表達和純化rank胞外區(qū)域蛋白的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種表達和純化RANK胞外區(qū)域蛋白的方法。該方法包括：(1)構(gòu)建具有編碼RANK胞外區(qū)域的cDNA的載體，將該載體轉(zhuǎn)化到原核細胞中，從而得到以包涵體形式表達的重組RANK；(2)對該包涵體進行超聲處理，然后重新溶解在6M的鹽酸胍中，得到解離狀態(tài)的重組RANK；(3)重新折疊重組RANK；(4)將上清液利用瓊脂75柱進行分離；(5)通過SDS-PAGE收集并分析正確折疊的RANK。本發(fā)明提供的方法尤其適用于鼠RANK胞外區(qū)域蛋白的表達與純化。
【專利說明】表達和純化RANK胞外區(qū)域蛋白的方法
[0001] 本申請是基于申請日為2009年3月26日、申請?zhí)枮?00910080733.X、發(fā)明創(chuàng)造名 稱為"鼠 RANK/RANKL胞外復(fù)合體的晶體，制備其的方法及其應(yīng)用"專利申請的分案申請。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及純化和表達RANK胞外蛋白的方法，還提供了一種RANK/RANKL復(fù)合體 的晶體，尤其提供了 一種鼠 RANK/RANKL胞外蛋白形成的晶體。本發(fā)明提供了一種制備鼠 RANK/RANKL胞外復(fù)合體晶體的方法，以及該復(fù)合體結(jié)構(gòu)在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0003] 腫瘤壞死因子（TNF)家族中的細胞因子在諸如炎癥反應(yīng)、器官發(fā)生、宿主防御、 自身免疫和細胞凋亡等多種生物功能中扮演著重要的角色。這些生物調(diào)節(jié)因子是通過受 體-配體相互作用，從而引發(fā)細胞內(nèi)的信號傳遞以及細胞表型的改變而發(fā)揮相應(yīng)的生理作 用的。作為TNF家族成員的RANKL以及其受體RANK在生物體內(nèi)的多種活動中扮演著重要 的角色，其對于骨的重塑過程起到了重要的調(diào)節(jié)作用，并且RANK以及RANKL分子之間的相 互作用還可調(diào)節(jié)T細胞/樹突狀細胞的信號傳導(dǎo)、樹突狀細胞的存活以及淋巴組織的發(fā)育， 近年來受到了廣泛的關(guān)注。
[0004] 在人體骨的重塑過程中，破骨細胞是骨重塑的"啟動子"，成骨細胞是骨重塑的"調(diào) 節(jié)者"，骨吸收類疾病共同的病理特征為破骨細胞調(diào)節(jié)異常導(dǎo)致骨形成和骨吸收之間喪失 平衡，因此深入了解破骨細胞的激活機制將對于成功防治骨吸收類疾病的發(fā)生有著至關(guān)重 要的意義。1997年，幾個不同的研究小組發(fā)現(xiàn)了腫瘤壞死因子受體-配體超家族新成員：骨 保護蛋白（osteoprotegerin，0PG)、RANKL以及RANK ;隨后，多項研究相繼顯示：RANKL、0PG 具有調(diào)節(jié)破骨細胞分化、發(fā)育、影響其功能的作用，RANK是RANKL、0PG發(fā)揮作用的關(guān)鍵，它 們形成一個骨調(diào)節(jié)軸，來調(diào)節(jié)骨的重塑過程。
[0005] RANKL為一種II型跨膜蛋白，其多為三個單體聚合成的復(fù)合體，主要分布在活 化T細胞、骨髓基質(zhì)細胞及成骨細胞等細胞中，目前認為哺乳動物中存在三種RANKL蛋白： RANKL1、RANKL2、RANKL3,其中前兩種為膜結(jié)合蛋白，后一種為被分泌到胞外的可溶性蛋白。 人和大鼠的RANKL分子分別包含317、316個氨基酸殘基，具有87%的同源性；人類RANKL基 因位于13ql4,其啟動子區(qū)包含成骨細胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子cbaf-Ι的活性。RANKL mRNA 可在多種組織表達，以骨骼和淋巴組織中最高，在骨骼中，RANKL主要表達于骨小梁和骨髓； 在骨髓基質(zhì)細胞和成骨細胞均可檢測到RANKL mRNA。2004年Ito S等人以及國際專利申請 NO. W0 03/014077都披露了 RANKL的三維結(jié)構(gòu)，其全部內(nèi)容結(jié)合于此作為參考。各項研究表 明：每一個RANKL單體包括一個夾層結(jié)構(gòu)，其由兩個平面反平行β-折疊片層構(gòu)成。第一個 片層由β-鏈A"、A、H、C及F組成，第二個片層由B'、B、G、D及Ε組成，其中第一片層為內(nèi) 層β-片層，該片層富含疏水性氨基酸，并通過疏水作用與另外兩個RANKL相互結(jié)合，而B'、 B、G、D及E鏈形成外層β -片層，該片層多為帶電及極性氨基酸，負責(zé)與受體RANK結(jié)合；每 一個RANKL單體中的β -夾層結(jié)構(gòu)的一個邊緣、鏈E及F包裹相鄰單體的AHCFi3 -片層的 內(nèi)部疏水層從而形成RANKL三聚體結(jié)構(gòu)。RANKL三聚體的晶體結(jié)構(gòu)特征是：具有PZjA的 空間群，晶胞參數(shù)為a=65.3A士0.2入，b=82.〇A士0.2入，c=99.5A士0.2Α，以及空 間群R3,胞晶為a=b=150.6A士0.2人，c= 139.5A士0.2人。其形狀就像被截平了的錐 形，靠近膜的一端寬于遠端的頂點處。RANKL三聚體高55 A，底部直徑約為55 A，頂點處 的直徑約為35 A。
[0006] RANK是RANKL的受體，屬于TNF受體家族，是一種I型跨膜蛋白，人RANK分子在破 骨細胞前體細胞和成熟破骨細胞內(nèi)表達量較高。RANK基因定位于18q22. 1，其編碼的蛋白 質(zhì)在體內(nèi)以跨膜蛋白型存在，其表達于單核-巨噬細胞系、破骨細胞前體細胞、T淋巴細胞、 B淋巴細胞、樹突狀細胞等，表達于破骨細胞前體細胞膜表面的RANK介導(dǎo)RANKL的信號，發(fā) 揮調(diào)節(jié)破骨細胞分化的功能。
[0007] 當(dāng)配體RANKL與受體RANK的胞外區(qū)域結(jié)合后，導(dǎo)致了 RANK的激活，活化后的RANK 通過其胞內(nèi)區(qū)域的TRAF結(jié)合域與TRAF1、2、3、5、6等蛋白結(jié)合，并且通過這些TRAF蛋白激 活細胞內(nèi)的兩條重要的信號通路：JNK/SAPK通路和NF κ B信號通路。這兩條信號通路的激 活誘導(dǎo)了與破骨細胞分化相關(guān)的基因的表達，最終促進了破骨細胞的分化與成熟。而且， 各種骨代謝調(diào)節(jié)因子、激素參與RANKL-RANK-0PG軸信號的調(diào)節(jié)。與其它信號途徑一樣， RANKL-RANK-0PG軸信號也存在正反饋和負反饋調(diào)節(jié)。1 a，25-(0H)2D3、甲狀旁腺素、前列腺 素 E2、白介素 l、IL-6等骨吸收因子分別通過維生素 D受體介導(dǎo)通路、蛋白激酶A介導(dǎo)通路、 gpl30/STAT介導(dǎo)通路上調(diào)成骨細胞/骨髓基質(zhì)細胞RANKL mRNA表達；IL-l、TNF-a分別通 過激活破骨細胞表面的IL-1R和TNFR1加強RANKL信號；TGF-β則可增加破骨細胞表面的 RANK上調(diào)RANKL信號。
[0008] 作為RANKL-RANK-0PG信號系統(tǒng)調(diào)控破骨細胞分化的中心環(huán)節(jié)，RANKL與RANK之 間的相互作用及其促使RANK活化的微觀機制一直以來是骨吸收類疾病研究領(lǐng)域的熱點問 題。其焦點問題之一是RANKURANK蛋白以及RANKL-RANK復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)。雖然目前已 經(jīng)獲得了 RANKL蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，但是仍然沒有獲得RANK蛋白以及RANK/RANKL復(fù)合體的 晶體結(jié)構(gòu)，正是由于對該結(jié)構(gòu)的認識不足，所以學(xué)者們對于RANKL-RANK-0PG信號體系如何 被調(diào)控，以及受調(diào)控后RANKL-RANK-0PG執(zhí)行信號傳遞的微觀機制尚無明確的認識。這嚴重 影響了有關(guān)骨吸收類疾病致病機制的探索以及抗骨吸收藥物的研究。
[0009] 分析目前還未獲得RANK蛋白以及RANKL-RANK復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)的原因主要有以 下兩點：1. RANK蛋白較難于制備和純化。在RANK被發(fā)現(xiàn)至今的時間里，一直無 RANK蛋白 E.coli表達以及純化的相關(guān)報道。2.相對于包含RANKL在內(nèi)的TNF蛋白家族成員所具有 的較剛性的結(jié)構(gòu)，包括RANK在內(nèi)的TNFR蛋白家族成員其結(jié)構(gòu)具有較大的可變性，因而更難 于獲得結(jié)晶。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明提供了一種蛋白復(fù)合體晶體，其中所述復(fù)合體包括鼠 RANK/RANKL胞外區(qū) 域蛋白的氨基酸序列。所述鼠 RANKL的胞外區(qū)域是指所述RANKL單體C-末端從161位氨 基酸至316位氨基酸，所述RANK的胞外區(qū)域是指所述RANK單體N-末端從26位氨基酸至 210位氨基酸。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明提供的鼠 RANK/RANKL復(fù)合體晶體中，所述晶體屬于P63六邊形空間群 組，晶胞尺寸是a=b= 121.23 A和c=94.67A。
[0012] 在本發(fā)明提供的晶體中，該復(fù)合體包括由三個RANKL單體鏈形成的三聚體內(nèi)核， 以及另三個RANK單體鏈。RANK單體鏈分別結(jié)合在RANKL三聚體內(nèi)核上，從而形成六聚體。 每個RANK受體結(jié)合到由相鄰兩個RANKL配體亞單位形成的裂縫中；該六聚體復(fù)合體具有 10,161人2的溶劑可及表面積，由RANK貢獻5,340人2, RANKL貢獻4,821人2。
[0013] 在本發(fā)明提供的晶體中，RANK單體鏈的環(huán)120S(即殘基122-127)完全與配體 RANKL結(jié)合，在RANK單體鏈的兩個區(qū)域，即殘基182-185,以及殘基194-196形成2個短的 β -片層構(gòu)象，從而進一步形成較為有序的結(jié)構(gòu)域。
[0014] 在本發(fā)明提供的晶體中，在所述復(fù)合體中，RANK鄰近跨膜區(qū)域的胞外區(qū)域，即殘基 154-199是非常有序的，該殘基154-199區(qū)域包括CRD4結(jié)構(gòu)域。
[0015] 在本發(fā)明提供的晶體中，每一個RANK單體鏈都存在一個鈉離子，該鈉離子可與 RANK/RANKL 中的 Cys-134, Ala-135, Phe-138、Val-163 以及骨架上的 Ser-161 側(cè)鏈的羰基 基團螯合。
[0016] 在本發(fā)明提供的晶體中，每一個RANK單體的Asp-85與RANKL中的Lys-281和 Arg-283形成極性相互作用，RANK中的Glu-76與RANKL中的Gly-191的骨架形成氫鍵，RANK 中的Asp-124和Glu-126與RANKL中的His-179以及Lys-180形成極性相互作用，RANK中 的 Arg-129 和 Arg-130 分別與 RANKL 中的 Glu-225、Asn-266 和 Asp-268 相互作用，RANK 環(huán) 100S(殘基 102-112)上的 Ser-123 骨架（主干，backbone)羰基基團與 RANKL 的 Lys-180 相互作用形成氫鍵；RANK的環(huán)90S殘基Asp-94和Lys-97與RANKL中的Arg-222、Asp-299 和Asp-301形成極性相互作用。
[0017] 本發(fā)明提供了一種表達和純化RANK胞外蛋白的方法，包括：（1)構(gòu)建具有編碼 RANK胞外區(qū)域的cDNA的載體，將該載體轉(zhuǎn)化到原核細胞中，從而得到以包涵體形式表達的 重組RANK ; (2)對該包涵體進行超聲處理，然后重新溶解在6M的鹽酸胍中，得到解離狀態(tài)的 重組RANK ; (3)重新折疊所述重組RANK ; (4)利用瓊脂糖75色譜柱分離出重組RANK ; (5)通 過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)收集并分析正確折疊的RANK。本發(fā)明 提供的方法尤其適用于鼠 RANK胞外區(qū)域蛋白的表達與純化。
[0018] 在本發(fā)明提供的表達和純化方法中，編碼RANK蛋白的cDNA為鼠 RAW264. 7細胞的 mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)所獲得的產(chǎn)物。
[0019] 在本發(fā)明提供的表達和純化方法中，采用的原核細胞為E. coli菌株BL21-Gold。
[0020] 本發(fā)明還提供了一種制備RANK/RANKL胞外區(qū)域復(fù)合體晶體的方法，包括：（1) RANKL胞外區(qū)域的表達與純化：利用谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白方式表達可溶性RANKL， 并且利用谷胱苷肽瓊脂糖凝膠4B(Glutathione_Sepharose fast flow 4B beads)通過親 和純化法純化該融合單體，用PreScission蛋白酶進行切割。被切下的RANKL用瓊脂糖75 色譜柱純化，從而得到純化后的RANKL的胞外區(qū)域單體。（2)將根據(jù)上述表達和純化RANK 的方法而得到的RANK單體與該RANKL，在pH 7. 00的1M TRIS緩沖溶液中濃縮成10 mg/mL， 并以1:1比例混合；（3)在溫度為294K的條件下，利用高通量納升坐滴蒸汽擴散方法形成 RANK-RANKL胞外區(qū)域的晶體；（4)所述晶體在0. 1M磷酸二氫鈉，2M氯化鈉，0. 1M二氫磷酸 鉀和0. 1M MES(pH 6. 5)的條件下生長。該方法尤其適用于鼠 RANK/RANKL胞外區(qū)域復(fù)合體 晶體的制備。
[0021] 在本發(fā)明提供的形成RANK/RANKL復(fù)合體結(jié)晶的方法中，得到的晶體還可以在 20 %的PEG 3350以及0. 2M的甲酸銨中生長。該生長條件尤其適用于鼠 RANK/RANKL胞外 復(fù)合體晶體的生長。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明提供的RANK/RANKL復(fù)合體晶體在篩選治療骨吸收類疾病或抗骨吸收 藥物中的應(yīng)用，包括：根據(jù)復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)，通過計算機模擬來設(shè)計能阻斷復(fù)合體形成 的任一多肽、蛋白質(zhì)、抗體、免疫結(jié)合物、無機物或有機物，其中所述多肽、蛋白質(zhì)、抗體、免 疫結(jié)合物、無機物或有機物可以作用的位點選自以下作用位點組成的組中的一個或多個： RANK的Asp-85與RANKL中的Lys-281和Arg-283形成的作用位點、RANK中的Glu-76與 RANKL中的Gly-191的骨架形成的作用位點、RANK中的Asp-124和Glu-126與RANKL中的 His-179以及Lys-180形成的作用位點、RANK中的Arg-129和Arg-130分別與RANKL中的 Glu-225、Asn-266和Asp-268形成的作用位點、RANK環(huán)100S上的Ser-123的骨架羰基基 團與RANKL中的Lys-180形成的作用位點、RANK的環(huán)90S殘基Asp-94和Lys-97與RANKL 中的Arg-222、Asp-299和Asp-301形成的作用位點，以及所述RANK單體鏈的環(huán)120S的殘 基，即殘基122-127 ;其中，使得RANK與RANKL的結(jié)合力下降30%的多肽、蛋白質(zhì)、抗體、免 疫結(jié)合物、無機物或有機物為候選化合物；通過生物學(xué)實驗確定所述候選化合物在治療骨 吸收類疾病或抗骨吸收藥物中的應(yīng)用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1示出了 RANK/RANKL復(fù)合體的三維結(jié)構(gòu)；
[0024] 圖2A示出了復(fù)合體中三個RANK單體重疊的結(jié)果；
[0025] 圖2B示出了 RANK單體與TNFR1重疊、RANK與DR5重疊所得到的結(jié)果；
[0026] 圖3示出了 RANKL的構(gòu)型以及結(jié)合狀態(tài)與未結(jié)合狀態(tài)的RANKL的重疊得到的結(jié) 果；
[0027] 圖4示出了受體與配體相互作用中的上接觸區(qū)域以及下接觸區(qū)域；
[0028] 圖5示出了 TNFβ -TNFR1, Trail-DR5,和RANKL-RANK三種復(fù)合物的上接觸層中的 疏水鍵；
[0029] 圖6A示出了在RANK/RANKL相互作用中的重要殘基；
[0030] 圖6B是在圖6A的基礎(chǔ)上加有深色背景，以更清楚的識別RANK/RANKL相互作用中 的重要殘基；
[0031] 圖7示出了 mRANK與DR5以及TNFR1之間的等效氨基酸對。

【具體實施方式】
[0032] 一、表達及純化
[0033] 1.鼠 RANK胞外區(qū)域蛋白的表達及純化
[0034] 鼠 RANK的氨基酸序列如下：
[0035] MAPRARRRRQLPAPLLALCVLLVPLQVTLQVTPPCTQERHYEHLGRCCSRCEPGKYLSSKCTPTSDSV CLPCGPDEYLDTWNEEDKCLLHKVCDAGKALVAVDPGNHTAPRRCACTAGYHWNSDCECCRRNTECAPGFGAQHPL QLNKDTVCTPCLLGFFSDVFSSTDKCKPffTNCTLLGKLEAHQGTTESDVVCSSSMTLRRPPKEAQAYLPSLIVLL LFISWVVAAIIFGVYYRKGGKALTANLWNWVNDACSSLSGNKESS⑶RCAGSHSATSSQQEVCEGILLMTREEK MVPEDGAGVCGPVCAAGGPWAEVRDSRTFTLVSEVETQ⑶LSRKIPTEDEYTDRPSQPSTGSLLLIQQGSKSIPP FQEPLEVGENDSLSQCFTGTESTVDSEGCDFTEPPSRTDSMPVSPEKHLTKEIE⑶SCLPWVVSSNSTDGYTGSG NTPGEDHEPFPGSLKCGPLPQCAYSMGFPSEAAASMAEAGVRPQDRADERGASGSGSSPSDQPPASGNVTGNSNS TFISSGQVMNFK⑶IIVVYVSQTSQEGPGSAEPESEPVGRPVQEETLAHRDSFAGTAPRFPDVCATGAGLQEQGA PRQKDGTSRPVQEQGGAQTSLHTQGSGQCAE
[0036] 劃線部分為鼠 RANK胞外區(qū)域的氨基酸序列
[0037] 材料
[0038] 寡聚核苷酸由Sangon Biotech (China)制備而成；從Fermentas購得限制性內(nèi)切 酶、T4 DNA連接酶以及第一鏈cDNA合成試劑盒；從Tiangen Biotech (China)購得pfu DNA 聚合酶；從Sigma購得谷胱苷肽（還原型和氧化型）；谷胱苷肽瓊脂糖凝膠4B獲自通用電 氣醫(yī)療集團（GE Healthcare) ;TRIZ0L試劑購自Invitrogen. Inc.;所有其它得化學(xué)物質(zhì)均 為分析純。
[0039] 質(zhì)粒及菌株
[0040] 編碼成熟鼠 RANK胞外區(qū)域（殘基26-210)的cDNA為鼠 RAW264. 7細胞的mRNA 經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)所獲得，并且克隆到pET28載體（Novagen)中。用于GST-RANKL表 達的質(zhì)粒（殘基 159-361)獲贈于 Daved H. Fremont 教授（Department of Pathology and Immunology, Washington University School of Medicine, USA.),用 E. coli 菌株 BL21_Gold(購買于Stratagene公司）表達重組蛋白。
[0041] 表達及純化
[0042] 在E. coli菌株BL21-Gold(DE3)中，重組RANK主要以包涵體形式表達。該包涵 體通過超聲處理而被純化并且重新溶解在6M的鹽酸胍中。重組RANK的重新折疊通過如 下步驟而實現(xiàn)的：該包涵體稀釋在包含20mM的Na 2HP04(pH 7. 3)、1M L-精氨酸、20%甘油、 10mM還原型谷胱苷肽以及ImM氧化型谷胱苷肽的復(fù)性（IB)溶液中，然后在含有20mM的 Na2HP04(pH 7. 3)、0. 5M L-精氨酸、10%甘油的重新折疊緩沖液1中4°C下透析12小時，然 后在含有20mM的Na2HP0 4(pH 7. 3)、0. 2M L-精氨酸、5%甘油的重新折疊緩沖液2中4°C下 透析12小時，最后在20mM的Na2HP04(pH 7.3)、0.2M L-精氨酸中4°C下透析12小時，在 20000g離心10分鐘后，將上清液用75 (Superdex75)色譜柱（購自Amersham pharmacia公 司）進行純化，并且收集正確折疊的鼠 RANK，并用SDS-PAGE分析。
[0043] 2. RANKL的表達和純化
[0044] 鼠 RANKL的氨基酸序列如下：
[0045] MRRASRDYGKYLRSSEEMGSGPGVPHEGPLHPAPSAPAPAPPPAASRSMFLALLGLGLGQVVCSIALF LYFRAQMDPNRISEDSTHCFYRILRLHENADLQDSTLESEDTLPDSCRRMKQAFQGAVQKELQHIVGPQRFSGAPA MMEGSffLDVAQRGKPEAQPFAHLTINAASIPSGSHKVTLSSffYHDRGffAKISNMTLSNGKLRVNQDGFYYLYANI CFRHHETSGSVPTDYLQLMVYVVKTSIKIPSSHNLMKGGSTKNffSGNSEFHFYSINVGGFFKLRAGEEISIQVSN PSLLDPDQDATYFGAFKVQDID
[0046] 劃線部分為鼠 RANKL胞外區(qū)域的氨基酸序列
[0047] 鼠 RANKL的可溶性胞外區(qū)域是以谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白形式表達的；融 合蛋白利用谷胱苷肽瓊脂糖凝膠4B (購自Amersham Pharmacia公司）進行親和純化，用 PreScission蛋白酶進行切割；酶切所得的RANKL用瓊脂糖75(Superdex 75)色譜柱（購 自 Amersham pharmacia 公司）純化。
[0048] 二、RANK/RANKL復(fù)合體的結(jié)晶化
[0049] 以1:1的比例混合兩種純化得到的RANK單體蛋白以及RANKL單體蛋白而制得 RANK/RANKL復(fù)合體蛋白溶液。在溫度為294K的條件下，利用高通量納升坐滴蒸汽擴散 方法（sitting drop vapour diffusion method)形成 RANK/RANKL 胞外區(qū)域的晶體網(wǎng)格 (crystallization screen)，并且利用牛津蛋白產(chǎn)物工具中的自動結(jié)晶圖像系統(tǒng)進行監(jiān)控 (Mayo等2005，Walter等2005)。向初始的晶體網(wǎng)格給予9次沖擊（hit)，這9次沖擊中采 用的條件：PEG3350和低濃度的無機鹽（包括醋酸銨、甲酸銨或硝酸銨），每次都會有一個 發(fā)生變化。在以下兩個優(yōu)選條件下得到了生長情況最好的晶體：1)0. 1M磷酸二氫鈉，2M氯 化鈉，0. 1M二氫磷酸鉀和0. 1M MES(pH 6. 5) ;2)20%的PEG 3350以及0. 2M的甲酸銨，結(jié)晶 液滴中含有l(wèi)〇〇nL蛋白溶液以及100nL池液。在這兩個條件下生長的晶體具有相同的形態(tài) 學(xué)，通常為具有六角形橫截面的長棒狀。這些晶體通常在一周之內(nèi)出現(xiàn)，并且可以在兩個月 內(nèi)繼續(xù)生長直至最大尺寸。
[0050] 三、鼠 RANK/RANKL胞外區(qū)域復(fù)合體晶體的測定
[0051] 在條件1下得到RANK/RANKL復(fù)合體晶體的X-射線數(shù)據(jù)是在ESRF，利用光束線 ID23-EH2得到的。在0.873A下，從單晶的2個位置收集到衍射震蕩為1. 0°的180個圖 像。
[0052] 在波長1.060人下，利用鉆石的光束線1〇3得到了條件2下生長的復(fù)合體晶體的 X-射線數(shù)據(jù)。25%甘油作為冷凍保護劑加入到結(jié)晶液滴中，晶體被冷凍起來并且在整個數(shù) 據(jù)采集階段，采用氮氣的冷凍流來保持晶體處于100K。利用HKL2000(Ref.)對數(shù)據(jù)圖像進 行索引，積分和合并。表1中給出了對X-ray數(shù)據(jù)的統(tǒng)計數(shù)據(jù)。
[0053] 四、結(jié)果解析：
[0054] 1.晶體測試結(jié)果
[0055] 表1 X-射線衍射結(jié)果
[0056]

【權(quán)利要求】
1. 一種表達和純化RANK胞外區(qū)域蛋白的方法，包括： (1) 構(gòu)建具有編碼RANK胞外區(qū)域的cDNA的載體，將所述載體轉(zhuǎn)化到原核細胞中，從而 得到以包涵體形式表達的重組RANK ; (2) 對所述包涵體進行超聲處理，然后重新溶解在6M的鹽酸胍中，得到解離狀態(tài)的所 述重組RANK ; (3) 重新折疊所述重組RANK，所述重新折疊的過程包括： 將所述包涵體稀釋在包含20mM、pH值為7. 3的Na2HP04、lM L-精氨酸、20%甘油、10禮 還原型谷胱苷肽以及ImM氧化型谷胱苷肽的復(fù)性（IB)溶液中，得到第一復(fù)性液； 將所述第一復(fù)性液稀釋在含有20mM、pH值為7. 3的Na2HP04、0. 5M L-精氨酸、10%甘油 的重新折疊緩沖液1中4°C下透析12小時，得到第二復(fù)性液； 將所述第二復(fù)性液稀釋在含有20mM、pH值為7. 3的Na2HP04、0. 2M L-精氨酸、5%甘油 的重新折疊緩沖液2中4°C下透析12小時，得到第三復(fù)性液； 將所述第三復(fù)性液稀釋在20mM、pH值為7. 3的Na2HP04、0. 2M L-精氨酸中4°C下透析 12小時，得到第四復(fù)性液；將所述第四復(fù)性液離心，得上清液； (4) 將所述上清液利用瓊脂75柱進行分離； (5) 通過SDS-PAGE收集并分析正確折疊的RANK。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達和純化RANK胞外區(qū)域蛋白的方法，其中所述cDNA為鼠 RAW264. 7細胞的mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)所獲得的產(chǎn)物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達和純化RANK胞外區(qū)域蛋白的方法，其中所述原核細胞為 E. coli 菌株 BL21-Gold。
【文檔編號】C12N15/70GK104152481SQ201410410449
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2009年3月26日 優(yōu)先權(quán)日:2009年3月26日
【發(fā)明者】唐佩福, 劉長振, 黃鵬, 張世謙, 高斌 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院, 北京表源生物技術(shù)有限公司