一株適合高糖面團(tuán)發(fā)酵的面包酵母菌株及其構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種適合高糖面團(tuán)發(fā)酵的面包酵母菌株及其構(gòu)建方法。本發(fā)明提供的面包酵母菌株通過敲除出發(fā)菌株中的蔗糖酶編碼基因SUC2來獲得。所述面包酵母菌株，高糖面團(tuán)發(fā)酵能力較親本菌株明顯提高，高糖面團(tuán)發(fā)酵2h?CO2產(chǎn)生量為925mL，與親本菌株相比，發(fā)酵力提高了16.35％，發(fā)酵時(shí)間縮短12min，解決了甜面包制作過程中的技術(shù)障礙和質(zhì)量缺陷，并且選育得到的面包酵母菌種對發(fā)酵設(shè)備及條件沒有任何特殊要求，一般工廠的設(shè)備和條件均可使用，因而具有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說明】一株適合高糖面團(tuán)發(fā)酵的面包酵母菌株及其構(gòu)建方法

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及工業(yè)微生物的育種，特別是一株適合高糖面 團(tuán)發(fā)酵的面包酵母菌株及其構(gòu)建方法。

【背景技術(shù)】：
[0002] 面包酵母是面包生產(chǎn)過程中重要的微生物發(fā)酵劑和疏松劑，同時(shí)也是一種生物營 養(yǎng)劑，可以增加面團(tuán)的營養(yǎng)成分。通常情況下，面包酵母被分成兩類：一類用于不加糖或 糖含量在7%以下的面團(tuán)中，為低糖面包酵母；另一類用于高糖面團(tuán)發(fā)酵中，為高糖面包酵 母。高糖面包酵母主要用于甜面包的制作過程中，甜面包在我國習(xí)慣上稱為點(diǎn)心面包，其 入口香甜而松軟，面包內(nèi)質(zhì)和外觀均質(zhì)地細(xì)膩、組織均勻，形狀上花色品種繁多，外觀漂亮 誘人，給人以美得享受，特別是各種包餡的甜面包更是風(fēng)格迥異，能滿足不同消費(fèi)者的飲食 需求。但是，甜面包的制作，除添加面粉、酵母、鹽和水外，還需加入大量的蔗糖（用量高達(dá) 15%?30%)，此時(shí)普通面包酵母的發(fā)酵速度就不可避免地受到抑制。一般工業(yè)制作上，為 了解決這個(gè)問題，通常采用加大酵母用量的方法，這無疑會(huì)帶來一定的負(fù)面影響，如面包酵 母味較重，生產(chǎn)成本較高等。因此為了保持面包的風(fēng)味、降低甜面包的制作成本，研究面包 酵母對高糖的耐受性具有重要的實(shí)際指導(dǎo)意義。
[0003] 高糖面團(tuán)中主要可發(fā)酵性碳源是蔗糖，其含量可高達(dá)25%，由于SUC基因家族的 存在，使得酵母可以在以蔗糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長。但是，在高糖面團(tuán)中，蔗糖酶sue 基因家族水解蔗糖的速度比酵母利用己糖的速度快300多倍，致使細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)大量積 累由蔗糖酶水解但未被利用的己糖，進(jìn)而導(dǎo)致酵母周圍環(huán)境形成較高的滲透壓，直接影響 細(xì)胞的活性，同時(shí)過量的葡萄糖積累會(huì)引起葡萄糖效應(yīng)，從而抑制酵母的生長速度和發(fā)酵 性能，出現(xiàn)面團(tuán)產(chǎn)氣量低、發(fā)酵速度緩慢等現(xiàn)象。因此，為了減輕滲透壓的抑制作用以及葡 萄糖效應(yīng)，可以通過降低蔗糖轉(zhuǎn)換酶活力來實(shí)現(xiàn)，從而提高面包酵母高糖環(huán)境下的耐受性。
[0004] 作為sue基因家族的一員，蔗糖轉(zhuǎn)換酶基因（SUC2)位于酵母的第IX條染色體的末 端，全長2. 7kb，SUC2基因可以編碼兩種不同形式的蔗糖轉(zhuǎn)換酶：一種存在于胞內(nèi)的非糖基 化形式的轉(zhuǎn)換酶；另一種是分泌型的糖基化形式的轉(zhuǎn)換酶。在蔗糖轉(zhuǎn)換酶的作用下蔗糖水 解生成D-葡萄糖和D-果糖，隨后葡萄糖和果糖進(jìn)入糖酵解途徑以供酵母利用。
[0005] 然而，目前對于面包酵母菌株中蔗糖轉(zhuǎn)換酶基因 SUC2的研究報(bào)道很少，尤其是在 選育適合高糖面團(tuán)發(fā)酵的面包酵母菌株的研究更是空白，因此，本發(fā)明通過缺失面包酵母 菌株中蔗糖轉(zhuǎn)換酶基因 SUC2來選育適合高糖面團(tuán)發(fā)酵的面包酵母菌株，可以提高酵母菌 株在高糖面團(tuán)中的發(fā)酵力，同時(shí)滿足了甜面包制作過程中對酵母的較高要求。


【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0006] 本發(fā)明所解決的技術(shù)問題之一是提供一株適合高糖面團(tuán)發(fā)酵的面包酵母菌株。
[0007] 所述面包酵母，是通過敲除酵母出發(fā)菌株中編碼蔗糖轉(zhuǎn)換酶的SUC2基因全序列 來獲得。
[0008] 所述SUC2基因其Gene ID為：854644,核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1所示。
[0009] 優(yōu)選的，所述酵母出發(fā)菌株為面包酵母（Saccharomyces cerevisiae)CICC32253。
[0010] 本發(fā)明所解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一株適合高糖面團(tuán)發(fā)酵的面包酵母菌株 的構(gòu)建方法，包括如下步驟：
[0011] (1)將含有SUC2基因的上、下游序列的DNA分子及標(biāo)記基因 KanMX插入質(zhì)粒中，得 到重組質(zhì)粒；
[0012] (2)以重組質(zhì)粒為模板擴(kuò)增出含有SUC2基因的上、下游序列的DNA分子及標(biāo)記基 因 KanMX的重組片段，將重組片段轉(zhuǎn)化入出發(fā)菌株的a型和α型單倍體菌株中，得到重組 后的基因工程單倍體菌株；
[0013] (3)將pGAPza質(zhì)粒導(dǎo)入所述重組后的基因工程單倍體菌株中，純化并融合后得到 所述基因工程菌。
[0014] 具體如下：
[0015] (1)重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0016] ①以面包酵母CICC32253總DNA為模板，PCR擴(kuò)增出SUC2基因的上、下游序列；
[0017] ②以含有Amp抗性的穿梭質(zhì)粒pUC6為模板，PCR擴(kuò)增出KanMX抗性基因；
[0018] ③將步驟（1)-①和（1)-②獲得的PCR產(chǎn)物依次連接到含有Amp抗性的pUC19質(zhì) 粒載體上，獲得重組質(zhì)粒；
[0019] (2)SUC2基因的敲除
[0020] ①以步驟⑴中的重組質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增出含有SUC2基因的上、下游序列的DNA 分子及標(biāo)記基因 KanMX的重組片段；
[0021] ②用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將（2)_①中的重組片段轉(zhuǎn)化入出發(fā)菌株的a型和α型菌株 中，得到重組后的基因工程單倍體菌株；
[0022] (3) KanMX抗性基因的去除
[0023] ①利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將pGAPza質(zhì)粒轉(zhuǎn)入步驟（2)_②中的基因工程單倍體菌株 中，
[0024] ②用Zeocin抗性平板篩選轉(zhuǎn)化子，挑選在YEH)平板上生長而在G418平板上不生 長的基因工程單倍體菌株；
[0025] (4) pGAPza 質(zhì)粒丟失
[0026] 將步驟（3)-②中挑選的a型和α型基因工程單倍體菌株于YEH)液體培養(yǎng)基中 進(jìn)行傳代培養(yǎng)，選取第一代及第十代以后各培養(yǎng)物提取酵母質(zhì)粒并以此為模板，用引物進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證pGAPza質(zhì)粒是否丟失。
[0027] (5)獲得基因工程菌
[0028] 將步驟（4)中驗(yàn)證得到的pGAPza質(zhì)粒丟失的a型和α型單倍體酵母突變株經(jīng)純 化后進(jìn)行融合，篩選雙倍體即得到所述基因工程菌。
[0029] 所述面包酵母（Saccharomyces cerevisiae) CICC32253,是一株保存于中國工業(yè) 微生物菌種保藏中心的菌株，公眾可通過購買獲得。
[0030] 所述重組菌株可通過上述方法構(gòu)建獲得，這些方法已有許多文獻(xiàn)報(bào)道，如Jos印h Sambrook等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版，科學(xué)出版社，1995。也可用本領(lǐng)域已知的其它方 法來構(gòu)建基因突變的酵母菌株。
[0031] 這種通過敲除基因獲得的菌株不易產(chǎn)生回復(fù)突變，菌株的穩(wěn)定性比利用點(diǎn)突變、 誘變等方法構(gòu)建的菌株穩(wěn)定性更高，更有利于工業(yè)化應(yīng)用。
[0032] 本發(fā)明同時(shí)提供了一種專門用于鑒定所述適合高糖面團(tuán)發(fā)酵的面包酵母菌株的 基因序列，該基因序列是以所述適合高糖面團(tuán)發(fā)酵的面包酵母菌株基因組為模板擴(kuò)增的特 異性片段，其序列如序列表SEQ ID N0:2所示。
[0033] 本發(fā)明所述面包酵母菌株在其它發(fā)酵性能不受影響的情況下，高糖面團(tuán)中具有 較好發(fā)酵性能，與親本菌株相比，在高糖面團(tuán)發(fā)酵時(shí)2小時(shí)產(chǎn)氣增加130mL，發(fā)酵時(shí)間縮短 12min，鹿糖酶酶活降低了 40.95%。
[0034] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果：
[0035] 1、本發(fā)明選育的面包酵母菌株所敲除的蔗糖酶編碼基因?yàn)?00%缺失，不易產(chǎn)生 回復(fù)突變，并且重組菌株中的KanMX抗性基因已經(jīng)敲除，保證了菌株及發(fā)酵產(chǎn)品的安全性；
[0036] 2、本發(fā)明選育的適合高糖面團(tuán)發(fā)酵的面包酵母菌株是通過降低蔗糖轉(zhuǎn)換酶酶活， 降低了高糖面團(tuán)發(fā)酵時(shí)的滲透壓抑制和葡萄糖效應(yīng)，能夠加速高糖面團(tuán)的發(fā)酵速度，而其 它發(fā)酵性能沒有明顯變化，對促進(jìn)我國甜面包的的推廣應(yīng)用具有重要意義。
[0037] 3、本發(fā)明所述的適合高糖面團(tuán)發(fā)酵的面包酵母菌株是通過缺失蔗糖轉(zhuǎn)換酶編碼 基因 SUC2獲得，為SUC2基因的應(yīng)用研究開辟了新的領(lǐng)域。
[0038] 4、篩選得到的工程菌株對發(fā)酵設(shè)備及條件沒有特殊要求，一般工廠的設(shè)備和條件 均可使用，因而具有廣泛的市場應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0039] 圖1為重組菌株BS-1構(gòu)建的技術(shù)路線圖
[0040] 圖2為pUC-AKB質(zhì)粒構(gòu)建過程
[0041] 圖3為pUC-AKB重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證圖
[0042] a中Μ為DNA maker泳道1為BamHI和PstI雙酶切pUC-B質(zhì)粒
[0043] 泳道2為BamHI和PstI雙酶切pUC-19質(zhì)粒泳道3為BamHI和PstI雙酶切SB片 段
[0044] b中Μ為DNA maker泳道1為EcoRI和ΚρηΙ雙酶切pUC-B質(zhì)粒
[0045] 泳道2為EcoRI-ΚρηΙ雙酶切SA片段泳道3為EcoRI和ΚρηΙ雙酶切pUC-AB質(zhì)粒
[0046] c中Μ為DNA maker泳道1為ΚρηΙ和BamHI雙酶切KanMX片段
[0047] 泳道2為ΚρηΙ和BamHI pUC-AB質(zhì)粒泳道3為ΚρηΙ和BamHI雙酶切pUC-AKB質(zhì) 粒
[0048] 圖4為基因盒SA-KanMX-SB片段與酵母基因組重組過程
[0049] 圖5重組單倍體驗(yàn)證圖
[0050] 其中 Μ 為 DNA Marker ;
[0051] 泳道1為以單倍體親本基因組為模板，Y-U和Y-K-D為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物；
[0052] 泳道2為以重組單倍體基因組為模板，Y-U和Y-K-D為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物；
[0053] 泳道3為以單倍體親本基因組為模板，Y-K-U和Y-D為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物；
[0054] 泳道4為以重組單倍體基因組為模板，Y-K-U和Y-D為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物；
[0055] 圖6KanMX抗性基因剔除PCR驗(yàn)證
[0056] 其中 Μ 為 DNA Marker ;
[0057] 泳道1為以重組菌株單倍體基因組為模板，K1和K2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物；
[0058] 泳道2為以去除KanMX抗性基因的重組菌株單倍體基因組為模板，K1和K2為引 物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物；
[0059] 圖7pGAPza質(zhì)粒丟失PCR驗(yàn)證
[0060] 其中 Μ 為 DNA Marker ;
[0061] 泳道1為以去除KanMX抗性基因的重組單倍體菌株的第一代酵母質(zhì)粒為模板，Ζ-υ 和Z-D為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物；
[0062] 泳道2為以去除KanMX抗性基因的重組單倍體菌株的第十代酵母質(zhì)粒為模板，Z-U 和Z-D為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物；

【具體實(shí)施方式】：
[0063] 下面通過具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明的一株適合高糖面團(tuán)發(fā)酵的面包酵母菌株 及其構(gòu)建方法。下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
[0064] 實(shí)施例1 :適合高糖面團(tuán)發(fā)酵的面包酵母菌株的構(gòu)建 [0065] 重組菌株的構(gòu)建流程如圖1所示。
[0066] 雙倍體出發(fā)菌株CICC32253經(jīng)過單倍體化生成a型和α型單倍體菌株70a和 24 α，通過兩次同源重組的方法構(gòu)建重組單倍體菌株，去除KanMX抗性基因并雜交該單倍 體菌株，生成雙倍體重組菌株BS-1。
[0067] (1)重組質(zhì)粒pUC-AKB的構(gòu)建
[0068] 重組質(zhì)粒pUC-AKB的構(gòu)建流程如圖2所示.
[0069] ①以酵母出發(fā)菌株CICC32253總DNA為模板，PCR擴(kuò)增出SUC2基因的下游序列 SB ；
[0070] 上游引物 SB 1 :CGGGATCCACCCACAATCGTAATGTAGTTGC(SEQ ID NO:3)
[0071] 下游引物 SB2 :AACTGCAGTCCATTATTGTTTTTCCGCCTTCTG(SEQ ID NO:4)
[0072] 劃線部分為酶切位點(diǎn)；
[0073] PCR 反應(yīng)條件：95°C 5min ;94°C 45s ;58°C lmin ;72°C 30s，30 個(gè)循環(huán)；72°C lOmin， 0. 8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0074] PCR 反應(yīng)體系（20 μ L)
[0075]

【權(quán)利要求】
1. 一株適合高糖面團(tuán)發(fā)酵的面包酵母菌株，是對酵母出發(fā)菌株進(jìn)行基因工程改造所 得，其特征在于，所述基因工程改造為敲除酵母出發(fā)菌株中編碼蔗糖轉(zhuǎn)換酶的SUC2基因全 序列。
2. 如權(quán)利要求1所述的一株適合高糖面團(tuán)發(fā)酵的面包酵母菌株，其特征在于，所述出 發(fā)菌株為面包酵母（Saccharomyces cerevisiae)CICC32253。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的一株適合高糖面團(tuán)發(fā)酵的面包酵母菌株，其特征在于，所述 SUC2基因其Gene ID為：854644,核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示。
4. 一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述的面包酵母菌株的方法，包括如下步驟： (1) 將含有SUC2基因的上、下游序列的DNA分子及標(biāo)記基因 KanMX插入質(zhì)粒中，得到重 組質(zhì)粒； (2) 以重組質(zhì)粒為模板擴(kuò)增出含有SUC2基因的上、下游序列的DNA分子及標(biāo)記基因 KanMX的重組片段，將重組片段轉(zhuǎn)化入出發(fā)菌株的a型和α型單倍體菌株中，得到重組后的 基因工程單倍體菌株； (3) 將pGAPza質(zhì)粒導(dǎo)入所述重組后的基因工程單倍體菌株中，純化并融合后得到所述 基因工程菌。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種面包酵母菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，所述出發(fā)菌株 為面包酵母（Saccharomyces cerevisiae)CICC32253。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的一種面包酵母菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步 驟： (1) 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 ① 以面包酵母CICC32253總DNA為模板，PCR擴(kuò)增出SUC2基因的上、下游序列； ② 以含有Amp抗性的穿梭質(zhì)粒pUC6為模板，PCR擴(kuò)增出KanMX抗性基因； ③ 將步驟（1)-①和（1)-②獲得的PCR產(chǎn)物依次連接到質(zhì)粒載體上，獲得重組質(zhì)粒； (2) SUC2基因的敲除 ① 以步驟（1)中獲得的重組質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增出含有SUC2基因的上、下游序列的DNA 分子及標(biāo)記基因 KanMX的重組片段； ② 用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將（2)_①中的重組片段轉(zhuǎn)化入出發(fā)菌株的a型和α型菌株中，得 到重組后的基因工程單倍體菌株； (3) KanMX抗性基因的去除 ① 利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將pGAPza質(zhì)粒轉(zhuǎn)入步驟（2)-②中的基因工程單倍體菌株中； ② 用Zeocin抗性平板篩選轉(zhuǎn)化子，挑選在YEH)平板上生長而在G418平板上不生長的 基因工程單倍體菌株； (4) pGAPza質(zhì)粒丟失 將步驟（3)_②中挑選的a型和α型基因工程單倍體菌株于YEH)液體培養(yǎng)基中進(jìn)行 傳代培養(yǎng)，選取第一代及第十代以后各培養(yǎng)物提取酵母質(zhì)粒并以此為模板，用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，驗(yàn)證pGAPza質(zhì)粒是否丟失； (5) 獲得基因工程菌 將步驟（4)中驗(yàn)證得到的pGAPza質(zhì)粒丟失的a型和α型單倍體酵母突變株經(jīng)純化后 進(jìn)行融合，篩選雙倍體即得到所述基因工程菌。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的一種面包酵母菌株的構(gòu)建方法，其特征在于：用于構(gòu)建 所述重組質(zhì)粒的載體為含有Amp抗性的pUC19質(zhì)粒。
8. 權(quán)利要求1或2所述的一株適合高糖面團(tuán)發(fā)酵的面包酵母菌株在面包發(fā)酵中的應(yīng) 用。
9. 一種檢測如權(quán)利要求1所述面包酵母菌株的方法，其特征在于，以重組菌株的總DNA 為模板，通過引物對： 上游引物：5' -GGCTTAGCATCCACACGTCAC-3' 下游引物：5' -CTATCACGGTGTCCATGTAAGAGG-3' 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可獲得一條長度為1585bp的特異性條帶，所述特異性條帶核苷酸序列 如序列表SEQ ID N0:2所示。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK104152363SQ201410413539
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月21日
【發(fā)明者】張翠英, 肖冬光, 封冰, 董健, 杜麗萍, 陳葉福 申請人:天津科技大學(xué)