編碼雙峰駝嗅覺(jué)感受器的核苷酸序列、雙峰駝嗅覺(jué)感受器及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了編碼雙峰駝嗅覺(jué)感受器的核苷酸序列、雙峰駝嗅覺(jué)感受器及其應(yīng)用，涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明的主要技術(shù)方案為：一種編碼雙峰駝嗅覺(jué)感受器的核苷酸序列，所述核苷酸序列是序列表中SEQ?ID?NO:1第21-1861位?；蛘?，所述核苷酸序列在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ?ID?NO:1第21-1861位核苷酸序列雜交且編碼雙峰駝嗅覺(jué)感受器。或者，所述核苷酸序列與SEQ?ID?NO:1第21-1861位核苷酸序列具有90％以上同源性且編碼雙峰駝嗅覺(jué)感受器。一種雙峰駝嗅覺(jué)感受器，由如上所述核苷酸序列編碼。優(yōu)選的的雙峰駝嗅覺(jué)感受器由序列表中SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸組成。
【專(zhuān)利說(shuō)明】編碼雙峰駝嗅覺(jué)感受器的核苷酸序列、雙峰駝嗅覺(jué)感受器 及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及編碼雙峰駝嗅覺(jué)感受器的核苷酸序 列、所編碼的雙峰駝嗅覺(jué)感受器及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 脊椎動(dòng)物的嗅覺(jué)感受器（olfactory receptor)通常位于鼻腔內(nèi)由支持細(xì)胞、嗅細(xì) 胞和基細(xì)胞組成的嗅上皮中。在嗅上皮中，嗅覺(jué)細(xì)胞的軸突形成嗅神經(jīng)。嗅束膨大呈球狀， 位于每側(cè)腦半球額葉的下面，嗅神經(jīng)進(jìn)入嗅球，嗅球和端腦是嗅覺(jué)中樞。
[0003] 被稱(chēng)作"沙漠之舟"的駱駝在缺水的沙漠中，駱駝的身體構(gòu)造及習(xí)性跟沙漠生活有 密切的關(guān)系，除了駱駝的身體很高、脖子長(zhǎng)，在沙漠里看得很遠(yuǎn)可以找到水源外，另外一個(gè) 很重要的原因在于駱駝的嗅覺(jué)相當(dāng)靈敏，如順風(fēng)駱駝可嗅到數(shù)公里甚至幾十公里以外的氣 味，判斷出很遠(yuǎn)地方的水源。沙漠里的旅行隊(duì)往往靠駱駝的嗅覺(jué)去找水。
[0004] 由于人能夠識(shí)別和記憶約1萬(wàn)種不同的氣味，所以嗅覺(jué)一直被人們研究。2004年 諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主RichardAxel和Linda B. Buck在他們發(fā)表的基礎(chǔ)性論文中闡 明了嗅覺(jué)系統(tǒng)的工作原理。研究表明他們發(fā)現(xiàn)了含約1，〇〇〇個(gè)不同基因的一個(gè)氣味受體基 因大家族（占我們基因總數(shù)的3% )，這些基因構(gòu)成了相同數(shù)量的嗅覺(jué)受體類(lèi)型，而這些受 體位于嗅覺(jué)受體細(xì)胞內(nèi)。每一種嗅覺(jué)受體細(xì)胞只擁有一種類(lèi)型的氣味受體，每一種受體能 探測(cè)到有限數(shù)量的氣味物質(zhì)。嗅覺(jué)受體對(duì)某幾種氣味是高度特異性的。盡管氣味受體只有 約1000種，但它們可以產(chǎn)生大量組合，從而形成大量的氣味識(shí)別模式，這也是人類(lèi)和動(dòng)物 能夠辨別和記憶不同氣味的基礎(chǔ)。嗅覺(jué)系統(tǒng)工作時(shí)，嗅覺(jué)受體細(xì)胞會(huì)發(fā)出神經(jīng)纖維信息到 嗅小球，那里大約有2000多個(gè)確定的微區(qū)嗅小球，嗅小球的數(shù)量大約是嗅覺(jué)受體細(xì)胞類(lèi)型 數(shù)量的兩倍之多。嗅小球可以攜帶同種受體的受體細(xì)胞聚集其神經(jīng)纖維進(jìn)入相同的嗅小 球，即來(lái)自具有相同受體的細(xì)胞的信息會(huì)聚到同一嗅小球。隨后嗅小球激活僧帽細(xì)胞的神 經(jīng)細(xì)胞。每種僧帽細(xì)胞只能由一個(gè)嗅小球激活，信息流的"特異性"也就因而保留。僧帽細(xì) 胞然后將信號(hào)傳輸?shù)酱竽X其他地方。結(jié)果，來(lái)自多種氣味受體的信息整合成每種氣味所具 有的"特征性的模式"，使得我們可以自由地感受到識(shí)別的氣味。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明實(shí)施例提供編碼雙峰駝嗅覺(jué)感受器的核苷酸序列，即提供雙峰 駝嗅覺(jué)感受器基因的cDNA序列，以及由該序列編碼的雙峰駝嗅覺(jué)感受器。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：
[0007] -方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種編碼雙峰駝嗅覺(jué)感受器的核苷酸序列，其特征 在于，所述核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO: 1第21-1861位。
[0008] 或者，所述核苷酸序列在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO: 1第21-1861位核苷酸序列 雜交且編碼雙峰駝嗅覺(jué)感受器。
[0009] 或者，所述核苷酸序列與SEQ ID NO: 1第21-1861位核苷酸序列具有90%以上同 源性且編碼雙峰駝嗅覺(jué)感受器。
[0010] 另一方面，本發(fā)明實(shí)施例還提供一種雙峰駝嗅覺(jué)感受器，由如上所述核苷酸序列 編碼。
[0011] 優(yōu)選的的雙峰駝嗅覺(jué)感受器由序列表中SEQ ID N0:2所示的氨基酸組成。
[0012] 或者雙峰駝嗅覺(jué)感受器為序列表中SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾 個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加獲得的衍生蛋白質(zhì)。
[0013] 另一方面，本發(fā)明實(shí)施例還提供一種重組表達(dá)載體，其特征在于，包含如上所述核 苷酸序列，或編碼如上所述蛋白質(zhì)。
[0014] 另一方面，本發(fā)明實(shí)施例還提供一種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞含有如 上所述的重組表達(dá)載體。
[0015] 另一方面，本發(fā)明實(shí)施例還提供一種獲取編碼雙峰駝嗅覺(jué)感受器的核苷酸序列的 方法，其特征在于 ：
[0016] PCR的正向引物為：
[0017] SEQ ID N0:3:5' -ATGGAGCCAGAACCTGGGGCCAA-3' ；反向引物為：
[0018] SEQ ID N0:4:5,-CATTGGCCCCAGGTTCTGGCTCC-3，。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：
[0020] 由于駱駝同其他動(dòng)物相比有較強(qiáng)的嗅覺(jué)能力，可以在順風(fēng)的情況下嗅到數(shù)公里甚 至幾十公里以外的氣味，判斷出很遠(yuǎn)地方的水源。適應(yīng)沙漠中缺水的環(huán)境，這與駱駝的嗅 覺(jué)感受器有很重要的關(guān)系，所以駱駝嗅覺(jué)感受器的研究有非常重要的意義。本發(fā)明參考了 其他八種動(dòng)物的嗅覺(jué)感受器的基因序列，克隆并測(cè)序得到了雙峰駝嗅覺(jué)感受器基因的cDNA 序列，并對(duì)八種物種嗅覺(jué)感受器基因的CDS序列進(jìn)行同源性比較并制作出進(jìn)化樹(shù)，為今后 研究雙峰駝嗅覺(jué)感受器提供基礎(chǔ)資料。
[0021] 本發(fā)明中的雙峰駝的嗅覺(jué)感受器序列及進(jìn)化樹(shù)可以直觀(guān)的表現(xiàn)出雙峰駝嗅覺(jué)感 受器與其他物種此蛋白序列的差異，為以后研究雙峰駝嗅覺(jué)細(xì)胞中嗅覺(jué)受體類(lèi)型提供實(shí)驗(yàn) 數(shù)據(jù)，同時(shí)對(duì)研究雙峰駝及其他物種以及人類(lèi)氣味的特異性及氣味識(shí)別的研究提供一定的 理論依據(jù)，可以促進(jìn)生理學(xué)及仿生學(xué)的發(fā)展。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1為實(shí)施例1中雙峰駝嗅覺(jué)感受器基因 RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0023] 圖2為構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)所用嗅覺(jué)感受器氨基酸同源性比較；
[0024] 圖3為不同物種嗅覺(jué)感受器氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述，但不作為對(duì)本發(fā)明的限定。
[0026] 以下實(shí)施例中，所用百分比濃度如未特定指明，均為體積百分比濃度。
[0027] 實(shí)施例1 :雙峰駝嗅覺(jué)感受器基因 cDNA序列的克隆
[0028] 1、組織分離（Isolation)
[0029] 從內(nèi)蒙古阿拉善盟采得雙峰駝，快速屠宰并取肝臟樣，將組織樣迅速放入液氮中 冷凍后于_70°C保存，拿回實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備提取組織總RNA。
[0030] 2.總 RNA 的分離（Total RNA isolation)
[0031] (1)提取RNA的準(zhǔn)備工作
[0032] 玻璃制品用0. 1M的NaOH浸泡過(guò)夜，用自來(lái)水反復(fù)沖洗，再用蒸餾水沖洗2遍， 180°C烘烤4小時(shí)。
[0033] 勻漿器、電泳槽用3%的雙氧水浸泡20-30分鐘，再用0. 1%的DEPC(焦碳酸二乙 酯）水沖洗，由于未滅活的DEPC對(duì)PCR反應(yīng)有影響，可用0. 5 %的SDS (十二烷基硫酸鈉） 處理。
[0034] Tip頭、EP管用0. 1 %的DEPC水浸泡過(guò)夜，高壓滅菌使DEPC失活。
[0035] 雙蒸水和溶液用DEPC處理，即每100ml水或溶液加0. lmlDEPC液，室溫放置過(guò)夜， 高壓滅菌30分鐘DEPC失活。
[0036] (2)組織總RNA提取
[0037] 取 100mg在液氮中凍存的組織樣放入有 lml Trizol (trizal reagent, invitrogen BRL，USA)的勻漿器管中勻漿。4°C 12000g離心10分鐘，吸取上清液，15-30°C溫育5分鐘， 加0. 2ml氯仿，蓋上蓋子，用手劇烈震蕩15秒，15-30°C溫育2-3分鐘，4°C 12000g離心15 分鐘。吸取上清液，加0. 8ml異丙醇，混合均勻。15-30°C溫育10分鐘，4°C 12000g離心10 分鐘，離心管底部白色沉淀即為RNA。倒掉上清，加 lml 75v/v%乙醇洗滌RNA，4°C 7500g離 心10分鐘，自然干燥或真空干燥RNA。溶于水（RNase free)中分裝，-70°C保存。
[0038] (3)組織總RNA的鑒定
[0039] 通過(guò)分光光度計(jì)上測(cè)定RNA含量并且用瓊脂糖電泳分析RNA的質(zhì)量，具體方法如 下：電泳槽用RNA清洗液（100mM NaOH，ImM EDTA)浸泡4 一 5小時(shí)，再用DEPC處理過(guò)的水反 復(fù)沖洗數(shù)次后倒入1 X TBE待用，瓊脂糖凝膠用1 X TBE配制。在10ul上樣緩沖液（2 X TBE， 13%菲可，0. 1%溴酚蘭，7M尿素）中加入lul以上組織總RNA，65°C變性10分鐘后立即放 入冰水中2 - 3分鐘，點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠中電泳。
[0040] 3.全長(zhǎng) cDNA 的克?。–loning of Full-length cDNA)
[0041] ⑴引物設(shè)計(jì)及合成
[0042] 根據(jù) GenBanK 發(fā)表的人（Accession No:AAF37318. 1)、鼠 （Accession N〇:AAL61049. 1)、牛（Accession N〇:XP_002695781. 1)等物種的嗅覺(jué)感受器基因 mRNA序列 0RF側(cè)翼同源序列，設(shè)計(jì)如下引物用于PCR擴(kuò)增，以獲得雙峰駝嗅覺(jué)感受器基因 cDNA序列。 引物用Primer Premier 5.0自行設(shè)計(jì)，由上海桑尼生物科技有限公司合成，該引物對(duì)的核 苷酸序列分別為SEQ ID N0:3(正向）和SEQ ID N0:4(反向），序列信息如下：
[0043] SEQ ID N0:3(正向）：5, -ATGGAGCCAGAACCTGGGGCCAA-3'
[0044] SEQ ID N0:4(反向）：5, -CATTGGCCCCAGGTTCTGGCTCC-3'
[0045] (2) RT-PCR 擴(kuò)增
[0046] 按大連寶生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒（BcaBEST RNA PCR Kit Ver. 1. 1)要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液組成：l〇ul 2XBca 1st Buffer，4ul 25Mm MgS04，lul dNTP Mixture，0.5ul Rnase Inhibitor(40U/ul),lul BcaBEST Polymerase(22U/ul),lul Oligo dT Primer,lul RNA Sample，1.5ul Rnase Free dH20,總體系為 20 ul。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：65°C1 分鐘，30°C5 分鐘（15分鐘-30分鐘內(nèi)勻速升溫），65°C 25分鐘，98°C 5分鐘，5°C 5分鐘。PCR擴(kuò)增條件： 97°C變性5分鐘；95°C 30秒一55°C 30秒一72°C 1分鐘，如此進(jìn)行30次循環(huán)；72°C延伸10 分鐘，4 °C保存。
[0047] (3)克隆和測(cè)序
[0048] PCR擴(kuò)增片段的回收。片段回收按上海華舜小量膠回收試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，操作過(guò) 程如下：盡可能小的割下含DNA的瓊脂糖塊，放入1. 5mlEP管中。按每100mg瓊脂糖加入 300ulSl液的比例加 S1液，50°C水浴10分鐘。將溶化的瓊脂糖液移入吸附柱，lOOOOg離心 1分鐘，倒掉管中液體。在吸附柱中加入500ul W1液，10000g離心15秒。倒掉管中液體， 在吸附柱中加入500ul W1液，靜置1分鐘后，10000g離心15秒，倒掉管中液體。離心1分 鐘，將吸附柱放入一個(gè)干凈的1. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入30ulTl液，靜置1分鐘后， 10000g離心1分鐘，EP管中液體即為回收的DNA。
[0049] 回收片段同T載體的連接。連接用TaKaRa pMD18-T Vector試劑盒，操作過(guò)程 如下：在 EP 管中制備下列連接反應(yīng)液：pMD 18-T Vector(50ng/ul)0.5ul，DNA 20-40ng， Solution 15ul，加 dH20至10ul。將上述反應(yīng)液在16°C反應(yīng)30分鐘（過(guò)夜也可以），產(chǎn)物 用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。
[0050] 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。從_70°C冰箱中取出保存的感受態(tài)細(xì)胞，冰浴助溶。100ul感受態(tài)細(xì) 胞加入10ul連接產(chǎn)物，冰浴30分鐘。42°C水浴熱應(yīng)激90秒鐘，立即置入冰浴中2分鐘。加 400ul液體LB培養(yǎng)基，37°C復(fù)活50分鐘。取100ul鋪于LB平板上，平板含0. 1 % (V/V)的 氨節(jié)青霉Amp (100mg/ml)，37°C恒溫培養(yǎng)10-15小時(shí)。
[0051] 轉(zhuǎn)化菌落的PCR鑒定與培養(yǎng)。用記號(hào)筆標(biāo)記轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的單菌落，用滅菌的牙簽蘸 取單菌落。將牙簽頭放入在加有PCR反應(yīng)液（不含模板）的EP管中晃動(dòng)，使單菌落充當(dāng)模 板。用獲得該片段的PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物同Marker-起進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（結(jié) 果如附圖1所示），鑒別T載體上是否含有目的片段，若得到目的片段，可用滅菌槍頭挑取在 平板上的與之對(duì)應(yīng)的單菌落，放入40ml LB液體培養(yǎng)基中，先在液體中加入0.1% (V/V)的 青霉素鈉（l〇〇mg/ml)，37°C過(guò)夜搖菌培養(yǎng)，用于質(zhì)?；厥?。
[0052] 質(zhì)粒的回收。質(zhì)?；厥沼蒙虾ＨA舜小量質(zhì)粒抽提純化試劑盒，操作步驟如下：將轉(zhuǎn) 化培養(yǎng)的菌液加入1. 5mlEP管中，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心，倒掉液體獲細(xì)菌沉淀。細(xì)菌沉淀不 夠時(shí)可再加一次菌液離心。在細(xì)菌沉淀中加入250ulPl液，振蕩懸浮。加入250ulP2液，溫 和搖勻，室溫靜置4分鐘。加入350ulP3液，溫和搖勻。離心10分鐘，將上清液小心移入吸 附柱，離心15秒，倒掉液體。在吸附柱中加入500ulWl，離心15秒，倒掉液體。在吸附柱中 加入500ulWl，靜置1分鐘，離心15秒，倒掉液體。離心1分鐘，將吸附柱放入一個(gè)干凈的 1. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入25-30ulTl液，靜置1分鐘后，離心1分鐘，EP管中液體即 為回收的質(zhì)粒。
[0053] 質(zhì)粒的酶切鑒定。為了證明回收質(zhì)粒確為插入目的片段的重組質(zhì)粒，采用雙酶切 法鑒定。本研究具體操作如下：根據(jù)TaKaRa pMD18-T Vector圖，選擇內(nèi)切酶Bam Η I和 Hin dill，保證目的片段中無(wú)這兩種酶的切點(diǎn)。組成如下酶切反應(yīng)體系：Bam Η I lul，Hin dIIIlul，10XK Buffer 2ul，DNA 彡 lul，加 dH20 至 20ul。30°C反應(yīng) 3 小時(shí)，瓊脂糖凝膠電 泳檢測(cè)。
[0054] 重組質(zhì)粒的測(cè)序。取20ul重組質(zhì)粒于EP管中，封口膜密封，交生物技術(shù)公司測(cè)序。
[0055] 雙峰駝嗅覺(jué)感受器基因編碼序列同源性比較和系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)構(gòu)建
[0056] 1、雙峰駝嗅覺(jué)感受器的序列信息與生物信息學(xué)分析
[0057] 本發(fā)明新的雙峰駝嗅覺(jué)感受器⑶S的長(zhǎng)度為873bp，詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ ID N0:1，其 中27-29位為起始密碼子ATG，900-902位為終止密碼子TGA，27-902位為編碼蛋白質(zhì)區(qū)域 (CDS)。根據(jù)全長(zhǎng)CDS推導(dǎo)出雙峰駝嗅覺(jué)感受器的氨基酸序列，共291個(gè)氨基酸殘基，詳見(jiàn) SEQ ID N0:2,在線(xiàn)預(yù)測(cè)（ http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html)結(jié)果顯不，其分子 量為31738. 41道爾頓，等電點(diǎn)（pi)為8. 36。
[0058] 2、嗅覺(jué)感受器基因編碼序列系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)構(gòu)建
[0059] 在GenBank上搜索并獲得人、鼠等八種物種的八條嗅覺(jué)感受器基因的編碼蛋白序 列，加上本發(fā)明獲得的SEQ ID N0. 2序列，利用分子生物學(xué)軟件MEGA4構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹(shù) (見(jiàn)附圖3)。結(jié)果顯示：雙峰駝嗅覺(jué)感受器基因同鼠、馬、狗、大熊貓的進(jìn)化距離相對(duì)最近， 且與鴨嘴獸的進(jìn)化距離最遠(yuǎn)。
[0060] 雙峰能和人、鼠、牛等動(dòng)物用Clustal X中對(duì)齊的嗅覺(jué)感受器基因編碼氣基酸序列 同源性比較結(jié)果見(jiàn)附圖2。不同物種嗅覺(jué)感受器氨基酸序列相似性見(jiàn)表1，各物種嗅覺(jué)感受 器氨基酸的個(gè)數(shù)及分子量見(jiàn)表2,各物種嗅覺(jué)感受器氨基酸的比例（％)見(jiàn)表3。
[0061] 表1 :不同物種嗅覺(jué)感受器氨基酸序列相似性
[0062]

【權(quán)利要求】
1. 一種編碼雙峰駝嗅覺(jué)感受器的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列是序列表 中 SEQ ID NO: 1 第 21-1861 位。
2. -種編碼雙峰駝嗅覺(jué)感受器的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列在高嚴(yán)謹(jǐn) 條件下與權(quán)利要求1所述的核苷酸序列雜交且編碼雙峰駝嗅覺(jué)感受器。
3. -種編碼雙峰駝嗅覺(jué)感受器的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列與權(quán)利要 求1所述的核苷酸序列具有90%以上同源性且編碼雙峰駝嗅覺(jué)感受器。
4. 一種雙峰駝嗅覺(jué)感受器，由權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述核苷酸序列編碼。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的雙峰駝嗅覺(jué)感受器，其特征在于，由序列表中SEQ ID N0:2所 示的氨基酸組成。
6. -種雙峰駝嗅覺(jué)感受器，其特征在于，為序列表中SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列經(jīng) 過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加獲得的衍生蛋白質(zhì)。
7. -種重組表達(dá)載體，其特征在于，包含權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述核苷酸序列，或編碼 權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述蛋白質(zhì)。
8. -種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞含有權(quán)利要求7所述的重組表達(dá)載體。
9. 獲取編碼雙峰駝嗅覺(jué)感受器的核苷酸序列的方法，其特征在于： PCR的正向引物為： SEQ ID N0:3:5' -ATGGAGCCAGAACCTGGGGCCAA-3' ； 反向引物為： SEQ ID N0:4:5' -CATTGGCCCCAGGTTCTGGCTCC-3'。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104152458SQ201410410611
【公開(kāi)日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年8月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月19日
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