流速為2.0-3.0L/h,收集層析洗脫液得到純化的谷氨酸脫氫酶母液； 步驟二、冷凍干燥，將所得谷氨酸脫氫酶母液經(jīng)過冷凍干燥，既得所述谷氨酸脫氫酶。
2.如權(quán)利要求1所述的從牛肝臟中提取谷氨酸脫氫酶的方法，其特征在于，所述谷氨酸脫氫酶粗提液的制備方法包括以下步驟: 步驟一、將切碎的牛肝臟和預(yù)冷至5-10°C的磷酸緩沖液按照體積比1: 6-10混合后，進(jìn)行搗碎20-30min，將搗碎后的物料于5_10°C攪拌3_5h，得到牛肝勻漿； 步驟二、將所得牛肝勻漿在5-20°C條件下進(jìn)行真空壓濾，收集過濾液既得所述谷氨酸脫氫酶粗提液。
3.如權(quán)利要求2所述的從牛肝臟中提取谷氨酸脫氫酶的方法，其特征在于，搗碎過程中所用磷酸緩沖液的pH值為6.5-7.5，且在搗碎過程中至少補(bǔ)充一次預(yù)冷至5-10°C的磷酸緩沖液，補(bǔ)充的磷酸緩沖液的量以磷酸緩沖液的總加入量低于牛肝臟與磷酸緩沖液的最大體積比為準(zhǔn)。
4.如權(quán)利要求2所述的從牛肝臟中提取谷氨酸脫氫酶的方法，其特征在于，采用XTZL-Φ 260/Φ 200真空過濾機(jī)，孔徑為0.4-0.6mm的棉綸濾布對牛肝勻漿進(jìn)行真空壓濾。
5.如權(quán)利要求2所述的從牛肝臟中提取谷氨酸脫氫酶的方法，其特征在于，將所述超濾濃縮得到的透過液進(jìn)行收集，并調(diào)節(jié)所得透過液的PH值為6.5-7.5并預(yù)冷至5-10°C后，與切碎的牛肝臟混合后進(jìn)行搗碎。
6.如權(quán)利要求1所述的從牛肝臟中提取谷氨酸脫氫酶的方法，其特征在于，在進(jìn)行凝膠過濾層析之前用PH值為6.5-7.5的磷酸緩沖液對所述凝膠柱進(jìn)行沖洗。
7.如權(quán)利要求1所述的從牛肝臟中提取谷氨酸脫氫酶的方法，其特征在于，步驟二中冷凍干燥溫度為-55—60°C。
8.如權(quán)利要求3或6所述的從牛肝臟中提取谷氨酸脫氫酶的方法，其特征在于，所用磷酸緩沖液的濃度均為0.09-0.llmol/L.
【文檔編號】C12N9/06GK104178465SQ201410408915
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月19日
【發(fā)明者】張春穎, 楊旭錦 申請人:西藏天虹科技股份有限責(zé)任公司